專利名稱：建立草地早熟禾高頻再生體系的方法
技術領域：
本發明為一種建立草地早熟禾高頻再生體系的方法，屬于細胞工程中的植物組織培養，建立了3個草地早熟禾品種的高頻再生體系，可用于農桿菌和基因槍介導的遺傳轉化。
背景技術：
草地早熟禾(Poa pratensis L.)是禾本科早熟禾屬的一種優質冷季型草坪草，采用基因工程對草地早熟禾進行品種改良、新品種選育已經成為當前草地早熟禾生物技術領域研究的重點。草地早熟禾基因轉化的受體系統主要來源于組織培養途徑，作為基因轉化的受體系統，要求具有很強的再生能力、較高的遺傳穩定性、穩定的外植體來源、對選擇性抗生素敏感、對農桿菌侵染要有敏感性等。因此，建立高效的再生體系一直是草地早熟禾育種學家追尋的目標。草地早熟禾組織培養開始于80年代，之后，不同的草地早熟禾組培再生體系相繼建立起來，但是還存在再生頻率較低、維持愈傷胚性困難等不足。本專利從不同外植體來源、激素水平、基因型、繼代時間等因素上研究了草地早熟禾再生體系，建立3個草地早熟禾品種的相對穩定的高頻再生體系，為下一步遺傳轉化工作提供基礎材料。而且，在這些再生體系的基礎了，進行了遺傳轉化，獲得了轉3種外源基因的草地早熟禾轉基因植株，證明了這3個再生體系的實用性。
發明內容
本發明建立了三個草地早熟禾品種的高頻再生體系，能夠應用于懸浮培養、農桿菌與基因槍轉化等過程中。主要包括1)對比成熟種子與胚軸作為外植體進行愈傷組織誘導，兩者獲得的胚性愈傷結構均較好、且增殖較快，考慮到操作的簡便性，采取成熟種子作為外植體。
2)對草地早熟禾進行消毒處理方式比較，證明采用磁力攪拌器攪拌消毒40-60分鐘，蒸餾水洗凈后直接接種效果最佳。
3)選擇干燥、易碎、顆粒狀的愈傷組織進行繼代培養，能夠保持愈傷的胚性，其再生頻率不會下降。
4)采用正交設計與單因素方差分析對愈傷組織誘導與再生使用的培養基進行研究。得到合適于Baron品種的最適愈傷組織誘導培養基為MS+2，4-D(1mg/L)+6-BA(0.1mg/L)+CuSO4(3mg/L)+酸水解酪蛋白CH(1g/L)，胚性愈傷誘導率為23.75％，最適再生培養基為AK2MS+KT(0.2mg/L)+6-BA(1mg/L)，分化頻率為53.33％；適合于Midnight品種最適愈傷組織誘導培養基為MS+2，4-D(2mg/L)+6-BA(0mg/L)+CuSO4(3mg/L)+CH(1g/L)，胚性愈傷誘導率為10％，最適分化培養基為AL2MS++6-BA(1mg/L)+LH(0.5g/L)，分化頻率為56.67％；適合于Mardona品種的愈傷組織誘導培養基為2mg/L 2，4-D+0.2mg/L 6-BA+3mg/L CuSO4+1g/L CH為愈傷組織誘導的最適培養基，胚性愈傷誘導率為31.67％，最適分化培養基為KBNMS+KT(0.2mg/L)+6-BA(1mg/L)+NAA(0.5mg/L)，分化頻率為40％以上。同時，建議把胚性愈傷誘導率作為愈傷組織誘導效率的評價指標。
5)獲得的再生植株在有很強的分蘗能力，再生2個月是適合移栽的時期，移栽到花盆中的再生苗能夠100％成活，在田間能夠正常擴繁生長。
四
圖1干燥、易碎的第一類愈傷組織(被稱為胚性愈傷組織)；圖2柔軟、水質的第二類愈傷組織；圖3草地早熟禾再生植株；圖4草地早熟禾生根；圖5移栽到花盆的再生苗；圖6再生苗移栽以2個月移栽效果最好(左圖為再生2個月，右圖為再生一個月)；圖7再生苗移栽到田間生長旺盛(均Mardona品種為例)
五具體實施例方式
1.材料與方法1.1試驗材料草地早熟禾‘Mardona’品種，來自丹麥丹農種子公司，‘Midnight’品種，來自美國Turf-seed Inc公司，‘Baron’品種，來自荷蘭百綠集團。
1.2外植體的獲得采用成熟種子與胚軸作為外植體，胚軸來源于剛萌發的種子。成熟種子浸入70％酒精30秒，無菌水沖洗2-3次，25％次氯酸鈉溶液消毒40分鐘-1小時(依消毒狀態而定)，無菌水清洗5-6次。
1.3培養基培養基為MS基本培養基，附加不同量的植物激素、30g/L蔗糖、8g/L瓊脂，pH值5.8。愈傷組織誘導與繼代使用相同的培養基。愈傷組織分化和生根使用相同的培養基。
1.4培養方法無菌種子接種入誘導愈傷培養基中，28℃無菌黑暗條件誘導愈傷，約9天對種子進行拔芽處理，促進愈傷組織形成，記錄發芽率，20天后繼代到新鮮的相同培養基中。繼代2次后，統計出愈率和胚性愈傷誘導率，進行結果分析。愈傷組織分化與生根條件為16h光照，8h黑暗，光照度2000Lx，溫度均為25±1℃。
2.結果與分析2.1不同外植體誘導愈傷的影響采用成熟種子與長1cm的胚軸愈傷組織誘導培養基中誘導愈傷，結果見表1。
表1 胚軸誘導愈傷與種子誘導比較
由表1可見，成熟種子作為外植體誘導愈傷的出愈率與胚性愈傷誘導率均較胚軸高，兩者獲得的胚性愈傷結構均很好、且增殖較快，考慮到操作的簡便性，采取成熟種子作為外植體。
2.2外植體消毒方式對誘導愈傷影響種子消毒后，采用兩種不同的處理方式1直接接種；2滅菌蒸餾水中4攝氏度浸泡3天后接種，結果見表2。在種子消毒過程中采用磁力攪拌器攪拌消毒與手動消毒2種方式，結果見表3。
表2 不同接種方式對愈傷誘導影響
浸泡種子按種后，種子4天便可發芽，而直接接種，種子則5天才可發芽。雖然浸泡可以使種子提前發育，但是并沒有使出愈率增加，反而使出愈率降低了4.7個百分點。所以采用直接接種的方法較好。
表3 種子消毒方式對愈傷誘導影響
由表3可以看出，采用磁力攪拌消毒么能大大提高愈傷組織出愈率，所以，采用磁力攪拌消毒處理種子。
2.3愈傷質量與年齡對植株再生影響由成熟種子誘導的愈傷組織在顯微鏡下觀察可見典型的兩種類型(附圖1，2)，第一種類型中的愈傷生長迅速，呈顆粒狀結構，形狀有球形、心形，有些呈現體細胞胚發育的早期形態，而第二種愈傷組織為水狀、生長緩慢，顏色暗淡，分化只能形成毛狀根，不能形成植株。選擇第一種愈傷組織進行繼代培養，培養不同時間長短的愈傷組織進行分化再生實驗，結果見表4。
表4 不同年齡愈傷分化情況比較
從總體(表4)上看，在8個月內，草地早熟禾愈傷沒有因為繼代次數增多而胚性下降，對于草地早熟禾而言，采用誘導出的胚性愈傷或者繼代產生的胚性愈傷繼代，能夠保持胚性。
2.4三種草地早熟禾品種再生體系建立2.4.1愈傷組織誘導培養基確定愈傷組織誘導在MS基本培養基基礎上，考慮4個因素，每個因素設4個水平，采用L16(45)正交表進行，具體因素與水平見表5，愈傷組織誘導結果見表6。
表5 正交試驗表頭設計
表6 愈傷誘導情況統計
對所得百分率的結果進行反正弦轉換，并進行數據處理與分析，獲得了三個品種的最適愈傷組織誘導培養基(表7)。只有胚性愈傷才能正常再生，對再生體系建立作用較大，所以，用胚性愈傷誘導率作為評價指標較為合理。最終以胚性愈傷誘導率確定為最適合的愈傷組織誘導培養基。
表7 三個品種草地早熟禾愈傷組織誘導正交設計結果
各因素影響程度為 各因素影響程度為A＞B＞D＝C，最適合的 A＞D＞C＞B，最適合的Midnight(Md)組合為A3B3C2D4組合為A3B1C2D4。
對Baron、Midnight品種進行正交設計結果的驗證，驗證用的培養基見表8，驗證結果見表9。
表8 驗證用的培養基成分
表9 不同培養基的誘導情況
注不同字母表示差異顯著(P＜O.05)由表9可以看出，適合Baron品種的最適誘導培養基為P2，胚性愈傷誘導率為23.75％，適合Midnight品種的最適誘導培養基為P5，胚性愈傷誘導率為10％。
2.4.2最適愈傷組織分化培養基確定對于Mardona品種，愈傷組織分化培養基在MS基本培養基基礎上，考慮4個因素、每個因素3個水平，采用L9(34)正交表進行，具體因素與水平見表10，結果見表11。對于Baron、Midnight品種，采用單因素實驗設計，具體的方法與結果見表12。
表10 愈傷組織分化正交試驗表頭設計
表11 愈傷組織分化正交設計實施結果因素與水平處理均值
對所得百分率的結果進行反正弦轉換，并進行數據處理與分析，得到最適合于Mardona品種分化培養基為MS+KT(0.2mg/L)+6-BA(1mg/L)+LH(0g/L)+NAA(0.5mg/L)。
表12 Baron、Midnight品種單因素再生實驗結果
由表12可以看出，Baron品種的最適再生培養基為AK2MS+KT(0.2mg/L)+6-BA(1mg/L)，Midnight的最適分化培養基為AL2MS++6-BA(1mg/L)+LH(0.5g/L)。
2.5再生植株的移栽愈傷組織在再生培養基中分化1個月后(附圖3)，轉入相同的培養基生根和壯苗(附圖4)，轉入花盆中(附圖5)，一般再生2個月后移栽效果最佳(附圖6)。這些移栽苗，轉入田間能保持旺盛生長(附圖7)。
3.該再生體系應用實例采用基因槍轉化法，轟擊由此再生體系培養出的胚性愈傷組織，經過繼代與分化培養，獲得了Baron品種轉DREB1A、BADH-CMO、CMO三種外源基因的轉基因植株(表13)。其轉化頻率依次為3.59％、3.92％與1.94％。是一次成功的運用實例。
表13 Baron品種轉基因數目
權利要求
1建立草地早熟禾高頻再生體系的方法，其技術體系包括1)外植體的選擇以及消毒；2)胚性愈傷誘導與鑒定方法；3)不同時間長短的愈傷再生能力比較；4)正交設計和單因素設計在再生體系中的應用；5)組培苗移栽合適時期的選擇與田間移栽
2.按照權利要求1所述，建立草地早熟禾高頻再生體系的方法，其特征在于，選擇成熟種子作為外植體誘導愈傷組織，消毒時運用磁力攪拌消毒，蒸餾水洗凈后直接接種為宜。
3.按照權利要求1所述，建立草地早熟禾高頻再生體系的方法，其特征在于，選擇易碎、干燥的胚性愈傷進行繼代培養，在8個月內能夠保持其再生能力。
4.按照權利要求1所述，建立草地早熟禾高頻再生體系的方法，其特征在于，正交設計與單因素實驗設計，是草地早熟禾組織培養過程中可靠的研究方法。運用這2種實驗設計的方法，建立了三種草地早熟禾品種的高頻再生體系。
5.按照權利要求1所述，建立草地早熟禾高頻再生體系的方法，其特征在于，再生2個月的組培苗，移栽到花盆中能夠100％成活，在田間生長健壯。
6.按照權利要求1所述，建立草地早熟禾高頻再生體系的方法，其特征在于，運用Baron品種高頻再生體系進行了基因槍介導法遺傳轉化，獲得了轉DREB1A、BADH-CMO、CMO基因的轉化植株。其轉化頻率依次為3.59％、3.92％與1.94％。
全文摘要
本專利對草地早熟禾Baron、Mardona、Midnight品種進行了組織培養研究，表明選擇成熟種子作為外植體誘導愈傷組織，消毒時運用磁力攪拌消毒，蒸餾水洗凈后直接接種為宜；選擇易碎、干燥的胚性愈傷進行繼代培養，在8個月內能夠保持其再生能力；再生2個月的組培苗，移栽到花盆中能夠100％成活，在田間生長健壯；運用正交設計與單因素實驗設計的方法，建立了三種草地早熟禾品種的高頻再生體系，胚性愈傷誘導率高達31.67％，愈傷組織分化率高達56.67％。運用其中Baron品種的再生體系進行基因槍轉化，獲得了轉DREB1A、BADH－CMO、CMO基因的轉化植株。
文檔編號A01H4/00GK1698423SQ20051008547
公開日2005年11月23日 申請日期2005年7月21日 優先權日2005年7月21日
發明者韓烈保, 信金娜, 曾會明, 劉君, 李雪 申請人:北京林業大學, 韓烈保, 信金娜