專利名稱：一種水稻體細胞無性系誘變育種方法
技術領域：
本發明涉及生物技術和作物育種領域，特指基于組織培養且結合高濃度2，4-D處理的體細胞無性系篩選育種的方法。
背景技術：
基因突變在生物界中廣泛存在。其中，自發突變是指自然條件下發生的突變，是生物變異的重要來源，也是自然進化的基礎。無論是低等生物，還是高等動植物及人類，都可能發生自然突變。自發突變為人類提供了極有價值的育種材料。例如在水稻育種中，上世紀60年代水稻矮桿突變的發現揭開了矮化育種的序幕；細胞質雄性不育株的發現使水稻三系法雜種優勢的利用成為現實；而光(溫)敏核不育水稻的發現則為采用兩系法利用水稻亞種間的雜種優勢鋪平了道路，從而降低了雜交育種的成本。然而自發突變的頻率是很低的，在高等生物中，大約10萬個到1億個生殖細胞中才會有一個生殖細胞發生突變，突變頻率是10-5～10-8，且許多突變細胞通過表型無法鑒定而丟失，很難進行系統收集。通過自發突變育種是一個極其漫長的過程，而且還需要一定的運氣和機遇，因此，該方法在作物育種中受到了極大的限制，只能是可遇而不可求。
隨著分子生物學的不斷發展，基因的克隆和轉化已是一種常規的生物技術手段，通過基因槍的轟擊和農桿菌的介導等方法已成功地在單雙子葉植物中進行了基因的轉化，并篩選培養出了許多轉基因作物品種。然而在轉基因過程中，轉入了一種外源的選擇標記基因，如抗抗生素基因和抗除草劑基因等，使轉基因作物存在著一種潛在的風險，引起了人們極大的關注。為了不使這種選擇抗性標記基因在自然環境中擴散開來，國家和政府制定了較為嚴格的審查程序，須經多年的審查方可在大田釋放和推廣。加之現在有些消費者擔心轉基因食品帶來的潛在危害，從而對轉基因作物及其產品加以抵制。因此，轉基因技術在作物育種中也受到了一定的限制。
上個世紀遺傳學上最重要的發現之一就是突變能夠被誘發。利用物理因素、化學藥劑、太空射線以及組織培養等方法可以誘導生物發生突變。物理誘變和化學誘變雖然是穩定高效的誘變方式，但往往造成多個基因的突變，從而導致多個性狀發生改變，甚至使無性系親本的某些優良性狀丟失，而且后代穩定慢。體細胞無性系在培養過程中常常發生基因突變，變異體基本保持源品種的優良特性，多數為單基因變異，后代穩定快。但是，通過組織培養的體細胞變異，其變異頻率隨培養時間延長而提高，而且隨著培養時間的延長，其愈傷組織的分化頻率也急劇下降，往往導致再生苗分化的極度困難。因此，尋找一種愈傷組織誘變處理比較溫和，而且有較高的分化頻率，并能保持原無性系親本的許多優良農藝性狀且后代穩定較快的新型育種方法顯得極為重要。
發明內容
本發明的目的是提供一種誘變效率高，愈傷組織的分化頻率高，育種周期短，且不具有任何潛在風險的簡便易行的新型水稻育種方法。
植物體細胞無性系在組織培養過程中，其染色體會發生斷裂和重排以及DNA的甲基化，也可導致點突變和轉座元素的激活跳躍。因此，通過組織培養可以激發染色體DNA的斷裂和重排，以及激活內源轉座子或反轉錄轉座子的跳躍插入，從而提高突變頻率。組織培養的體細胞變異頻率隨培養時間的延長而提高。但是隨著培養時間的延長，其愈傷組織的分化頻率也急劇下降，往往導致再生苗分化的極度困難。在組織培養過程中，通過提高繼代培養基中的2，4-D濃度，可提高無性系的變異頻率，并縮短了培養時間。因此，以高濃度2，4-D繼代誘變胚性愈傷組織1個周期(約25天)后，顯著提高了誘變頻率和分化頻率，再結合一定的選擇壓力對細胞突變體進行篩選可實現一定程度的定向誘變，從而提高了誘變效率，縮短了育種周期。
本發明的目的是通過下述方法實現的水稻體細胞無性系在組織培養過程中，提高繼代培養基中2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)濃度進行繼代誘變處理，使體細胞突變，再結合在低溫、高溫、高鹽、病蟲害的選擇壓力下對突變體進行篩選，實現無性系篩選育種。
所述的提高繼代培養基中2，4-D濃度進行繼代誘變處理則是指胚性愈傷組織于基本培養基MS+2，4-D 3.5-4.5mg/L培養基中繼代培養1個周期后，以24-26天為1個培養周期；再轉移至正常的繼代培養基中培養。其中誘變處理最優的2，4-D濃度為4mg/L。
所述的胚性愈傷組織為繼代2-3個周期的胚性愈傷組織。
本發明以水稻的幼穗和成熟胚為外植體，在培養基中進行正常的愈傷組織的誘導、繼代，再經高濃度2，4-D的MS培養基繼代誘變，再轉移至正常的繼代培養基中培養，然后于分化培養基中進行分化及再生苗的生根。同時在培養基中離體培養過程中或再生苗在大田栽培過程中結合一定的選擇壓力以獲得所需農藝性狀的突變株。
經誘變得到的體細胞突變體根據需要采取不同的選擇壓力(如高溫、低溫、高鹽、病蟲害等)進行篩選，可實現一定程度的定向誘變。該篩選過程可在離體培養中進行，也可在大田栽培中進行。
體細胞突變體R1代經一定的選擇壓力篩選后，于抽穗期套袋自交結實，并將符合目標性狀的變異株分單株采種。然后在相同選擇壓力下對R2，R3代再進行篩選，直至篩選到符合目標性狀且性狀不再分離的變異株為止。該變異株即為體細胞無性系誘變得到的品種。
本發明以高濃度2，4-D誘變處理繼代2-3個周期的胚性愈傷組織即可達到本發明目的。在作物育種中，利用這種方法誘導作物發生突變，并結合一定的選擇壓力進行篩選，從而加速了育種進程，同時也避免了因引入外源抗性標記基因所帶來的風險。
本發明方法具有操作簡便，誘變效率高，突變后代性狀穩定快，并且不需要象轉基因技術那樣的昂貴的儀器設備，也因沒有引入外源基因而沒有任何潛在的環境及生態風險等優點。針對不同的作物品種，只需將誘導、繼代、分化和生根培養基的激素濃度稍加改變，即可以通過本發明方法能快速高效地誘變出新的具有優良農藝性狀的作物品種。因此，本發明方法在作物育種及農業生產上具有十分廣泛的應用前景。
通過本發明方法，我們以新型兩系溫敏核不育系株1S的幼穗和成熟胚誘導出了愈傷組織，再以高濃度2，4-D進行繼代誘變，然后對誘變后的愈傷組織進行分化和生根培養獲得了再生植株。經過田間的篩選鑒定，于R3代就獲得性狀穩定的矮桿突變株SV14S，而且還保留了株1S所具有的其它優良農藝性狀。同時，通過本發明方法我們以三系保持系中9B的幼穗誘導的愈傷組織，經高濃度2，4-D進行繼代誘變處理后，然后經繼代、分化和生根培養，獲得再生植株，并經過田間的篩選鑒定，于R4獲得了性狀優良且穩定的突變株。
通過我們一系列的實驗證實，本發明方法是十分簡便可靠的，它具有誘導效率高，后代穩定快，在作物育種中具有很好的應用前景。
本發明的優點在于1.本發明方法所需的組織培養技術是一種應用廣泛的生物技術手段，且其成本低，技術要求不高，易于使用者掌握及該方法的推廣。
2.在提高誘導效率中所使用的2，4-D價廉易購，而且在使用中操作簡便，不需要昂貴的儀器設備和較高的技術要求。
3.由于沒有外源基因的導入，因而也沒有轉基因作物所具有的潛在的生態環境安全和食品健康安全等問題。通過此發明方法，一旦獲得具有優良性狀的突變品種，就能很快獲準大田釋放和推廣。
4.體細胞無性系經高濃度2，4-D的繼代誘變處理可大幅度提高變異頻率和誘導效率，同時又能很大程度地保留源作物品種的優良性狀，再結合一定的選擇壓力可實現一定程度的誘發突變，從而大大縮短育種周期。一般來說，誘變突變體只需經3代左右篩選即可定型。
圖1為幼穗誘導出的愈傷組織。
圖2為成熟胚誘導出的愈傷組織。
圖3為繼代時間對綠苗分化頻的影響。
圖4為分化培養圖。
圖5為SV14S和株1S的田間表型。
具體實施例方式
以下實施系列旨在說明本發明而不是對本發明做限制。
實施例1.材料于田間采集花粉母細胞形成期的幼穗立即用于接種培養或儲存于4℃的冰箱中備用。若以成熟胚為外植體，則應選取活力較強(于4℃儲存不超過3年)飽滿無霉變的種子。
2.培養基及培養條件選用MS為基本培養基，蔗糖濃度為3％，用0.7％的瓊脂固化，pH為5.8～6.2，在121℃濕熱高壓滅菌20min，在不同發育階段添加不同的激素(見表1)。培養溫度為25±1℃，光照強度為2000lx，光照時間為12小時/天。
表1.培養基種類與成分
注2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)；6-BA(6-芐基腺嘌呤)；IAA(吲哚-3-乙酸)；NAA(α-萘乙酸)3、愈傷組織的誘導將幼穗外層葉片剝去，留旗葉鞘，置于70％酒精中浸泡1～2min，再置于0.1％HgCl2中滅菌7～10min。在超凈工作臺上用無菌水沖洗3～5次，除去旗葉鞘，將幼穗切成1cm左右的小段，接種于誘導培養基中以獲得愈傷組織(圖1)。若以成熟胚為外植體，則將水稻種子剝去穎殼，先用70％酒精浸泡1～2min，再置于0.1％HgCl2中滅菌7～10min，在超凈工作臺上用無菌水沖洗3~5次，接種于誘導培養基中以獲得愈傷組織(圖2)。
4.愈傷組織的繼代培養以25天為一個培養周期，挑取顏色淡黃，質地致密的胚性愈傷組織于繼代培養基進行繼代培養。通過組織培養的體細胞變異，其變異頻率隨培養時間延長而提高。但是隨著培養時間的延長，其愈傷組織的分化頻率也急劇下降(見圖3)。因此，為了保持較高的分化頻率，我們以繼代2-3個周期的胚性愈傷組織來進行高濃度2，4-D的誘變處理。
5.高濃度2，4-D的誘變處理將誘導得到的愈傷組織經繼代培養2-3個周期后，選取淡黃色，質地致密的胚性愈傷組織培養于MS+2，4-D 4mg/L培養基中培養1個周期(約25天)。高濃度2，4-D的誘變處理只能是1個培養周期左右，若處理時間過長，愈傷組織的分化頻率則顯著降低，甚至褐化壞死。1個周期后，再選取淡黃色致密的愈傷組織轉移至正常的繼代培養基培養1個周期。
6.愈傷組織的分化培養挑取經正常的繼代培養基培養1個周期后的淡黃色、質地致密的胚性愈傷組織于分化培養基進行分化培養(圖4)。對于繼代次數較多且較難分化的愈傷組織，當愈傷組織顯綠后可作適當的干燥處理以促進分化。
7.分化苗的生根培養將分化苗培養于生根培養基中誘導生根。大約1周左右就有大量的不定根長出。
8.練苗移栽將生根后的水稻苗于栽種前20天左右移出培養室，揭去三角瓶的封口膜，往三角瓶中加入少量水覆培養基以防霉菌生長。這樣練苗一個星期后，即可移栽于大田，移栽后一周內注意保溫和遮陽，避免陽光直射，待生根定植后即可按常規方法管理。
9.突變體的篩選將R1代再生苗經練苗后分株系移栽于大田中，再根據需要采取不同的選擇壓力(如高溫、低溫、高鹽、病蟲害等)進行篩選，抽穗期套袋使其自交結實。將符合目標性狀的變異株分單株采種。將R2代按株行再種于大田中，于各生長發育時期考查其主要農藝性狀，對于符合目標性狀而其它優良農藝性狀不發生改變的株系再采種。再將R3代按株行種于大田，對其目標性狀和其它優良農藝性狀進行考查，若其性狀得以穩定，則該突變株系即是我們所需的優良誘變品種。若是性狀還不穩定，則仍需進行R4、R5代篩選，直至性狀穩定。一般來說經篩選至R3代后性狀已經保持穩定了。
通過本實施例，我們從株1S的愈傷組織中經高濃度2.，4-D誘變后篩選到了一系列矮桿溫敏核不育系(見表2)，其中SV14S的株高較矮而其它優良農藝性狀基本不變，是一個優良的矮化溫敏雄性核不育品種(圖5)。同時，通過本實施例我們以三系保持系中9B的幼穗誘導的愈傷組織，經高濃度2，4-D進行繼代誘變處理后，然后經繼代、分化和生根培養，獲得再生植株，并經過田間的篩選鑒定，于R4獲得了性狀優良且穩定的突變株SV9B。目前，其性狀正在田間做進一步的鑒定。
表2.體細胞變異系(R3)株高考察統計結果
權利要求
1.一種水稻體細胞無性系誘變育種方法，水稻體細胞無性系在組織培養過程中，提高繼代培養基中2，4-二氯苯氧乙酸濃度進行繼代誘變處理，使體細胞突變，再結合在低溫、高溫、高鹽、病蟲害的選擇壓力下對突變體進行篩選，實現無性系篩選育種。
2.根據權利要求1所述的一種水稻體細胞無性系誘變育種方法，所述提高繼代培養基中2，4-二氯苯氧乙酸濃度進行繼代誘變處理則是指胚性愈傷組織于基本培養基MS+2，4-二氯苯氧乙酸3.5-4.5mg/L培養基中繼代培養1個周期后，以24-26天為1個培養周期；再轉移至正常的繼代培養基中培養。
3.根據權利要求2所述的一種水稻體細胞無性系誘變育種方法，所述繼代誘變處理2，4-二氯苯氧乙酸濃度為4mg/L。
4.根據權利要求2或3所述的一種水稻體細胞無性系誘變育種方法，胚性愈傷組織為繼代2-3個周期的胚性愈傷組織。
5.根據權利要求1所述的一種水稻體細胞無性系誘變育種方法，所述的體細胞是指水稻的幼穗或成熟胚的細胞。
6.根據權利要求1所述的一種水稻體細胞無性系誘變育種方法，選用的培養基為MS基本培養基，誘導培養基為MS+2，4-二氯苯氧乙酸2mg/L，繼代培養基為MS+6-芐基腺嘌呤0.2mg/L+2，4-二氯苯氧乙酸2mg/L，分化培養基為MS+6-芐基腺嘌呤2mg/L，生根培養基為MS+吲哚-3-乙酸0.5mg/L+α-萘乙酸0.5mg/L。
7.根據權利要求1所述的一種水稻體細胞無性系誘變育種方法，經誘變得到的體細胞突變體根據需要采取不同的低溫、高溫、高鹽、病蟲害的選擇壓力進行篩選，可實現一定程度的定向誘變，從而縮短育種周期；該篩選過程可在離體培養中或大田栽培中進行。
8.根據權利要求1所述的一種水稻體細胞無性系誘變育種方法，體細胞突變體R1代經選擇壓力篩選后，于抽穗期套袋自交結實，并將符合目標性狀的變異株分單株采種。然后在相同選擇壓力下對R2，R3代再進行篩選，直至篩選到符合目標性狀且性狀不再分離的變異株為止。
全文摘要
一種水稻體細胞無性系誘變育種方法，是指利用組織培養技術并結合高濃度2，4－D處理和選擇壓力進行的水稻體細胞無性系篩選育種的方法。體細胞無性系在組織培養過程中往往發生體細胞變異，其變異頻率隨培養時間延長而提高。經高濃度2，4－D的MS培養基中繼代誘變，其變異頻率顯著提高。本發明方法以水稻的幼穗和成熟胚為外植體，在MS基本培養基中進行愈傷組織的誘導，愈傷組織再經高濃度2，4－D繼代處理，能顯著提高變異頻率，再結合一定的選擇壓力對細胞突變體進行篩選，實現了一定程度的定向誘變，從而提高了誘變效率，縮短了育種周期。本發明方法具有簡便可靠，誘導效率高，后代穩定快，育種周期短等優點，在作物育種中具有廣泛的應用前景。
文檔編號A01H1/06GK1748479SQ200510032230
公開日2006年3月22日 申請日期2005年10月10日 優先權日2005年10月10日
發明者劉選明, 楊遠柱, 林建中, 陳彩艷, 唐冬英 申請人:湖南大學