α－三噻吩用于防治松材線蟲病的應(yīng)用的制作方法

專利名稱：α－三噻吩用于防治松材線蟲病的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及α-三噻吩(α-terthienyl，以下簡稱α-T)的用途，尤其是用于防治松材線蟲病的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
松材線蟲病(Bursaphelenchus xylophilus(Steiner & Buhrer)Nickle)又稱松樹萎蔫病，是松樹的一種毀滅性流行病。松材線蟲主要靠松墨天牛進(jìn)行傳播。松材線蟲通過松墨天牛補充營養(yǎng)的傷口進(jìn)入松樹的木質(zhì)部，并寄生在樹脂道中。一般認(rèn)為，這里光線穿透性很差，尤其對于胸徑較大的松樹而言，樹齡較大其表皮也較厚。松材線蟲在大量繁殖的同時移動，逐漸遍及全株，并導(dǎo)致樹脂道薄壁細(xì)胞和上皮細(xì)胞的破壞和死亡，造成植株失水，蒸騰作用降低，樹脂分泌急劇減少和停止。所表現(xiàn)出來的外部癥狀是針葉陸續(xù)變?yōu)辄S褐色乃至紅褐色，萎蔫，最后整株枯死。該病致病力強，寄主死亡速度快；傳播快，且常常猝不及防；一旦發(fā)生，治理難度大。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國自1982年發(fā)生該病后的10年間，發(fā)生面積約達(dá)38000hm2，造成松樹死亡1400000株以上，損失木材50000m3。用于病害的防治經(jīng)費亦達(dá)645萬元。它不僅給國民經(jīng)濟造成巨大損失，也破壞了自然景觀及生態(tài)環(huán)境，更對我國松林資源構(gòu)成嚴(yán)重威脅。
松材線蟲在分類學(xué)上屬線形動物門Nemathelminthes，線蟲綱Nematoda，墊刃目Tylenchida，滑刃科Aphelenchoididae，線蟲由卵發(fā)育為成蟲，其間要經(jīng)過4齡幼蟲期。雌、雄蟲交尾后產(chǎn)卵，雌蟲可保持30天左右的產(chǎn)卵期，1條雌蟲產(chǎn)卵約100粒。在生長最適溫度(25℃)條件下約4天1代。由卵孵化的幼蟲在卯內(nèi)即蛻皮1次，孵出的幼蟲為2齡幼蟲。秋末冬初，病死樹內(nèi)的松材線蟲已逐漸停止增殖，并有自然死亡，同時開始出現(xiàn)另一種類型的3齡幼蟲，稱為分散型3齡蟲，進(jìn)入休眠階段，翌年春季，當(dāng)媒介昆蟲松墨天牛將羽化時，分散型3齡蟲蛻皮后形成分散型4齡蟲，特稱為dauerlarvae(DL)，即休眠幼蟲(耐久型幼蟲)。這個階段的幼蟲即分散型3齡、分散型4齡幼蟲在形態(tài)上及生物學(xué)特性上都與繁殖階段不同，其抵抗不良環(huán)境能力加強，休眠幼蟲適宜昆蟲攜帶傳播。
松墨天牛(Monochamus alternatus Hope)又稱松天?；蛩珊痔炫?，松墨天牛在華東地區(qū)一般為1年1代；廣東1年2-3代，以2代為主，在1年1代的地區(qū)，春天可見松材線蟲分散型3齡蟲明顯地分布在松墨天牛蛀道周圍，并漸漸向蛹室集中。這主要是由于蛹室內(nèi)含有大量的不飽和脂肪酸，如油酸、亞油酸、棕油酸等對線蟲產(chǎn)生趨化活性。當(dāng)松墨天牛即將羽化時，分散型3齡蟲蛻皮形成休眠幼蟲，通過松墨天牛的氣門進(jìn)入氣管，隨天牛羽化離開寄主植物。1只天?？蓴y帶成千上萬條線蟲，當(dāng)松墨天牛補充營養(yǎng)時，大量的休眠幼蟲則從其啃食樹皮所造成的傷口侵入健康樹。在松墨天牛產(chǎn)卵期，少量線蟲也可從產(chǎn)卵時所造成的傷口侵入寄主，休眠幼蟲進(jìn)入樹體后即蛻皮為成蟲進(jìn)入繁殖階段，大約以4天1代的速度大量繁殖，并逐漸擴散到樹干、樹枝及樹根。被松材線蟲侵染了的松樹大抵是松墨天牛產(chǎn)卵的對象。翌年松墨天牛羽化時又會攜帶大量線蟲，并接種到健康樹上，如此循環(huán)，導(dǎo)致松材線蟲的傳播。
雖然早在20世紀(jì)初就有關(guān)于松材線蟲病的記載，但直到進(jìn)入70年代才開始對該病害進(jìn)行較為深入的研究，并取得了一些成果。然而，對松材線蟲引起松樹枯萎的機理至今尚無為大多數(shù)人所接受的解釋，至今也未能找到徹底防治松材線蟲病的藥劑。
防治松褐天牛是控制松線蟲病的重要途徑。但采用天牛噴藥法不能完全消除松材線蟲病。
現(xiàn)有從毒殺松材線蟲角度出發(fā)防治松材線蟲病的藥劑部分列舉如下朱克恭等(朱克恭，姚仕義，張并義克線磷防冶松材線蟲病的研究浙江林業(yè)科技1994，14(1)16-19).進(jìn)行了克線磷對松材病的防冶試驗，結(jié)果表明，克線磷濃度在50×10-6以上時，滅蟲率可達(dá)90％以上；在60×10-6以上時，則可完全抑制線蟲的生長繁殖。林間試驗，也證實其有一定的防治效果。但克線磷在土壤中被吸附的量，樹體內(nèi)有輸導(dǎo)速度以及適宜的施藥方法等問題，還沒有很好的研究和解決，都有待于深入試驗和探討。
另外，阿維菌素也被證實可用于防治松材線蟲病。試驗表明，2％阿維菌素乳油按木材體積為400和600mL/m3(60～90mL/株)的劑量，注入樹干防治黑松和馬尾松上的松材線蟲，持效期可達(dá)兩年，第一年的防治效果為100％，第二年為88％。通過取樣檢查線蟲在樹體內(nèi)的分布證實，阿維菌素可擴散到樹的頂部。大劑量用藥(210mL/株)對黑松生長無影響，藥劑注入樹體內(nèi)對環(huán)境無污染(周明國林茂松2％阿維菌素乳油對松材線蟲的生物活性測定 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報.2001，3，40-44.)。
李周直等(李周直等.數(shù)種農(nóng)藥對松材線蟲病的毒效試驗.森林病蟲通訊.1994(1)23-26)對68％氧樂果原油、40％久效磷乳油、3％呋喃丹顆粒劑、25％滴滴涕乳油、2.5％殺螟硫磷乳油、98％硫酸銅(化學(xué)純)、88％克線磷、5％涕滅威顆粒劑、L1210殺蟲油煙劑及L1210殺菌油煙劑、乳化劑MPE、OP-3及0號柴油進(jìn)行殺線試驗，針對藥劑不同的特性采用藥液注射法、藥液噴霧法、煙霧載藥法、原木噴藥法、天牛噴藥法、松針枝條浸藥法進(jìn)行了殺線的試驗，結(jié)果表明經(jīng)過藥劑注射處理的松林中，松樹枯死率明顯減少，僅為對照死樹的1/7-1/2，但未能全部消除死樹的發(fā)生；硫酸銅對松材線蟲有一定有毒殺作用，但是要注意施藥的濃度，樹徑在20cm左右，藥液濃度1％不會產(chǎn)生藥害，10％濃度就會造成藥害；采用噴施的滴滴涕對減輕松材線蟲病危害具有一定的防治效果，但需多次噴施才好，僅用一次的滴滴涕油乳劑防治效果不明顯；采用噴霧施藥也表明需多次施藥才有效果。
趙博光(趙博光.雙稠哌啶類生物堿分子結(jié)構(gòu)與殺線活性間關(guān)系.林業(yè)科學(xué)1998，34(5)61-68.)對雙稠哌啶類生物堿與殺線活性間關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果表明在苦豆堿、野靛堿、甲基野靛堿、苦參堿中，苦豆堿對松材線蟲殺線活性最好。提出了雙稠哌啶類生物堿對松材線蟲的殺線活性強弱主要受其分子結(jié)構(gòu)中官能團(tuán)對的類型及其中的官能團(tuán)的類型控制的假說。根據(jù)這一假說，推測了具高殺線活性的生物堿的分子結(jié)構(gòu)。使用含苦豆堿的培養(yǎng)基培養(yǎng)灰葡萄孢菌菌絲的生物測定方法，當(dāng)濃度為1×10-4g/ml和2.63×10-5g/ml時，苦豆堿對松材線蟲的殺線活性為LC50＝2.63×10-5g/ml(趙博光，苦豆堿對松材線蟲的殺線活性。林業(yè)科學(xué)，1996，32(3)244～247)。
孫建華(孫建華，土壤真菌培養(yǎng)物對松材線蟲蟲生長和繁殖抑制作用的研究南開大學(xué)學(xué)報1997，30(5)64~69.)從土壤分離的99株真菌以PSM(potato-sucrose-malt extract)培養(yǎng)基培養(yǎng)，檢測其培養(yǎng)物對松材線蟲生長和繁殖的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)18號菌株(經(jīng)鑒定為總狀共頭霉，Syncephatastrum racemosum)顯示了極強的抗線蟲活性，經(jīng)初步分析其活性成分為水溶性的物質(zhì)。李國紅，張克勤(李國紅，張克勤一種新的殺線蟲擔(dān)子菌云南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)2001，23(2)149～152)首次發(fā)現(xiàn)一種具殺線蟲活性的擔(dān)子菌YL14，12h內(nèi)對松材線蟲的致病率達(dá)90％以上。
Cromopton，(Crompton D.Ascariasisad its public healthsignificance.Toylor and Francis，London and Philadelphia，1985243~244)首次在試驗中用抗生素抑制致病細(xì)菌的方法控制了松材線蟲病病狀的發(fā)生。另外趙博光等(趙博光，郭道森，高蓉，郭建細(xì)菌分離物B619與松材線蟲病關(guān)系的初步研究南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報2000，24(4)72-74)對抗生素對松材線蟲病的影響作了研究，結(jié)果證明了通過控制致病細(xì)菌的方法可以控制松材線蟲病。
α-三噻吩(α-T)是近年來人們從一些植物的次生物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的植物源光敏毒素。其分子式為C12H8S3、結(jié)構(gòu)式為 植物源光敏毒素在光照條件下對害蟲的毒殺效果成幾倍、幾十倍甚至上千倍地提高，顯示出光活化的特性。環(huán)境的光照條件，對它的作用效果有巨大的影響。甚至于目標(biāo)物昆蟲的體壁的透光性也對藥效有影響。植物源光活化毒素對人畜低毒、在環(huán)境中能迅速降解并以高效殺蟲活性成為合成殺蟲劑潛在的替代物。已發(fā)現(xiàn)的植物源光敏毒素主要有呋喃香豆素、噻吩類、聚乙炔類、醌類以及由色氨酸衍生的生物堿和異喹啉生物堿等。其中噻吩類化合物是存在于菊科植物中的一類特征性次生物質(zhì)，Heitz等人稱其對多種傳病蚊蟲、線蟲、螨類都具有很好的光活毒殺作用。(Heitz J.R..，Downum K.R.，ACS Symposium Series 339，1987)；(J.R.Heitz，K.R.，Downum Light-activated Pesticides Control，ACS SymposiumSeries 339，1987)；(Hertz et al.，1995 J.R.Heitz，K.R.DownumLight-activated Pesticides Control，ACS Symposium Series 616，1995)。但Heitz等人的上述文獻(xiàn)中是對噻吩類化合物的光活化作用機理做了分析，并提出了上述論點，而沒有對噻吩類具體化合物的殺線蟲研究報道。徐漢虹、趙善歡在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1995.16(1)127-132.及萬樹青、徐漢虹、趙善歡等在第十屆中國農(nóng)藥年會論文集，2000，339-343.中的文章中也引用Heitz等人的上述結(jié)論。產(chǎn)業(yè)中，噻吩類化合物已開始用于田間防治蚊子幼蟲。
α-T最初是從萬壽菊花、葉中分離出的一種光活化毒素。它主要分布集中于菊科植物中的Ambrosia，Hymenatherum，Pectis，Porophyllum等幾個屬中，我國是從1992年開始對此進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)，萬壽菊Tageteserecta、孔雀草Tagetes patula、廣泛分布于我國的雜草鯉腸Ecliptaprostrata和分布于新疆的植物深裂刺頭菊(Cousinia dissecta Kar etKir)中也含有α-T。Yamazaki(1985)、Kagan和Arora(1983)Kagan，J.，and Arora S.K.1983.2.5-Di(2’-thienyl)furan and an imporovedsythesis of alpha-terthienyl.Heterocycles 201941-1943等已在實驗室成功合成α-T，B.J.R.Philogene，J.T.Arnason(1985)(B.J.R.Philogene，J.T.Arnason，et al.Synthesis and Evaluation of the NaturallyOccurring Phototoxin，Alpha-terthienyl，as a Control Agent for Larvae of Aedesintrudens，Aedes atropalpus(DipteraCulicidae)and Simulium verecundum(DipteraSimuliidae).J.Econ.Entomol.79121-126(1985))對Yamazaki的方法進(jìn)行了改進(jìn)，設(shè)計了兩種合成路線。一種是以2，2-二噻吩和2-溴噻吩為反應(yīng)物，以銅粉為催化劑經(jīng)過提取純化，可得到純度達(dá)99％的目標(biāo)物。另一種是以2-溴噻吩和鎂在一定條件下反應(yīng)得到2-噻吩溴化鎂，2-噻吩溴化鎂與2，5-二溴噻吩反應(yīng)得到目標(biāo)物。陳祖興、張勝利(1997)用等效劑法，將α-三噻吩醛轉(zhuǎn)化為氰醇碳酸酯，并以其作為α-噻吩甲酰基負(fù)離子的等效劑與1，2二溴乙烷進(jìn)行親核取代反應(yīng)，繼而環(huán)化，得目標(biāo)物。
已有實驗證實，α-T在光照條件下通過吸收光線，引發(fā)單線態(tài)氧產(chǎn)生光動力作用而對細(xì)胞造成損害，主要靶標(biāo)為脂類、蛋白質(zhì)和核酸等重要細(xì)胞組分。具有蛋白質(zhì)本質(zhì)的多種生物酶系，可因光動力作用引發(fā)酶活性部位或結(jié)合部位附近必需氨基酸的破壞，或引起維持酶正常催化功能的分子結(jié)構(gòu)所需的遠(yuǎn)端氨基酸殘基的降解，導(dǎo)致酶的失活。α-T對昆蟲體內(nèi)的6-磷酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、乙酰膽堿酯酶、超氧化物歧化酶等均有抑制作用。
自Zechmeister和Sease(Zechmeister L..and sease，J.W，Ablue-fluorescing compound，terthienyl，isolated from marigolds.J.Am.Chem.Soc.1947，69273-275)從Tagetes.erecta的花中提取出分離物α-T之后，開始了對α-T的光敏化生物學(xué)的研究。Uhlenbroek和Bijloo(Uhlenbroek J.H，and Bijloo J.D.1960.Investigatiohs onnematocides.III.Polythienyls and related compounds.Rec.Trav.Chim791181-1196)發(fā)現(xiàn)有滅蚊作用。且有無紫外光照對α-T的毒性影響很大，在近紫外光照的條件下，α-T對斑須按蚊(Anopheles stephensi)4齡幼蟲的LC50為11mg/L，黑暗時則為154mg/L，其光活化毒殺活性提高了14倍；α-T對埃及伊蚊(Aedes aegypti)、白紋伊蚊(Aedes alpopictus)和致倦庫蚊(Culex quinquefasciatus)的光活化毒性也有類似結(jié)果(1994)；有資料表明α-T對果蠅卵的毒殺活性則可提高4333倍(1975)。Philogene等(1979)對Blackfly的幼蟲試驗結(jié)果為LC50為28ppb，LC90為70ppb。
除了上面提到的α-T對于幾種常見的衛(wèi)生害蟲的作用研究，研究人員也就α-T對于農(nóng)林害蟲中鱗翅目的害蟲的作用進(jìn)行了研究。Lyengar(LyengarS.，Arnason J.T.，Philogene B.J.R.Toxicokinetics of the phototoxicallelochemical α-terthienyl in three herbivorous Lepi doptera[J].Pestic.Biochem.Physicl，1987.291-9)研究了α-T對3種鱗翅目害蟲煙草天蛾、煙芽夜蛾、歐洲玉米螟的毒殺作用。點滴處理的LD50值，煙草天蛾為10μg/g(蟲重)，煙芽夜蛾為474μg/g(蟲重)，歐洲玉米螟為698μg/g(蟲重)。Helson等(Helson B.，Kaupp W.，Cecearelli，et al.Variation in susceptibility of tree-feeding insect species tophotoactivted thiophene insecticides.J Economic Entomology，1996.89(4).821-825)等用α-T對云杉卷葉蛾(Choristomeurafumiferana)、黑行軍蟲(Actebia fennica)、白斑天幕毛蟲(Orgyialeucostigma)等16種森林昆蟲進(jìn)行了試驗。其LD50在7ng/蟲到5000ng/蟲之間。扣除蟲種影響下，敏感性差異達(dá)500倍。產(chǎn)生這種差異的原因推測可能由于蟲種的體表透光性、體內(nèi)抗氧化劑及抗氧化酶的含量和代謝酶的活性的不同而產(chǎn)生的，其中多底物單氧化酶的活性，在敏感種與抗性種上的差異達(dá)10倍。
另外，Singh(Singh S.P.，Sharma P.，Vats L.K.1987Light-depentent toxicity of the extract of plant Tagetes erecta andalpha-terthienyl toward larvae of mosquito Culex tritaeniorhynchus.Toxicological Environ Chem 16.81-88)等報道萬壽菊花的乙醇提取物在陽光照射下可以顯著提高對三帶喙庫蚊幼蟲的毒殺效果，可能是由于提取物中含有如α-T一類的光敏物質(zhì)。Salloum(Salloum G.S.，Isman M.B.Crudeextracts of Asteracaous weeds，growth inhibitors for variegated worm.J.Chem.Ecol.，1986，15(4)1379-1389.)發(fā)現(xiàn)2種菊科植物(Artemisiatridentata和Chamomilla suaveolens)的石油醚及乙醇提取物以及另外2種植物(Chrysothamnus nauseosus和Centaurea diffusa的乙醇提取物在自然含量的5倍濃度時能強烈抑制豆雜色夜蛾(Peridromasaucia)幼蟲的生長。前兩種植物的自然含量也對夜蛾幼蟲有生物活性。Weaver(1997)分析了墨西哥萬壽菊(Tagetes minuta)花的提取物對玉米象(Sitophilus zeama)成蟲的光活化毒性，在光照下雌蟲LD50為35μg/蟲、LD90為319μg/蟲，雄蟲LD50為47μg/蟲、LD90為816μg/蟲。
國內(nèi)專門研究α-T的報道不多，研究人員對含有α-T的提取物進(jìn)行了一些試驗。樂海洋(樂海洋.勝紅薊、萬壽菊和柔毛水蓼對農(nóng)業(yè)害蟲生物活性初試.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，1992.634-36)報道了萬壽菊根和花的提取物對中華按蚊(Anopheles sinensis)幼蟲的具有光活化毒殺作用。樂海洋等(樂海洋 趙善歡 萬壽菊提取物對白紋伊蚊幼蟲的光活化活性及有效成分研究 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 1998 19(2)8～12)報道了萬壽菊提取物對白紋伊蚊幼蟲的光活化活性及有效成分研究，模擬室外防治試驗結(jié)果表明，12mg/L的萬壽菊根甲醇索氏提取物能有效防治白紋伊蚊。另外樂海洋(樂海洋，趙善歡.幾種菊科植物提取物對蚊幼蟲的光活化性初試.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報.1997，18(1)20-24)研究了8種菊科植物的20種提取物對白紋伊蚊(Aedes albopictus)和致倦庫蚊(Culex quinquefasciatus)及菜粉蝶(Pieris rapae)的光活化毒性及非光活化毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)萬壽菊(Tagetes erecta)、三葉鬼針草(Bidens pilos)、勝紅薊(Ageratumconyzoides)、加拿大飛蓬(Conyza canadensis)和希薟(Siegesbeckiaorientalis)的提取物有較好的光活化毒性。崔德君(崔德君.萬壽菊粗提取物對小菜蛾的生物活性和作用機制研究[博士論文].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，1997.)也進(jìn)行了萬壽菊粗提物和α-T對小菜蛾(Plutella xylostella)的卵、幼蟲和成蟲的毒殺試驗。研究發(fā)現(xiàn)兩者都對小菜蛾幼蟲有拒食作用和生長發(fā)育抑制作用。萬樹青等(萬樹青.多炔類化合物殺蟲活性及其作用機理研究[博士論文]華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，1998)以茵陳二炔為母體合成了10多個聚乙炔類化合物，對這些化合物的生物活性進(jìn)行了廣泛的測定。試蟲包括致倦庫蚊、赤擬谷盜、亞洲玉米螟、甘蘭蚜、米象、大豆蚜、菜粉蝶、美洲大蠊、槐尺蠖及棉紅蜘蛛。除活性測定外，還從酶化學(xué)及電生理方面對聚乙炔類化合物的作用機理進(jìn)行了研究。
另，有報道稱，利用萬壽菊根的水抽提物，對于多種植物根結(jié)線蟲有毒殺作用，如馬鈴薯的金線蟲、甜菜異皮線蟲、林果及花卉上的根結(jié)線蟲等。這些植物線蟲屬于線形動物門線蟲綱根結(jié)線蟲屬，它主要分布在5-30厘米土壤中，主要危害根部，嚴(yán)重時，引起植株凋萎，甚至枯死。
推測，萬壽菊中含有α-三聯(lián)噻吩(α-T)、5-(3-J烯-1炔基)-α，2′-二噻吩及其它活性物質(zhì)，它們中的一種可能能殺死根結(jié)線蟲。但究竟是哪種物質(zhì)起作用未見確切的研究報道。同時，根結(jié)線蟲所生活的淺表層土壤的透光性稍好，這就可能給光活化活性物質(zhì)發(fā)揮有效作用提供了條件。
至今尚未有專門研究α-T用于殺死松材線蟲及應(yīng)用于防治松材線蟲病的報道。一般認(rèn)為1、α-T只對于衛(wèi)生害蟲及農(nóng)林害蟲中的鱗翅目害蟲起毒殺作用；2、松材線蟲寄生在光照條件很差的松樹的木質(zhì)部的樹脂道中，任何可能毒殺松材線蟲但需依賴于光照條件的光活化毒素在此都無法發(fā)揮作用。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供已知化合物α-三噻吩的新用途。
實際上，本發(fā)明涉及α-三噻吩用于防治松材線蟲病的應(yīng)用。
進(jìn)一步的，本發(fā)明涉及α-三噻吩在防治松材線蟲病的藥劑中的應(yīng)用。
具體的說，以任意的施用方法，不論是打孔注藥、根部施藥、噴霧防治，對松樹施用α-三噻吩或含有α-三噻吩的組合物對松材線蟲病有防治作用，當(dāng)施用至松樹中α-三噻吩的濃度大于等于10-4g/g，即可防治松材線蟲病的發(fā)生。
上述含有α-三噻吩的組合物含有有效量的α-三噻吩和載體。
上述含有α-三噻吩的組合物中，α-三噻吩的含量占組合物總重量的0.0005-99％，較佳地為10-99％，更佳地為60-99％。
含有α-三噻吩的組合物可為下組的劑型可濕粉劑，可乳化濃縮物，水溶液，乳液，可噴灑溶液，油性或水性分散系，懸浮劑，粉劑，顆粒劑，微膠囊。
含有α-三噻吩的組合物可為α-三噻吩的丙酮水溶液或乙醇水溶液，α-三噻吩的含量占組合物總重量的0.001-99％。
上述含有α-三噻吩的組合物對下列的松樹施用至松樹中α-三噻吩的濃度大于等于10-4g/g時，即可防治松材線蟲病赤松、黑松、馬尾松、黃松、海岸松、火炬松、濕地松、琉球松、白皮松等松屬植物及冷杉屬、云杉屬、雪松屬、落葉松屬植物。
上述含有α-三噻吩的組合物通常含0.001-95％的活性成分(即α-三噻吩)。濃縮型的農(nóng)藥中活性成分的含量較高，如85-95％，而稀釋型的農(nóng)藥中活性成分的含量較低，通常為0.001-20％。此外，還可以含有其它合適的化學(xué)殺菌劑、增效劑、微量元素、穩(wěn)定劑、粘合劑、潤濕劑、分散劑、乳化劑、滲透劑、溶劑、充填劑等常用成分。
上述含有α-三噻吩的組合物還可以含有其它具有殺蟲活性的物質(zhì)，化肥和、或生長調(diào)節(jié)劑。
上述含有α-三噻吩的組合物的適用的形式包括適合噴灑、噴霧的氣霧劑、水性或非水性溶液或分散系。優(yōu)選方式是水性母液和易溶于水的顆粒形式。特別是α-三噻吩的丙酮水溶液或乙醇水溶液。
上述含有α-三噻吩的組合物可由α-三噻吩和載體采用一般方法均勻混合而成。
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面將通過α-三噻吩對松材線蟲的毒殺試驗及結(jié)果來說明其在防治松材線蟲病的藥劑中的新用途。
首先，測定松材線蟲在生理鹽水中生存的最適濃度取一定的氯化鈉溶于蒸餾水中配制成0.95％、0.85％、0.75％、0.65％、0.5％、0.45％六個濃度，將各濃度溶液依列倒入血球計數(shù)器，然后在每個小格中加入準(zhǔn)備好的已分離的松材線蟲300條。2天后觀測松材線蟲的存活情況，結(jié)果表明當(dāng)濃度為0.85％時松材線蟲存活數(shù)最多。本試驗?zāi)康氖窍朐谑覂?nèi)保證松材線蟲有較好的活性。讓它盡量與林間松材線蟲有相同的活性，在今后相關(guān)的實驗中，就可取0.85％氯化鈉溶液與其他試劑相配，保證松材線蟲本身能有很好的活性增加殺線劑試驗的準(zhǔn)確性。
二、測定同一光照強度下不同濃度的α-T對松材線蟲的毒殺作用配制1升0.85％的生理鹽水作為溶液，α-T作為溶質(zhì)，配制濃度分別為10-9，10-8，10-7，10-6，10-5，10-4g/mL六個濃度的溶液。將配制好的溶液倒入血球計數(shù)器中，每一列倒入一個濃度，一個濃度為一種處理，每個處理四個重復(fù)即每一濃度倒入一列中的4個小格，另外留一列只加入0.85％的生理鹽水作為對照，每個小格中加入200條松材線蟲，將血球計數(shù)器放置25℃的保溫箱中，取光度計測得箱內(nèi)光照強度為450Lux，每隔兩小時觀察松材線蟲數(shù)，記錄不同時間不同濃度下的松材線蟲數(shù)。計算公式如下 將濃度取其對數(shù)值后全部加10的值為x，致死率查“反應(yīng)率-機率值轉(zhuǎn)換表”換成機率值為y值，用回歸方法求出毒力的回歸方程y＝a+bx，并以y＝5時(致死率為50％的機率值)代入回歸方程，求出x，再取x-10的10次方求出EC50(致死中濃度)。
由統(tǒng)計方法，計算出α-T的不同濃度在16h后對松材線蟲的致死率，求出α-T在保溫箱中即光照強度450Lux，25℃下的EC501.48×10-6g/ml，數(shù)據(jù)列于表1。做出隨處理時間延長不同濃度中松材線蟲的死亡曲線，圖1、圖2、圖3、圖4分別是10-8g/ml、10-7g/ml、10-6g/ml、10-5g/ml濃度的α-T溶液對松材線蟲的作用。
表1 α-T對松材線蟲的毒殺作用
本試驗表明α-T對松材線蟲是有很強的毒性的，而且在很短時間里就能夠全部將松材線蟲毒殺，濃度越大毒殺松材線蟲速度越快，我們看到在10-4g/ml時，在6h后就將全部松材線蟲殺死。同時考慮到α-T作為光敏毒素，光對它是很重要的，在試驗中，我們一直將被處理物置于光照條件下，這也可能是導(dǎo)致作用效果迅速的一個原因。但是在保溫箱中光照強度是很小，即使這樣卻已能激發(fā)了α-T的活性。
三、不同光照強度下不同濃度的α-T對松材線蟲的毒殺試驗以0.85％的生理鹽水作為溶液，α-T作為溶質(zhì)，配制濃度為10-4，10-5，10-6，10-7g/ml溶液。將配好的溶液倒入血球計數(shù)器一個濃度倒入一列，倒入7個血球計數(shù)器，向每個小格內(nèi)加入松材線蟲200條。用光度計在日光燈下分別在不同高度測量光照強度，使光照強度分別為20000，10000，5000，2500，1250，625，312.5Lux。將血球計數(shù)器放置在已固定好位置的不同光照強度下，在每個血球計數(shù)器取一列加入0.85％的生理鹽水和200條松材線蟲作為對照。處理8h后觀測松材線蟲的存活數(shù)，并作記錄。見下表2 不同濃度的α-T在不同光照強度下對松材線蟲的作用
圖5為不同光照強度和不同濃度α-T中松材線蟲的存活曲線由表2可看出光照強度在20000Lux時，對照中松材線蟲存活不好，說明此時光線太強影響到松材線蟲的正常的存活。究其原因，作者認(rèn)為不可能是受熱過大而引起的，因為在本試驗之前就已發(fā)現(xiàn)如果要達(dá)到本實驗要用的光照強度，一般的日光燈是不行的，初期的試驗發(fā)現(xiàn)雖然光照強度達(dá)到試驗要求，但是由于取用一般日光燈，光照強度變大同時發(fā)熱也增強，導(dǎo)致試驗中的松材線蟲溶液溫度高，松材線蟲常發(fā)生全部死亡的現(xiàn)象。故而在本試驗中是采用特別的燈具，要求發(fā)熱很小，但是光強卻能達(dá)到試驗要求。在發(fā)現(xiàn)對照中松材線蟲數(shù)不多時，發(fā)現(xiàn)光照下的血球計數(shù)器發(fā)熱的，測表面溫度約27℃左右，這對松材線蟲是不會致命的，對照中的松材線蟲數(shù)小可能是由于松材線蟲對光照強度過大的反應(yīng)所致。在光照強度在10000Lux時，對照中松材線蟲存活則很好，相反加入試劑的處理則全部死亡，這是由于光照強度大使得α-T毒素發(fā)揮強作用，即使是10-7g/mL這么小的濃度松材線蟲也全部死亡。圖3.2是將10-5、10-6、10-7g/mL不同光照強度和不同濃度下松材線蟲的存活曲線，由于10-4g/mL在觀測時松材線蟲全部死亡故未做圖示，當(dāng)濃度10-7g/mL時，松材線蟲隨光照強度的變化其松材線蟲數(shù)曲線較為平緩，在小于2500Lux后基本很少再發(fā)現(xiàn)有松材線蟲死亡，對松材線蟲的致死率也很小約14.5％；濃度10-5g/mL和濃度10-6g/mL在光照強度大于1250Lux時，對松材線蟲毒殺效果好，致死率約92％和80.5％。
采用如下的生測方法進(jìn)行α-T對松材線蟲的毒殺試驗在新鮮黑松枝上取直徑為0.3cm、0.6cm、0.9cm，厚度0.5cm的小木塊，每個直徑取6木塊，將木塊放入干燥箱中干燥4h，用電子天平測木塊干燥后的重量，計算出木塊的平均干重。另取相同的木塊干燥4h后，滴水使木塊含水量近飽和，記錄滴水量，計算出平均滴水量。根據(jù)所得的平均滴水量和木塊的平均干重來配制不同濃度的α-T溶液使干燥的木塊在加入配制的α-T溶液后木塊含水量近飽和易于藥劑在木塊的完全分布，且α-T在木塊中的濃度也符合試驗的要求。每個直徑取3個木塊在同一面上加入α-T使得木塊中α-T含量為10-5g/g，在加有α-T的木塊的另一面滴加松材線蟲300條。在余下的3塊木塊中也加入300條松材線蟲作為對照。將所有木塊置于10000Lux光照強度下，使得木塊每天受光照12h并每天翻動一次保證木塊兩面受光均勻，四天后用貝爾曼漏斗法分離木塊中的松材線蟲，觀測并記錄木塊中松材線蟲的存活數(shù)。

數(shù)據(jù)見表3，當(dāng)α-T在木塊中濃度為10-5g/g，光照強度10000Lux下，直徑0.3cm的木塊中松材線蟲致死率為93％；直徑0.6cm、0.9cm的木塊中的松材線蟲致死率為88.5％和84％，出現(xiàn)這種結(jié)果推測可能由于直徑較大透光性不如直徑小的好，直徑大小對試劑的毒殺作用產(chǎn)生一定的影響。另外對照中的松材線蟲無論是直徑大小松材線蟲都存活良好，說明藥劑對木塊中的松材線蟲還是產(chǎn)生了毒殺作用。但是否對松材線蟲實際防治工作有所幫助那要在下面做進(jìn)一步的研究。
表3 10-5g/g的α-T在10000Lux光照強度下對不同直徑黑松木塊中松材線蟲的作用
四、α-T對松材線蟲毒殺作用的林間試驗取兩年生的黑松苗一棵，截松苗枝上一段松枝用電子天平測其重量，按這一段松枝在整個松苗上的重量比例估算整棵黑松苗的重量。
選12棵兩年生長勢良好的黑松苗，每兩棵為一組。在松苗基部用小刀切深約0.4cm的切口，取一個小塑料離心管，將管頂端用刀斜切一小口，將離心管插入傷口處，用封口膜將離心管與傷口接觸處密封，從離心管的另一端注入α-T。使得黑松苗中α-T含量分別為10-4，10-5，10-6g/g，每種濃度處理兩棵黑松。取已注藥處理過的6棵松樹苗和2棵未處理的松苗，在每棵松苗側(cè)枝頂端，用刀削去頂梢部針葉露出側(cè)枝枝端，在側(cè)枝端頂用小刀切小口，取塑料離心管一支切去離心管下端一截使得離心管可與切開的側(cè)枝端相接，用封口膜密封接口確保當(dāng)從離心管另一端加入松材線蟲時松材線蟲不發(fā)生泄漏，在每棵樹苗中加入松材線蟲5000條。取2棵如前面的方只加入松材線蟲5000條，另取2棵健康松樹作為空白對照。一個月后觀測樹苗的存活情況。
一個月觀測樹苗發(fā)現(xiàn)，作為空白對照樹苗(即未加藥處理也未加注松材線蟲)長勢良好，沒有發(fā)現(xiàn)有松脂減少和松針變色；兩棵只注入松材線蟲的松苗松脂明顯減少、葉發(fā)黃，說明用這種方法注入的松材線蟲已經(jīng)發(fā)??；在用α-T濃度為10-4g/g的處理過的松苗中，松脂未發(fā)現(xiàn)減少，松樹生長正常，說明在黑松上加入10-4g/g的α-T時可對松材線蟲有毒殺作用，可以防治松材線蟲病的發(fā)生。而濃度為10-5g/g處理過的松苗有一棵表現(xiàn)了松脂減少、失水、少量葉發(fā)黃變色。10-6g/g處理過的兩棵松苗也全部發(fā)病。
上述試驗表明，α-T對松材線蟲是有很強的毒性，而且在很短時間里就能夠全部將松材線蟲毒殺，濃度越大毒殺松材線蟲速度越快，我們看到在10-4g/ml時，在6h后就將全部松材線蟲殺死。同時我們考慮到α-T作為光敏毒素，有光的照射對它是發(fā)生作用是很重要的。在試驗中，我們一直將被處理物置于光照條件下，雖然光強很小但是卻能夠激活其活性，表現(xiàn)了很好的毒殺效果。
進(jìn)一步的試驗研究了光對于α-T的活性的重要性，配制了不同濃度的試劑溶液放在不同光照強度下，試驗結(jié)果也很好地說明了光照強度的不同會大大的影響α-T的活性，影響其作用速度，我們看到在10000Lux時，即使10-7g/g這么小的濃度也將松材線蟲全部殺死，這就充分說了明了光對其活性的重要性了。
其后，應(yīng)用所述的生測方法，用木塊在室內(nèi)進(jìn)行了模擬林間的的殺線試驗。結(jié)果表明要木塊中α-T濃度為10-5g/g，光照強度10000Lux時，其致死率高達(dá)93％，隨采用的樹枝變粗致死率有所下降但也達(dá)到84％。致死率下降有可能是由于樹枝變粗，樹齡較大其表皮也較厚，光線穿透不良，但是可看出影響并不是很大，其致死率也是較高的，如此高的致死率如能林間也達(dá)到那將可能對松材線蟲的防治有很大的幫助。
最后對兩年生的黑松苗進(jìn)行了林間接種加藥處理，結(jié)果表明在10-4g/g的濃度下，接種黑松苗沒有發(fā)病，長勢良好，而接種未加藥處理的黑松苗則表現(xiàn)了發(fā)病癥狀，濃度為10-5g/g處理過的松苗有一棵表顯了松脂減少、失水、少量葉發(fā)黃變色，另一棵則沒有發(fā)病，推測原因可能樹體對藥液的吸引可能不好。在濃度10-6g/g處理過的兩棵松苗也全部發(fā)病。需要說明的是由于松苗移植后管理不善發(fā)生大量死亡，只留下少量存活，故而在本試驗設(shè)計的很多重復(fù)不能夠進(jìn)行，只能每種處理重復(fù)兩棵，但是所選的樹苗是長勢均是很好很健壯的樹苗，得到的結(jié)果是可信的。
從上述結(jié)果，可以得出本發(fā)明的優(yōu)點在于1、本發(fā)明對已知植物源光敏毒素α-三噻吩發(fā)掘了新的用途，開拓了一個新的應(yīng)用領(lǐng)域。
2、本發(fā)明的α-三噻吩對松材線蟲是有很強的毒性，在很短時間里就能夠全部將松材線蟲毒殺，濃度越大毒殺松材線蟲速度越快，在10-4g/ml時，在6h后就將全部松材線蟲殺。在光照條件下對害蟲的毒殺效果成幾倍、幾十倍甚至上千倍地提高，顯示出光活化的特性。
3、本發(fā)明的α-三噻吩是一種植物源光活化毒素，對人畜低毒、在環(huán)境中能迅速降解且殺蟲高效。它具有傳統(tǒng)殺蟲劑無法比擬的優(yōu)點。首先就是它的光敏性，在光照的情況下，其藥效顯著增強；其次，目標(biāo)物對它不易產(chǎn)生抗性，對非靶標(biāo)生物的毒性極低；第三，它在細(xì)胞上的生化作用位點較多，決定了它與傳統(tǒng)殺蟲劑之間不易產(chǎn)生交互抗性。此外，它還具有高效的特點，光敏物質(zhì)如染料分子本身并不介入毒性反應(yīng)，致使起催化劑的作用，光敏劑從被激發(fā)到單重態(tài)，最后回到基態(tài)，大約只要10ms或更短。但同時我們也應(yīng)看到，它是光活化殺蟲劑，這就要求環(huán)境要有較好的光照條件，如果環(huán)境中光照條件不良會影響到它作用效果。盡管如此，α-T藥效強、害蟲不易產(chǎn)生抗性、殘留時間短，將其開發(fā)用于農(nóng)林上的殺蟲劑有廣闊前景。
4、當(dāng)今使用的有機合成殺蟲劑大多是光分解的或在光照條件下藥效降低，而且許多植物體內(nèi)具有殺蟲活性的次生產(chǎn)物也是光分解的，例如人們熟知的除蟲菊酯、魚藤酮等。同時由于長期使用化學(xué)合成殺蟲劑而帶來了害蟲的抗藥性(Resistence)、害蟲再猖獗(Resurgence)、殘留(Residue)問題，即著名的“3R”問題。為了解決這些問題，需要高效、低毒、低抗性、低殘留的安全的殺蟲劑，α-T作為具殺蟲活性的天然植物次生代謝物質(zhì)，在有光照條件下，藥效不但不會降低而且會由于光活化作用而增強，達(dá)到高效殺蟲的目的。對于殺蟲劑帶來的″3R″問題，由于其充分利用生物生長環(huán)境中無所不在的兩個自然因子——光和氧，提高了化合物的殺蟲效果。與其他化合農(nóng)藥相比，光不僅提高了α-T的藥效，而且它是植物抵御害蟲的長期進(jìn)化中所形成的，害蟲不易產(chǎn)生抗藥性。
5、本發(fā)明的α-三噻吩已有較簡單的人工合成工藝。獲取方便。
6、α-T作為一種植物中的次生物質(zhì)，由植物中提取，它具有很好的內(nèi)吸性且能夠在樹體中輸送，這樣就給α-T的施用提供了多種能達(dá)到殺蟲效果的方法。不論是打孔注藥、根部施藥、噴霧防治均可。施用方便。


圖1、圖2、圖3、圖4分別是10-8g/ml、10-7g/ml、10-6g/ml、10-5g/ml濃度的α-T溶液中松材線蟲的存活曲線圖5為不同光照強度和不同濃度α-T中松材線蟲的存活曲線具體實施方式
實施例1購進(jìn)Sigma公司產(chǎn)品α-三噻吩，用少量丙酮溶解，加水配成濃度為100g/L的溶液，使用江蘇博華生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的高壓大容量樹木注干機6HZ-0503型注干機在樹干基部注射(距地面15cm以內(nèi))，每年6月底之前對松樹林進(jìn)行施用。注射量按樹的材積計算，實際注射量＞100g/m3。在施用后當(dāng)年松樹不會發(fā)生松材線蟲病。
實施例2使用Sigma公司生產(chǎn)的純度＞95％的α-三噻吩，以少量丙酮溶解，加水配成濃度為100g/L的溶液，于每年5-6月，使用背負(fù)式打孔機在距離地面10cm以下的樹干四周均勻打孔(胸徑每增加3cm多打1個孔)，孔向下傾斜45°左右，深度1.0～1.2cm，每孔注射α-T溶液，總注射量按樹的質(zhì)量和溶液中溶質(zhì)α-三噻吩的質(zhì)量計算，每克質(zhì)量的樹中注射α-三噻吩的質(zhì)量大于10-4g。用稀泥堵塞孔眼。在施用后當(dāng)年松樹不會發(fā)生松材線蟲病。
實施例3使用Sigma公司生產(chǎn)的純度＞95％的α-三噻吩，以少量丙酮溶解，加水配成濃度為100g/L的溶液，于每年5-6月，采用樹干包扎法施藥。具體做法是，用砍刀在樹干胸高處刮去粗皮至形成層(不能傷及形成層)，刮皮面積100cm2，然后用藥棉吸附α-T水溶液貼于刮皮處，再用塑料布包緊扎好。胸徑10cm以下，用藥量30ml，胸徑每增加3cm，用藥量增加10ml，胸徑20cm以上，用藥量250ml以上。施藥后當(dāng)年，松樹不會發(fā)生松材線蟲病。
實施例4每年在6月之前，使用Sigma公司生產(chǎn)的純度＞95％的α-三噻吩，以少量丙酮溶解配制成100g/L的水溶液，對郁閉林地進(jìn)行地面噴霧用藥量為200g/畝。如有機場條件，可考慮利用飛機噴施防治。施藥后當(dāng)年，松樹不會發(fā)生松材線蟲病。
實施例5每年在6月之前，使用Sigma公司生產(chǎn)的純度＞95％的α-三噻吩，以乙醇配制成10g/L的貯備母液，加水配成濃度為100g/L的溶液，對林木進(jìn)行地面噴霧用藥量為300g/畝。施藥后當(dāng)年內(nèi)，松樹不會發(fā)生松材線蟲病。
實施例6每年在6月之前，在二甲苯和水的混合液中加入Sigma公司生產(chǎn)的α-三噻吩，再加入適量的壬基酚聚氧乙烯醚作分散劑，攪拌，配制成油乳劑，其中α-三噻吩的含量為100g/L，對林木進(jìn)行地面噴霧，用藥量為200g/畝。施藥后當(dāng)年松樹不會發(fā)生松材線蟲病。
實施例7用Sigma公司的α-三噻吩及乙撐三胺和三乙胺反應(yīng)制成膠囊，其中α-三噻吩為膠囊質(zhì)量的55％，每年在6月之前對林木進(jìn)行施藥，用藥量為400g/畝，施藥后當(dāng)年松樹不會發(fā)生松材線蟲病。
以實施例1所示的注干法是最經(jīng)濟的施用方法，它不會象噴施法中部分α-三噻吩不可避免地浪費在土壤及植物表面。
當(dāng)然，本發(fā)明有多種實施形式，只要對松樹施用α-三噻吩或含有α-三噻吩的組合物如α-三噻吩的丙酮水溶液或α-三噻吩的乙醇水溶液或其它形式的α-三噻吩的溶液，施用量至施用后松樹中α-三噻吩的濃度大于等于10-4g/g，即可防治松材線蟲病的發(fā)生。這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，閱讀本說明書后毋需付出創(chuàng)造性勞動即可再現(xiàn)出，在此就不詳述了。
權(quán)利要求
1.α-三噻吩用于防治松材線蟲病的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于以任意的施用方法，對松樹施用α-三噻吩或含有α-三噻吩的組合物，施用量至松樹中α-三噻吩的濃度大于等于10-4g/g。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于以注干法對松樹施用α-三噻吩的丙酮水溶液或乙醇水溶液，施用量至松樹中α-三噻吩的濃度大于等于10-4g/g。
4.α-三噻吩在防治松材線蟲病的藥劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及α－三噻吩的用途，尤其是用于防治松材線蟲病的應(yīng)用。實驗證明，α－三噻吩對松材線蟲有很強的毒性，濃度大于等于10
文檔編號A01N43/02GK1736194SQ200510039280
公開日2006年2月22日 申請日期2005年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月10日
發(fā)明者趙博光 申請人:趙昕