專利名稱：一種魚類的雌核發(fā)育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及魚類的培育，具體涉及魚類的雌核發(fā)育技術(shù)。
背景技術(shù)：
雌核發(fā)育技術(shù)在魚類提純育種、探討魚類的性別決定和魚類單性養(yǎng)殖方面等方面具有重要的作用。國內(nèi)外關(guān)于魚類雌核發(fā)育研究已有不少的報(bào)道，如鯉魚、草魚、鰱魚、虹鱒、羅非魚、紅鯽、白鱸魚等魚的雌核發(fā)育均有研究報(bào)道。一般雌核發(fā)育魚的培育是采用魚類單倍體卵子經(jīng)遺傳物質(zhì)滅活的精子激活，再經(jīng)過染色體的加倍處理，形成主要依靠卵子的遺傳物質(zhì)來發(fā)育的二倍體后代。用來激活卵子的精子，一般是異源精子，雖然異源精子經(jīng)過滅活處理，但還是存在“異精效應(yīng)”，這種“異精效應(yīng)”對雌核發(fā)育后代可能產(chǎn)生好的作用。在魚類提純育種中，一般認(rèn)為1代雌核發(fā)育魚的純合效應(yīng)能夠相當(dāng)于多代魚的自交提純的效應(yīng)，通過選育可以在雌核發(fā)育后代中獲得遺傳性狀改良的個(gè)體。在魚類雌核發(fā)育過程中，用到的卵子一般都是單倍體卵子，單倍體卵子在雌核發(fā)育過程中必需有一個(gè)染色體加倍處理的過程，而該處理過程對卵子發(fā)育有不利影響，降低了后代的存活率。
探索一種不經(jīng)染色體加倍處理過程的雌核發(fā)育方法，以提高后代的存活力是極具應(yīng)用價(jià)值的。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種二倍體卵子的雌核發(fā)育技術(shù)，不僅提高后代存活力，改良魚類性狀，而且還能提供二倍體卵子資源。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種魚類雌核發(fā)育方法，以四倍體鯽鯉產(chǎn)生的二倍體成熟卵子為材料，用經(jīng)紫外線滅活的散鱗鏡鯉或團(tuán)頭魴的精子與其混合，混合1～2分鐘后，被精子激活的二倍體卵子置于20～21℃水溫條件下孵化，孵化出的魚苗在池塘中養(yǎng)殖，獲得了產(chǎn)生二倍體卵子的第一代雌核發(fā)育二倍體鯽鯉G1，以雌核發(fā)育二倍體鯽鯉G1產(chǎn)生的二倍體卵子為材料，又經(jīng)上述方法獲得產(chǎn)生二倍體卵子的第二代雌核發(fā)育二倍體鯽鯉G2，經(jīng)同樣方法獲得G3，培育出產(chǎn)生二倍體卵子的雌性二倍體鯽鯉品系。
下面結(jié)合附圖進(jìn)一步詳述本發(fā)明
圖1第1代雌核發(fā)育二倍體鯽鯉(G1)染色體(2n＝100)
圖2第2代雌核發(fā)育二倍體鯽鯉(G2)染色體(2n＝100)四倍體鯽鯉(4n＝200)的原始母本為紅鯽(Carassius auratus red var.)，原始父本為湘江野鯉(Cyprinus carpio)。四倍體鯽鯉的體色為青灰色，其外形上有些特征介入鯉魚與紅鯽之間，如有兩對很短的須(湘江野鯉有2對明顯的須，而紅鯽無須)，雌、雄四倍體鯽鯉能分別產(chǎn)生二倍體卵子和二倍體精子，但是四倍體鯽鯉在抗逆性、生長速度等方面有待改良。
本發(fā)明以四倍體鯽鯉產(chǎn)生的二倍體卵子為原始材料，用散鱗鏡鯉或團(tuán)頭魴的精子激活四倍體鯽鯉、G1及G2產(chǎn)生的二倍體卵子進(jìn)行雌核發(fā)育。具體方法為擠出達(dá)到性成熟的雄性散鱗鏡鯉(Cyprinus carpio var.)或團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)的精液于培養(yǎng)皿中，用Hank’s液稀釋精液，Hank’s液與精液的比例為4∶1，稀釋的精液在培養(yǎng)皿中以薄層分布，把盛精液的培養(yǎng)皿放在墊有冰袋的搖床上(旋轉(zhuǎn)速度為30～40轉(zhuǎn)/分)，并置于2支功率分別為15瓦的紫外燈下照射處理，紫外燈與精液的距離為10～12厘米，照射時(shí)間為30分鐘。Hank’s液配方如下KCL 0.40g，NaCL 8.00g，NaHCO30.35g，KH2PO40.06g，Na2HPO4·7H2O 0.09g，Na2HPO4·12H2O 0.10g，MgSO4·7H2O 0.10g，MgCL2·6H2O0.10g，CaCL20.14g，Glucose 1.00g；加蒸餾水配至1升。
照射過的精液與四倍體鯽鯉產(chǎn)生的成熟卵子混合，并用干凈的雞毛充分?jǐn)嚢杈雍吐炎樱?～2分鐘后把卵子平鋪到盛有清水的培養(yǎng)皿中，無需染色體加倍處理，胚胎在20～21℃水溫下孵化。孵化出的魚苗在池塘中養(yǎng)殖。通過此方法，獲得大量存活的第一代雌核發(fā)育二倍體鯽鯉魚(G1)；G1具有大量產(chǎn)生二倍體卵子的特殊功能，他們產(chǎn)生的二倍體卵子在經(jīng)紫外線滅活的散鱗鏡鯉或團(tuán)頭魴的精子激活下，無需染色體加倍處理，獲得了大量的第二代雌核發(fā)育二倍體鯽鯉(G2)；G2也具有大量產(chǎn)生二倍體卵子的特殊功能，他們產(chǎn)生的二倍體卵子在經(jīng)紫外線滅活的散鱗鏡鯉或團(tuán)頭魴的精子激活下，無需染色體加倍處理，獲得了大量的第三代雌核發(fā)育二倍體鯽鯉(G3)。觀察實(shí)驗(yàn)魚的胚胎發(fā)育情況，并記錄胚胎發(fā)育至原腸胚的百分比和孵化率的情況。用腎細(xì)胞直接制片法對二倍體鯽鯉魚體細(xì)胞染色體數(shù)目進(jìn)行了檢測。腎細(xì)胞直接制片法的方法為在18～22℃水溫下培育實(shí)驗(yàn)魚1～3天后，對實(shí)驗(yàn)魚注射PHA 1～3次，每次劑量為2～8μg/克體重，間隔時(shí)間為12～24小時(shí)，在解剖取材前2～6小時(shí)，注射秋水仙素，劑量為2～4μg/克體重。取出腎組織，在生理鹽水下剪碎腎組織，0.075mol/L KCL低滲處理，在20℃溫度下低滲40～60分鐘；用冰醋酸∶甲醇(1∶3)固定腎細(xì)胞1～3次；在冰凍載玻片上滴片；Giemsa染液染色。
實(shí)驗(yàn)證明，50％～60％雌核發(fā)育二倍體鯽鯉胚胎能發(fā)育到原腸胚，12％～15％雌核發(fā)育二倍體鯽鯉胚胎能脫膜形成存活的后代。腎細(xì)胞直接制片法的檢測結(jié)果證明雌核發(fā)育二倍體鯽鯉魚體細(xì)胞染色體數(shù)目為2n＝100，這種雌核發(fā)育二倍體鯽鯉魚全部為雌性，他們的性成熟年齡一般為2年，比其原始母本-雌性四倍體鯽鯉的性成熟年齡(1年)推遲，但在生長速度和抗逆性方面明顯比四倍體鯽鯉要強(qiáng)，雌核發(fā)育二倍體鯽鯉的生長速度比四倍體鯽鯉快20～30％，雌核發(fā)育二倍體鯽鯉最顯著的繁殖特點(diǎn)在于他們能產(chǎn)生90～95％的二倍體卵子，這些二倍體卵子可以用來制備新型的四倍體和三倍體魚。如利用雌核發(fā)育二倍體鯽鯉產(chǎn)生的二倍體卵子與普通四倍體雄性鯽鯉產(chǎn)生的二倍體精子受精培育的新型四倍體鯽鯉的生長速度比普通四倍體鯽鯉的生長速度要快10～20％，而且他們的抗病、抗逆能力以及繁殖能力都明顯比普通四倍體鯽鯉要強(qiáng)。
通過細(xì)胞和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，二倍體鯽鯉雜交魚產(chǎn)生二倍體卵子的特性可能與生殖細(xì)胞的核內(nèi)復(fù)制有關(guān)。
本發(fā)明方法培育的雌核發(fā)育二倍體鯽鯉生長速度快，抗病力強(qiáng)，繁殖力高，且能產(chǎn)生大量的二倍體卵子，二倍體卵子的雌核發(fā)育中可以省略染色體加倍的處理過程，大大降低了對卵子發(fā)育不利的影響，從而大大提高了雌核發(fā)育個(gè)體的存活率。雌核發(fā)育二倍體鯽鯉魚體系的形成創(chuàng)建了一種能夠產(chǎn)生大量二倍體卵子的新型二倍體鯽鯉雜交魚品系，為制備新型三倍體和四倍體魚提供了重要的二倍體卵子資源。
權(quán)利要求
1.一種魚類雌核發(fā)育方法，其特征在于以四倍體鯽鯉產(chǎn)生的二倍體成熟卵子為材料，用經(jīng)紫外線滅活的散鱗鏡鯉或團(tuán)頭魴的精子與其混合，混合1～2分鐘后，將被精子激活的二倍體卵子置于20～21℃水溫條件下孵化，孵化出的魚苗在池塘中養(yǎng)殖，獲得了產(chǎn)生二倍體卵子的第一代雌核發(fā)育二倍體鯽鯉G1，以雌核發(fā)育二倍體鯽鯉G1產(chǎn)生的二倍體卵子為材料，又經(jīng)上述方法獲得產(chǎn)生二倍體卵子的第二代雌核發(fā)育二倍體鯽鯉G2，經(jīng)同樣方法獲得G3，培育出產(chǎn)生二倍體卵子的雌性二倍體鯽鯉品系。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種魚類雌核發(fā)育技術(shù)。本發(fā)明以四倍體鯽鯉魚的二倍體卵子為材料，用經(jīng)紫外線滅活的散鱗鏡鯉或團(tuán)頭魴的精子使其激活，被激活的卵子孵化出的魚苗經(jīng)飼養(yǎng)，發(fā)育成能產(chǎn)生二倍體卵子的后代G
文檔編號A01K61/00GK1709047SQ200510031690
公開日2005年12月21日 申請日期2005年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月10日
發(fā)明者劉少軍, 劉筠, 周工健, 羅凱坤, 孫遠(yuǎn)東, 張純 申請人:湖南師范大學(xué)