專利名稱：一種半夏脫毒組培快繁的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物脫毒組培快繁技術，尤其涉及一種半夏脫毒組培快繁的方法。
背景技術：
半夏為天南星科多年生草本植物，多為野生，由于藥用和出口需要量大，野生資源枯竭而難以滿足需求，現(xiàn)已開始進行人工栽培。人工栽培一般采用小塊莖和珠芽作為繁殖器官，但繁殖系數(shù)低，年繁殖系數(shù)只有2～3倍；同時在栽培和生產中，由于長期無性繁殖導致病毒感染和不斷積累，使其產量和藥用成分均下降，致使半夏的栽培生產受到很大限制，研究表明，病毒感染的半夏實際生產能力只有脫病毒半夏的30～40％。因此為了提高半夏的繁殖系數(shù)，適應大規(guī)模種植的需要和減低病毒對品質的危害，對半夏進行脫毒組培快繁研究具有重要的價值。
組培與脫毒苗生產的關鍵是脫毒技術，獲得無病毒植株的方法有多種，例如熱處理脫毒、莖尖培養(yǎng)脫毒和莖尖微嫁接脫毒以及組合方法。普遍采用的較好的方法是莖尖培養(yǎng)脫毒法，具體的步驟是通過植物頂端分生組織切取莖尖(0.2mm以下分生組織)，誘導愈傷組織，然后從愈傷組織再分化產生芽，長成小植株得到脫毒苗是目前通常采用的方法。相關的技術已有許多的專利。例如，CN1031637A、CN1238122A、CN1258435A、CN1258436A披露了采用莖尖作為外植體，經莖尖培養(yǎng)后得到脫毒苗的方法。CN1475107A發(fā)明名稱為“半夏規(guī)?；M培快繁方法”公開了在無菌條件下用解剖針剝取試管苗的莖尖(0.3～0.6mm)采用常規(guī)方法進行培養(yǎng)，獲得大量脫毒組培苗。
但是這種莖尖分生組織脫毒法存在的問題是要切取很小的莖尖分生組織，需在顯微鏡下操作，具有一定難度；切取莖尖組織越小，成活率越低，而切取莖尖組織偏大，又不能完全脫除病毒，同時容易造成污染；因此，仍需要一種更好的脫毒方法。
發(fā)明內容
本發(fā)明目的是克服以上存在不足，提出一種無需切取微小植物莖尖，即能大量快繁半夏脫毒組培苗的方法。
本發(fā)明目的通過以下技術方案來實現(xiàn)一種半夏脫毒組培快繁的方法，按如下步驟進行1)外植體的選取與滅菌取半夏的種子，經滅菌處理，作為脫毒組培用的外植體；2)誘導培養(yǎng)將步驟1)種子接種在誘導培養(yǎng)基上，直接形成無根組培苗或先形成愈傷組織，再將愈傷組織移植至分化培養(yǎng)基誘導出叢芽，形成無根組培苗、珠芽和小塊根；3)增殖培養(yǎng)將步驟2)無根組培苗、珠芽和小塊根接種在增殖培養(yǎng)基上，誘導出叢芽，形成無根組培苗、珠芽和小塊根；4)生根培養(yǎng)將步驟3)無根組培苗、珠芽和小塊根接種在生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)；5)移栽當步驟4)組培苗生長至3～5cm以上、珠芽0.2～0.5cm以上，小塊根直徑0.5～1.0cm以上，移栽基質培養(yǎng)至成苗；
6)病毒檢測利用RT-PCR擴增技術，構建其基因組序列克隆，原核表達制備病毒特異性的抗血清，建立ELISA檢測技術進行半夏大豆花葉病毒、芋花葉病毒、馬蹄蓮花葉病毒的檢測。
所述的半夏的種子是未成熟種子和/或成熟種子；其中，半夏的未成熟種子于5月中、下旬采種，總苞片、果皮、種子為綠色；半夏的成熟種子于6月下旬、7月上旬采種，當總苞片發(fā)黃，果皮發(fā)白綠色，種子淺茶色、茶綠色，易脫落時摘回。
所述的滅菌處理經75％酒精浸泡0.5～1.0min，再用0.1％升汞溶液滅菌20～30min，或用2％的次氯酸鈉水溶液滅菌20～30min，最后用無菌水沖洗3～5次。
所述的培養(yǎng)基，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含重量為1)基本培養(yǎng)基選用MS基本培養(yǎng)基，蔗糖或白糖為的20～30g/L，瓊脂為7～9g/L，pH為5.6～5.8；2)誘導培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5～2.0mg/L+NAA 0.1～0.5mg/L或IBA 0.1～0.5mg/L；3)愈傷組織分化培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0～3.0mg/L+NAA 0.1～0.5mg/L或IBA0.1～0.5mg/L；4)增殖培養(yǎng)基MS+6-BA 0.2～1.0mg/L+NAA 0.1～0.5mg/L或IBA 0.1～0.5mg/L；5)生根培養(yǎng)基1/2MS或1/2MS+NAA 0.1mg/L或1/2MS+IBA 0.1mg/L。
所述的培養(yǎng)基進一步可改進為，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含重量是1)基本培養(yǎng)基選用MS基本培養(yǎng)基，白糖為的30g/L，瓊脂為7g/L，pH為5.8；2)誘導培養(yǎng)基MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.15mg/L；3)愈傷組織分化培養(yǎng)基MS+6-BA 2.5mg/L+NAA 0.2mg/L；4)增殖培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L；5)生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA 0.1mg/L。
所述的移栽基質是泥炭∶珍珠巖∶蛭石按體積比3∶1∶1配制而成。
本發(fā)明的有益效果是1)本發(fā)明利用半夏種子作為脫毒組培的外植體，由于體積較大接種操作容易；接種污染率只有5％左右或更低，而莖尖培養(yǎng)接種大多數(shù)情況下污染率約40％～80％；接種成功率高可達100％，而莖尖培養(yǎng)接種成活率一般只有20％～40％；可比莖尖脫毒培養(yǎng)提早1～2個月獲得脫毒組培苗，降低了成本30％，實用易推廣；2)本發(fā)明脫毒簡便、快捷，解決了莖尖脫毒不徹底的問題，將脫毒組培苗、脫毒珠芽和脫毒小塊根經病毒檢測后，帶毒率均為0(見試驗例)，可解決病毒引起半夏種質退化問題，恢復其產量和品質；3)半夏種子留種容易，可快速獲得大量脫毒組培苗、脫毒珠芽和脫毒小塊根，月繁殖系數(shù)達5～10倍，適合工廠化育苗，可商品化生產。
具體實施例方式
通過以下實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，但本發(fā)明的內容并不局限于此。
實施例1(以半夏未成熟種子為外植體)1)外植體的選取與滅菌于5月中、下旬，總苞片、果皮、種子為綠色時，取半夏的未成熟種子，經75％酒精浸泡0.5～1.0min，再用0.1％升汞溶液滅菌20min，最后用無菌水沖洗3～5次，作為脫毒組培用的外植體；2)基本培養(yǎng)基選用MS基本培養(yǎng)基，白糖25g/L，瓊脂8g/L，pH5.6；3)誘導培養(yǎng)在無菌條件下將種子接種在MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L的誘導培養(yǎng)基上，先形成愈傷組織，再將愈傷組織移植至MS+6-BA 3.0mg/L+NAA0.3mg/L的分化培養(yǎng)基上誘導出叢芽，形成無根組培苗、珠芽和小塊根；4)增殖培養(yǎng)在無菌條件下將無根組培苗、珠芽和小塊根接種在MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L的增殖培養(yǎng)基上，誘導叢芽，形成無根組培苗、珠芽和小塊根；5)生根培養(yǎng)將無根組培苗、珠芽和小塊根接種到1/2MS的生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)；6)移栽當脫毒組培苗生長達3～5cm以上、脫毒珠芽長到0.2～0.5cm以上，脫毒小塊根長到0.5～1.0cm以上，移栽入由泥炭∶珍珠巖∶蛭石按體積比3∶1∶1配制而成的基質中；7)病毒檢測利用RT-PCR擴增技術，構建其基因組序列克隆，原核表達制備病毒特異性的抗血清，建立ELISA檢測技術進行半夏大豆花葉病毒、芋花葉病毒、馬蹄蓮花葉病毒的檢測。
實施例2(以半夏的成熟種子為外植體)1)外植體的選取與滅菌于6月下旬、7月上旬，當總苞片發(fā)黃，果皮發(fā)白綠色，種子淺茶色、茶綠色，易脫落時，取半夏的成熟種子經75％酒精浸泡0.5～1.0min，再用2％的次氯酸鈉水溶液滅菌30min，最后用無菌水沖洗3～5次，作為脫毒組培用的外植體；2)基本培養(yǎng)基選用MS基本培養(yǎng)基，白糖20g/L，瓊脂9g/L，pH5.7；3)誘導培養(yǎng)在無菌條件下將種子接種在MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.1mg/L的誘導培養(yǎng)基上，直接形成無根組培苗，再形成珠芽和小塊根；4)增殖培養(yǎng)再在無菌條件下將無根組培苗、珠芽和小塊根接種在MS+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L的增殖培養(yǎng)基上，誘導叢芽，形成無根組培苗、珠芽和小塊根；5)生根培養(yǎng)將無根組培苗、珠芽和小塊根接種到1/2MS+NAA 0.1mg/L的生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)；6)移栽當組培苗生長達3～5cm以上、珠芽長到0.2～0.5cm以上，小塊根長到0.5～1.0cm以上，移栽入由泥炭∶珍珠巖∶蛭石按體積比3∶1∶1配制而成的基質中；7)病毒檢測利用RT-PCR擴增技術，構建其基因組序列克隆，原核表達制備病毒特異性的抗血清，建立ELISA檢測技術進行半夏大豆花葉病毒、芋花葉病毒、馬蹄蓮花葉病毒的檢測。
實施例3(以半夏的未成熟種子為外植體)1)外植體的選取與滅菌于5月中、下旬，總苞片、果皮、種子為綠色時，取半夏的未成熟種子，經75％酒精浸泡0.5～1.0min，再用0.1％升汞溶液滅菌20min，最后用無菌水沖洗3～5次，作為脫毒組培用的外植體；2)基本培養(yǎng)基選用MS基本培養(yǎng)基，白糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.8；3)誘導培養(yǎng)在無菌條件下將種子接種在MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.15mg/L的誘導培養(yǎng)基上，通過誘導形成愈傷組織，然后愈傷組織接種在MS+6-BA2.5mg/L+NAA 0.2mg/L的愈傷組織分化培養(yǎng)基上，誘導叢芽，形成無根組培苗、珠芽和小塊根；4)增殖培養(yǎng)在無菌條件下將無根組培苗、珠芽和小塊根接種在MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L的增殖培養(yǎng)基上，誘導叢芽，形成無根組培苗、珠芽和小塊根；5)生根培養(yǎng)將無根組培苗、珠芽和小塊根接種到1/2MS+IBA 0.1mg/L的生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)；6)移栽當組培苗生長達3～5cm以上、珠芽長到0.2～0.5cm以上，小塊根長到0.5～1.0cm以上，移栽入由泥炭∶珍珠巖∶蛭石按體積比3∶1∶1配制而成的基質中；7)病毒檢測利用RT-PCR擴增技術，構建其基因組序列克隆，原核表達制備病毒特異性的抗血清，建立ELISA檢測技術進行半夏大豆花葉病毒、芋花葉病毒、馬蹄蓮花葉病毒的檢測。
試驗例(病毒檢測)對照材料從田間采集的半夏小塊根為材料。
處理材料以實施例1獲得的小塊根為材料。
1)抗血清制備a)根據已報道的芋花葉病毒(Dasheen mosaic virus DsMV)、大豆花葉病毒半夏株系(Soybean mosaic virus P strain，SMV-P)和馬蹄蓮花葉病毒(mosaic virus，ZaMV)已發(fā)表的序列設計相關病毒外殼蛋白表達引物；b)擴增相關病毒外殼蛋白基因并構建原核表達質粒，在大腸桿菌中表達；c)將目的蛋白與2×SDS上樣緩沖液按1∶1(v/v)混合，煮沸變性后用12％的SDS聚丙烯凝膠電泳分離，電泳完畢后用0.25M KCl溶液染色；
d)切下的目的蛋白條帶用適量1×SDS上樣緩沖液勻漿后，再用5-20％梯度的SDS聚丙烯凝膠電泳分離，電泳完畢后用0.25M KCl溶液染色；e)切下目的蛋白條帶免疫小鼠，共免疫4次，前3次間隔7天，第4次免疫3天后斷頭取血。
2)ELISA檢測技術a)包被稱取病樣和健康對照各0.2g，分別加入包被液(0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH 9.6)各1mL研磨，6000rpm離心后包被96孔板，每孔100uL，4℃，12h；b)封閉加封閉液，每孔150uL，37℃孵育1h；c)加一抗加入適當稀釋的抗血清(ELISA緩沖液稀釋)，37℃孵育2h；d)加酶標二抗加入1/5000的羊抗鼠IgG-堿性磷酸酶(Sigma，ELISA緩沖液稀釋)，37℃孵育2h；e)加底物1mg/mL的p-NPP(Sigma，溶于10％二乙醇胺，pH 9.8)，37℃黑暗中孵育，分別在40min、1h和2h測OD405值。
3)檢測的結果等如下表所示。
權利要求
1.一種半夏脫毒組培快繁的方法，其特征在于按以下步驟進行1)外植體的選取與滅菌取半夏的種子，經滅菌處理，作為脫毒組培用的外植體；2)誘導培養(yǎng)將步驟1)種子接種在誘導培養(yǎng)基上，直接形成無根組培苗或先形成愈傷組織，再將愈傷組織移植至分化培養(yǎng)基誘導出叢芽，形成無根組培苗、珠芽和小塊根；3)增殖培養(yǎng)將步驟2)無根組培苗、珠芽和小塊根接種在增殖培養(yǎng)基上，誘導出叢芽，形成無根組培苗、珠芽和小塊根；4)生根培養(yǎng)將步驟3)無根組培苗、珠芽和小塊根接種在生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)；5)移栽當步驟4)組培苗生長至3～5cm以上、珠芽0.2～0.5cm以上，小塊根直徑0.5～1.0cm以上，移栽基質培養(yǎng)至成苗。
2.根據權利要求1所述的半夏脫毒組培快繁的方法，其特征在于所述的半夏的種子是未成熟種子和/或成熟種子。
3.根據權利要求1所述的半夏脫毒組培快繁的方法，其特征在于所述的滅菌處理是經75％酒精浸泡0.5～1.0min，再用0.1％升汞溶液滅菌20～30min，或用2％的次氯酸鈉水溶液滅菌20～30min，最后用無菌水沖洗3～5次。
4.根據權利要求1所述的半夏脫毒組培快繁的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含重量為1)基本培養(yǎng)基選用MS培養(yǎng)基，蔗糖或白糖20～30g/L，瓊脂7～9g/L，pH5.6～5.8；2)誘導培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5～2.0mg/L+NAA 0.1～0.5mg/L或IBA 0.1～0.5mg/L；3)愈傷組織分化培養(yǎng)基MS+6-BA1.0～3.0mg/L+NAA 0.1～0.5mg/L或IBA0.1～0.5mg/L；4)增殖培養(yǎng)基MS+6-BA0.2～1.0mg/L+NAA 0.1～0.5mg/L或IBA 0.1～0.5mg/L；5)生根培養(yǎng)基1/2MS或1/2MS+NAA0.1mg/L或1/2MS+IBA 0.1mg/L。
5.根據權利要求1或4所述的半夏脫毒組培快繁的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的各組分與每升所含重量為1)基本培養(yǎng)基選用MS基本培養(yǎng)基，白糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.8；2)誘導培養(yǎng)基MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.15mg/L；3)愈傷組織分化培養(yǎng)基MS+6-BA 2.5mg/L+NAA 0.2mg/L；4)增殖培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L；5)生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA 0.1mg/L。
6.根據權利要求1所述的半夏脫毒組培快繁的方法，其特征在于所述的移栽基質由泥炭∶珍珠巖∶蛭石按體積比3∶1∶1配制而成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種半夏脫毒組培快繁的方法，包括如下步驟取半夏的未成熟種子和/或成熟種子為外植體，經誘導培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、移栽、病毒檢測后，大量繁殖脫毒組培苗、脫毒珠芽和脫毒小塊根。本發(fā)明的優(yōu)點是接種操作容易；接種污染率低、成活率高；脫毒簡便、快捷、徹底；繁殖系數(shù)達5～10倍，速度快，適合工廠化育苗，可商品化生產。
文檔編號A01C1/00GK1799342SQ200510062339
公開日2006年7月12日 申請日期2005年12月30日 優(yōu)先權日2005年12月30日
發(fā)明者徐剛, 陳炯, 汪一婷, 牟豪杰, 呂永平, 陳劍平 申請人:浙江省農業(yè)科學院