專利名稱：黑脈羊肚菌菌株的篩選及菌種制備方法
技術領域：
本發明屬微生物技術領域，具體涉及羊肚菌的菌株篩選及菌種制備方法。
背景技術：
羊肚菌Morchella是世界著名的名貴野生食用菌，黑脈羊肚菌Morchellaangusticeps是云南產羊肚菌的主要種類之一。羊肚菌的人工栽培小試偶有成功的報道，但栽培試驗的重復性差，至今尚不能進行商業化栽培，市場上的羊肚菌均來自野生。近年來野生羊肚菌由于過度采集和采集方式不科學以及無相應的技術措施，造成自然產量大幅下降。研究表明，在產區自然環境條件下，采用人工菌種和配套的技術措施，是解決羊肚菌供需矛盾的最經濟有效的途徑之一。
在羊肚菌保護擴繁技術中，優良菌種的獲得是關鍵技術環節。羊肚菌菌株的獲得通常是利用子實體或孢子進行分離、純化，直接應用于羊肚菌的栽培或菌絲體生產。現有技術的不足在于羊肚菌菌種不能用出菇的方法進行菌種鑒定，只能根據菌絲形態及分離物來初步確定是否為羊肚菌純培養物；生產的菌種一般用固體菌種。目前在國內采用液體菌種進行羊肚菌資源的保護擴繁應用不廣泛。
發明內容
本發明的主要目的就是克服現有技術不足，利用云南原產地黑脈羊肚菌子實體篩選出優良菌株，采用生物技術進行菌種鑒定，制備羊肚菌液體及固體優良菌種，為羊肚菌野生資源保護擴繁提供優良菌種。
本發明采用的真菌是黑脈羊肚菌Morchella angusticeps M39；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國.北京.中關村；保藏日期2005年08月11日；保藏登記入冊的編號CGMCCNO.1436。
黑脈羊肚菌子實體中等大，高6～12cm。子囊果呈錐形或近圓柱形，頂端尖，淡褐色至蛋殼色，棱紋黑色，縱向排列，由橫脈交織，邊緣與菌柄連接在一起。菌柄近圓柱形，乳白色，上部稍有顆粒，基部往往有凹槽。子囊近圓柱形，子囊孢子8個，單行排列。菌絲生長初期緊貼培養基，無色，有光澤，隨著菌落的增大，有叉狀或樹枝狀分支，后期產生菌核及色素。
本發明的技術方案①采集野生羊肚菌子實體；②組織分離或孢子分離；③純化菌株及菌株鑒定；④生物學特性比較及生產性狀比較；⑤確定優良菌株；⑥菌種生產及菌種應用；經過反復篩選，獲得菌絲體產量高、抗污染的羊肚菌液體菌種專用菌株M39。
本發明真菌Morchella angusticeps培養方法(以下為重量百分比)菌種分離純化培養基2％羊肚菌下腳料、0.001％VB1、2％葡萄糖、2％瓊脂；羊肚菌菌株分離及鑒定方法1、將羊肚菌子實體組織塊或孢子液接種到上述試管瓊脂培養基斜面上，于18-24℃下培養5-10天，對分離培養的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得羊肚菌分離試管種。
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養基的平板培養皿上進行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養基斜面上，于18-24℃下培養5-7天，獲得羊肚菌純化試管種。
3、采用供試子實體與對應菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進行PCR擴增及ITS序列測定，通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的黑脈羊肚菌(Morchella.angusticeps)Identities＝499/510(97％)，Gaps＝2/510(0％)，分析確定分離得到的純培養物為黑脈羊肚菌菌絲體。
本發明羊肚菌菌種的制備方法分為液體培養和固體培養兩種。
液體菌種制備方法液體培養基配方為5-10％麩皮、0.5-1％黃豆粉、0.5-1％麥芽糖、1-2％可溶性淀粉，余下為水，pH自然。
1、將羊肚菌的菌絲體接種到試管瓊脂培養基斜面上，培養基配方為PDA培養基，于18-24℃下培養5-7天，獲得試管菌種。
2、將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養基中，培養基配方為前述液體培養基配方，于20-26℃下搖床培養，轉速為120-160r/min，培養時間5-7天。
3、將搖瓶菌種接種到25L自動發酵生產線的發酵罐中，通氣量為1∶0.8v/(v·min)；攪拌轉速為120-160r/min；接種量為5-10％；罐壓0.04Mpa；pH為6.0；溫度為22-26℃；通氣培養72-96小時，獲得羊肚菌液體菌種。
固體菌種制備方法固體培養基配方為木屑75-90％、麩皮5-20％、磷肥1％、石膏1％、羊肚菌生長地腐殖土3％，含水量60％、pH自然。
1、將羊肚菌的菌絲體接種到試管瓊脂培養基斜面上，培養基配方為PDA培養基，于18-24℃下培養5-7天，獲得試管菌種。
2、將試管種接種到500ml三角瓶(每瓶裝200ml)液體培養基中，培養基配方為前述液體培養基配方，于20-26℃下搖床培養，轉速為120-160r/min，培養時間5-7天。
3、采用前述固體培養基配方。將培養料混合后，加水拌均勻后，裝入750ml的大口瓶中，壓緊封口后在120℃滅菌60分鐘，接入液體菌種，于22-26℃培養15-20天，直到菌絲長滿。
具體實施例方式實施例一1、將黑脈羊肚菌子實體組織塊接種到上述菌種分離純化培養基斜面上，于18℃下培養10天，對分離培養的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得羊肚菌分離試管種。
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養基的平板培養皿上進行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養基斜面上，于18℃下培養7天，獲得羊肚菌純化試管種。
3、采用供試子實體與對應菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進行PCR擴增及ITS序列測定，通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的黑脈羊肚菌(Morchella.angusticeps)Identities＝499/510(97％)，Gaps＝2/510(0％)，分析確定分離得到的純培養物為黑脈羊肚菌菌絲體。
4、將Morchella angusticeps M39的菌絲體接種到試管瓊脂培養基斜面上，培養基配方為PDA培養基，18℃下培養7天，獲得試管種。
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養基中，培養基配方為5％麩皮、0.5％黃豆粉、0.5％麥芽糖、1％可溶性淀粉，余下為水，pH自然。于20℃下搖床培養，轉速為120rpm，培養時間7天，獲得一級液體菌種。
將一級液體菌種接種到25L自動發酵生產線的發酵罐中，通氣量為1∶0.8v/(v·min)；攪拌轉速為120r/min；接種量為5％；罐壓0.04Mpa；pH為6.0；溫度為22℃；通氣培養96小時，獲得羊肚菌液體菌種。
實施例二菌種制備的步驟與實施例一相同。
1、將黑脈羊肚菌子實體組織塊接種到上述菌種分離純化培養基斜面上，于22℃下培養6天，對分離培養的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得羊肚菌分離試管種。
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養基的平板培養皿上進行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養基斜面上，于22℃下培養6天，獲得羊肚菌純化試管種。
3、采用供試子實體與對應菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進行PCR擴增及ITS序列測定，通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的黑脈羊肚菌(Morchella.angusticeps)Identities＝499/510(97％)，Gaps＝2/510(0％)，分析確定分離得到的純培養物為黑脈羊肚菌菌絲體。
4、將Morchella angusticeps M39的菌絲體接種到試管瓊脂培養基斜面上，培養基配方為PDA培養基，22℃下培養6天，獲得試管種。
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養基中，培養基配方為6％麩皮、0.6％黃豆粉、0.6％麥芽糖、1.2％可溶性淀粉，余下為水，pH自然。于22℃下搖床培養，轉速為140rpm，培養時間6天，獲得一級液體菌種。
將一級液體菌種接種到25L自動發酵生產線的發酵罐中，通氣量為1∶0.8v/(v·min)；攪拌轉速為140r/min；接種量為8％；罐壓0.04Mpa；pH為6.0；溫度為24℃；通氣培養84小時，獲得羊肚菌液體菌種。
實施例三1、將黑脈羊肚菌子實體組織塊接種到上述菌種分離純化培養基斜面上，于24℃下培養5天，對分離培養的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得羊肚菌分離試管種。
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養基的平板培養皿上進行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養基斜面上，于24℃下培養5天，獲得羊肚菌純化試管種。
3、采用供試子實體與對應菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進行PCR擴增及ITS序列測定，通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的黑脈羊肚菌(Morchella.angusticeps)Identities＝499/510(97％)，Gaps＝2/510(0％)，分析確定分離得到的純培養物為黑脈羊肚菌菌絲體。
4、將Morchella angusticeps M39的菌絲體接種到試管瓊脂培養基斜面上，培養基配方為PDA培養基，24℃下培養5天，獲得試管種。
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200ml)液體培養基中，培養基配方為10％麩皮、0.5％黃豆粉、0.5％麥芽糖、1％可溶性淀粉，余下為水，pH自然。于26℃下搖床培養，轉速為160rpm，培養時間5天，獲得一級液體菌種。
將一級液體菌種接種到固體培養基上，培養基配方為木屑75％、麩皮20％、磷肥1％、石膏1％、羊肚菌生長地腐殖土3％，含水量60％、pH自然。將木屑、麩皮、磷肥、石膏、腐殖土按比例稱量后混合均勻，加水拌勻后裝入750ml的菌種瓶中，每瓶裝500ml，120℃滅菌60分鐘后，接種后置于26℃培養15天，獲得羊肚菌固體菌種。
實施例四1、將黑脈羊肚菌子實體組織塊接種到上述菌種分離純化培養基斜面上，于24℃下培養5天，對分離培養的試管每天觀察記錄，及時剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得羊肚菌分離試管種。
2、將分離試管種菌絲塊接種到上述瓊脂培養基的平板培養皿上進行菌種純化，2天后取尖端菌絲塊接種在培養基斜面上，于24℃下培養5天，獲得羊肚菌純化試管種。
3、采用供試子實體與對應菌絲分離物，分別按SDS方法提取總DNA，進行PCR擴增及ITS序列測定，通過Blast對比樣品的ITS序列與GENBANK中的黑脈羊肚菌(Morchella.angusticeps)Identities＝499/510(97％)，Gaps＝2/510(0％)，分析確定分離得到的純培養物為黑脈羊肚菌菌絲體。
4、將Morchella angusticeps M39的菌絲體接種到試管瓊脂培養基斜面上，培養基配方為PDA培養基，24℃下培養5天，獲得試管種。
5、將試管種接種到500ml三角瓶中(每瓶裝200m1)液體培養基中，培養基配方為8％麩皮、0.5％黃豆粉、1％麥芽糖、1％可溶性淀粉，余下為水，pH自然。于26℃下搖床培養，轉速為160rpm，培養時間5天，獲得一級液體菌種。
將一級液體菌種接種到固體培養基上，培養基配方為木屑90％、麩皮5％、磷肥1％、石膏1％、羊肚菌生長地腐殖土3％，含水量60％、pH自然。將木屑、麩皮、磷肥、石膏、腐殖土按比例稱量后混合均勻，加水拌勻后裝入750ml的菌種瓶中，每瓶裝500ml，120℃滅菌60分鐘后，接種后置于20℃培養20天，獲得羊肚菌固體菌種。
權利要求
1.一種黑脈羊肚菌菌株，其特征在于所述菌株為(Morchella angusticeps)M39，該菌株的保藏號為CGMCC NO.1436。
2.根據權利要求1所述的黑脈羊肚菌菌株的制備方法，所述菌株是經過常規的液體和固體發酵培養獲得的，其特征在于所述液體和固體發酵培養基配方如下(1)液體培養基配方為5-10％麩皮、0.5-1％黃豆粉、0.5-1％麥芽糖、1-2％可溶性淀粉，余下為水，pH自然；(2)固體培養基配方為木屑75-90％、麩皮5-20％、磷肥1％、石膏1％、羊肚菌生長地腐殖土3％，含水量60％、pH自然。
全文摘要
本發明涉及一種黑脈羊肚菌菌株的篩選及菌種制備方法，屬于微生物技術領域。本發明的菌株Morchella angusticeps M39已于2005年08月11日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.1436。利用該菌株制備的液體及固體優良菌種，應用于羊肚菌野生資源原產地的保護擴繁，提高羊肚菌的自然產量及品質，有著顯著的社會、經濟、生態效益和廣闊的應用前景。
文檔編號A01G1/04GK1793316SQ200510048680
公開日2006年6月28日 申請日期2005年12月8日 優先權日2005年12月8日
發明者桂明英, 劉蓓, 朱萍, 郭永紅 申請人:云南菌苑科技有限公司, 云南省供銷合作社科學研究所