Uro基因及其用途的制作方法

專利名稱：Uro基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及新的擬南芥UPRIGHTROSETTE(URO，葉片向上生長(zhǎng))基因及其用途。本發(fā)明還涉及降低植物中木質(zhì)素含量或增加植物分枝數(shù)量的方法。此外，本發(fā)明還涉及一種改良植物的方法。
背景技術(shù)：
與可以移動(dòng)的動(dòng)物不同的是，植物的生長(zhǎng)是原地不動(dòng)的，所以植物的生長(zhǎng)發(fā)育相對(duì)與動(dòng)物來說具有一套更精細(xì)和更敏感的自我調(diào)節(jié)的發(fā)育調(diào)控機(jī)制。植物體形態(tài)結(jié)構(gòu)的建成不僅受其內(nèi)在調(diào)控機(jī)制的制約，還受到外界環(huán)境條件的影響，光照和溫度給予植物發(fā)育自身調(diào)節(jié)的信號(hào)。植物激素在這一感應(yīng)過程起到了重要的作用。
擬南芥(Arabidopsis thaliana)作為一種模式植物，是進(jìn)行植株形態(tài)結(jié)構(gòu)建成研究的理想材料，研究進(jìn)展也很迅速。對(duì)于擬南芥植株的地上部分而言，其生長(zhǎng)發(fā)育可以看成是由一個(gè)個(gè)的發(fā)育單位重復(fù)生長(zhǎng)形成，這一發(fā)育單位由莖頂端組織發(fā)育而來，含有一片葉片、一段節(jié)間以及一個(gè)側(cè)生分生組織。這一發(fā)育單位在擬南芥植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)期形成蓮座葉、蓮座葉側(cè)枝以及很短的節(jié)間；進(jìn)入生殖生長(zhǎng)后先形成莖生葉、莖生葉側(cè)枝和長(zhǎng)的節(jié)間；然后形成退化的葉、長(zhǎng)的節(jié)間和終止生長(zhǎng)的花器官。對(duì)擬南芥突變體的分析使我們對(duì)這一發(fā)育過程有了初步的了解。
莖頂端分生組織是所有器官生長(zhǎng)的來源，因此，調(diào)控莖頂端分生組織正常建立和分化的基因突變后植株都不能進(jìn)行正常的生長(zhǎng)發(fā)育，如CLV、WUS、STM等。對(duì)于擬南芥植株而言，其地上部分的形態(tài)結(jié)構(gòu)建成還有賴于位于葉片葉腋處的側(cè)生分生組織的正常建立和發(fā)育。側(cè)枝的發(fā)育不僅在很大程度上影響了植物最終的形成結(jié)構(gòu)建成，對(duì)于農(nóng)作物而言還影響到其最終的產(chǎn)量。
研究表明，擬南芥植株莖頂端分生組織的發(fā)育與側(cè)生分生組織的發(fā)育有一定的共同調(diào)節(jié)機(jī)制，如REV基因的缺失不僅影響到莖頂端分生組織的發(fā)育，還特異的影響到側(cè)生器官的發(fā)育。而對(duì)las4突變體的研究表明，側(cè)生分生組織的發(fā)育與莖頂端分生組織發(fā)育有著不同的調(diào)控機(jī)制，LAS基因缺失的擬南芥突變體其莖頂端分生組織發(fā)育正常。LAS基因與西紅柿中的LS基因同源，與水稻中的MOC基因也同源，表明在植物界中普遍存在著這一側(cè)枝發(fā)育調(diào)控系統(tǒng)。但目前在擬南芥中只發(fā)現(xiàn)了很少的起到內(nèi)在調(diào)控植株形態(tài)結(jié)構(gòu)建成的基因。
除了對(duì)內(nèi)在調(diào)控機(jī)制有一定的了解外，人們對(duì)植物形態(tài)結(jié)構(gòu)建成的外在調(diào)控信號(hào)也有了一定的認(rèn)識(shí)。植物能敏感的感應(yīng)外界環(huán)境的變化，植物激素如生長(zhǎng)素在其中起到了重要的調(diào)控作用。早在1934年Thimann和Skoog就發(fā)現(xiàn)植物的頂端優(yōu)勢(shì)是由植物激素生長(zhǎng)素介導(dǎo)的，后期的許多生理實(shí)驗(yàn)也證明生長(zhǎng)素在植物的各個(gè)發(fā)育過程都起到了重要的作用。生長(zhǎng)素的含量、信號(hào)傳遞以及極性運(yùn)輸都為植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育提供了信號(hào)。早期的頂端優(yōu)勢(shì)理論就認(rèn)為，生長(zhǎng)素能在植株的莖頂端合成，向下進(jìn)行極性運(yùn)輸后抑制側(cè)生分生組織的進(jìn)一步發(fā)育。但隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)在擬南芥植株中，生長(zhǎng)素對(duì)植物頂端優(yōu)勢(shì)的調(diào)控作用不是直接的，近期的新發(fā)現(xiàn)表明，在植物體中存在一類新的類胡蘿上素類的衍生物在頂端優(yōu)勢(shì)的調(diào)控中起到重要的作用。
雖然目前仍未發(fā)現(xiàn)植物中的生長(zhǎng)素受體，但通過不同的方法，研究者對(duì)生長(zhǎng)素指導(dǎo)生長(zhǎng)發(fā)育的信號(hào)傳遞過程還是有了一定的認(rèn)識(shí)。信號(hào)傳遞過程中的AUX/IAA與ARF基因在生長(zhǎng)素含量較低時(shí)結(jié)合在一起，當(dāng)生長(zhǎng)素含量升高時(shí)，AUX/IAA會(huì)被體內(nèi)的E3泛素降解酶系統(tǒng)識(shí)別，ARF基因被釋放出來調(diào)節(jié)其下游基因GH3類基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)植株的生長(zhǎng)發(fā)育過程。最新的研究顯示，擬南芥中許多的GH3類基因是將自由態(tài)生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)化為結(jié)合態(tài)生長(zhǎng)素的酶類，表明擬南芥中存在著生長(zhǎng)素的自我調(diào)節(jié)過程。但生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)植物發(fā)育的下游基因研究甚少，其調(diào)節(jié)植物發(fā)育的具體作用機(jī)制更少見報(bào)道。
木質(zhì)素是高等植物合成的一種次生代謝產(chǎn)物，生理功能主要是參與建立堅(jiān)實(shí)的植物莖桿，防止植物倒伏。木質(zhì)素同時(shí)又是造紙產(chǎn)業(yè)和牧草有效利用不利因素。造紙業(yè)需要?jiǎng)佑脧?qiáng)酸、堿消除木質(zhì)素，這樣將造成環(huán)境污染，牲畜無法利用牧草中的木質(zhì)素作為有效的營(yíng)養(yǎng)成分。造紙業(yè)和牧業(yè)需要低木質(zhì)素的種質(zhì)資源，但是目前尚沒有有效的方法可以解決這一問題。

發(fā)明內(nèi)容
一方面，本發(fā)明提供一種分離的URO蛋白，它含有具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽。
在一優(yōu)選的實(shí)施例中，所述URO蛋白具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽。在另一優(yōu)選的實(shí)施例中，所述URO蛋白具有將SEQ ID NO2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的、且具有影響植物木質(zhì)素含量或分枝數(shù)量的由(a)衍生的多肽。所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸指，如1-10個(gè)、1-8個(gè)、1-5個(gè)等。
另一方面，本發(fā)明涉及一種分離的多核苷酸，該核苷酸序列編碼本發(fā)明的URO蛋白。
在一實(shí)施例中，本發(fā)明的多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽和驅(qū)動(dòng)該基因表達(dá)的上游啟動(dòng)子區(qū)序列。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的多核苷酸該多核苷酸選自以下序列中的一種(a)有SEQ ID NO1所示的序列；(b)在SEQ ID NO3中第1-3519位所示的序列；(c)具有SEQ ID NO3中1-4836位所示序列。
另一方面，本發(fā)明涉及一種載體，該載體含有含有本發(fā)明的多核苷酸。
又一方面，本發(fā)明涉及一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，它含有本發(fā)明的載體，或者其基因組中整合有本發(fā)明的多核苷酸。
再一方面，本發(fā)明涉及一種降低植物中木質(zhì)素含量或增加植物分枝數(shù)量的方法，該方法包括增加所述植物中URO基因或其同源基因的表達(dá)。在一優(yōu)選實(shí)施例中，通過插入T-DNA序列而增強(qiáng)該URO基因或其同源基因的表達(dá)。
又一方面，本發(fā)明涉及一種改良植物的方法，該方法包括如下步驟(1)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有URO蛋白DNA編碼序列，所述的影響植物木質(zhì)素含量或分枝數(shù)量蛋白選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的、且具有影響植物木質(zhì)素含量或分枝數(shù)量的由(a)衍生的多肽；(2)將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟(1)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使該URO蛋白DNA編碼序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；(3)選擇出轉(zhuǎn)入所述URO蛋白DNA編碼序列的植物細(xì)胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細(xì)胞或組織或器官再生成植株。


圖1顯示野生型和uro突變體三星期幼苗的表型。(A)Lansberg erect；(B)uro/+；(C)uro/uro。比例尺A-C＝0.2cm。
圖2顯示uro突變體中木質(zhì)素的含量降低。圖中箭頭所指紅色部分為間苯三酚染色的木質(zhì)素，左圖是野生型，可見大量木質(zhì)素存在，右圖為uro突變體，原本大量存在的木質(zhì)素量在突變體中明顯減少。e，表皮；co，皮層；en，內(nèi)皮層；ph，韌皮部；x，木質(zhì)部；if，束間纖維；ip，束間纖維前體細(xì)胞；mx，后生木質(zhì)部；pi，髓。比例尺A、C、E、G、I-J＝100um B、D、F、H＝50um。
圖3顯示uro突變體分枝數(shù)量增加。(A)野生型；(B)uro突變體。
圖4顯示通過TAIL-PCR實(shí)驗(yàn)得到的T-DNA插入旁鄰序列。(A)T-DNA的結(jié)構(gòu)與被插入的At3g23140基因。(B)克隆的旁鄰序列與擬南芥基因組序列的比對(duì)。
圖5顯示At3g23140基因序列、T-DNA的左臂序列和插入位置。(A)T-DNA左臂序列。(B)At3g23140基因序列。注含尾橫向箭頭所示處為At3g23140基因起始編碼框；不含尾堅(jiān)向箭頭所示為T-DNA左臂插入基因組位點(diǎn)。
圖6顯示At3g23140基因的氨基酸序列與其他同源基因的比對(duì)。
圖7顯示轉(zhuǎn)基因構(gòu)建示意圖。IAAH-pURO-23145構(gòu)建含有T-DNA插入的IAAH片段，At3g23140以及At3g23145基因的部分序列，該片斷轉(zhuǎn)化野生型擬南芥能夠獲得與uro突變體項(xiàng)類似的表型；以下轉(zhuǎn)化構(gòu)建均為對(duì)照，包括IAAH-p構(gòu)建只含有T::URO構(gòu)建中的T-DNA中的IAAH序列及URO基因起始編碼區(qū)前的序列；pURO構(gòu)建無35S啟動(dòng)子，起始序列為T-DNA插入后的序列；35S::URO為URO基因過量表達(dá)的構(gòu)建；35S::At3g23145的構(gòu)建為At3g23145基因過量表達(dá)的構(gòu)建；35S::fURO-rURO的構(gòu)建為URO基因的雙鏈構(gòu)建，起到抑制URO基因表達(dá)的作用。
圖8顯示轉(zhuǎn)化子植株表型。(A)Ler野生型(B)uro雜合突變體(C)uro純合突變體(D)IAAH-pURO-23145轉(zhuǎn)入Ler野生型獲得的轉(zhuǎn)化子(E)IAAH-p轉(zhuǎn)入Ler野生型獲得的轉(zhuǎn)化子(F)35S::23145轉(zhuǎn)入Ler野生型獲得的轉(zhuǎn)化子(G)-(I)26天時(shí)的IAAH-p轉(zhuǎn)入Ler野生型獲得的轉(zhuǎn)化子除(G)-(I)外所有植株生長(zhǎng)期為三周，比例尺＝0.5cm。(J)轉(zhuǎn)化子中URO基因的表達(dá)模式。
圖9顯示過量及反義轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)基因植株表型。(A)野生型Ler植株(B)雜合uro/+突變體(C)純合uro突變體(D)35S::URO轉(zhuǎn)化野生型Ler所得的轉(zhuǎn)化子植株(E)-(G)和(I)-(K)35S::fURO-rURO構(gòu)建轉(zhuǎn)化到uro純合突變體所得的轉(zhuǎn)化子植株(H)和(L)35S::fURO-rURO構(gòu)建轉(zhuǎn)化到野生型Ler所得的轉(zhuǎn)化子植株(M)轉(zhuǎn)化子植株莖中URO基因表達(dá)模式，所用引物為URO-3和URO-4(N)轉(zhuǎn)化子中T-DNA插入的鑒定，引物為T-DNA-5和URO-2(圖5所示)比例尺(A)-(B)，(E)-(H)＝5mm；(D)＝1mm；(I)-(L)＝1cm。
圖10顯示啟動(dòng)子表達(dá)模式。(A)花序組織(B)單個(gè)花器官(C)-(D)果莢，可見URO基因在雄蕊及細(xì)嫩的胚中表達(dá)明顯。(E)35S::URO構(gòu)建轉(zhuǎn)化子的表型(F)35S::URO構(gòu)建引入DR5::GUS植株獲得的轉(zhuǎn)化子GUS染色(G):(F)的放大 比例尺A＝1cm，B＝0.5cm，C-D＝1mm。
具體實(shí)施例方式
通過研究，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種新的參與擬南芥?zhèn)戎Πl(fā)育的內(nèi)在調(diào)控因子At3g23140。分析表明，不同At3g23140的表達(dá)量決定了植物生長(zhǎng)的不同形態(tài)。在野生型狀態(tài)下，At3g23140的表達(dá)量非常低；當(dāng)過量表達(dá)At3g23140時(shí)，植株生長(zhǎng)矮小，發(fā)育停止。當(dāng)At3g23140表達(dá)量小幅度增加時(shí)(在uro突變體中)，植物略矮小，莖桿非常柔軟。申請(qǐng)人將此At3g23140基因命名為URO基因。
本發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)控URO基因的表達(dá)量可獲得木質(zhì)素含量低、分枝增加的植株。這一發(fā)現(xiàn)在產(chǎn)業(yè)應(yīng)用上具有重要的意義。例如，在用木材為材料的造紙工藝中為了消除木質(zhì)素，要使用大量的強(qiáng)酸、強(qiáng)堿處理，造成對(duì)環(huán)境的嚴(yán)重污染，低木質(zhì)素的木材可以減輕造紙工業(yè)對(duì)環(huán)境帶來的污染?？赏ㄟ^調(diào)控URO基因的表達(dá)而降低造紙用木材中的木質(zhì)素含量。從而克服上述不足。此外，牧草中木質(zhì)素是不能被牲畜所利用的部分。也可采用本發(fā)明的方法降低牧草中木質(zhì)素含量，從而提高飼料的利用率。此外，還可通過調(diào)控URO基因來改良某些蔬菜的品質(zhì)使之口感柔軟、通過增加植物的分枝數(shù)量和柔軟程度來改造觀賞花卉和樹種。
以下將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
I.定義如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的URO蛋白或多肽”是指URO蛋白基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化URO蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括URO蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然URO蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“URO蛋白”指具有URO蛋白活性的SEQ ID NO2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與URO蛋白相同功能的、SEQ ID NO2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)，還更佳如1-8個(gè)、1-5個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括URO蛋白的活性片段和活性衍生物。
多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與URO蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗URO蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含URO蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了URO蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有URO蛋白序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供URO蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然URO蛋白的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“URO蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。如本文所用，“簡(jiǎn)并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長(zhǎng)度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼URO蛋白的多聚核苷酸。
應(yīng)理解，雖然本發(fā)明的URO基因優(yōu)選得自擬南芥，但是得自其它植物的與擬南芥URO基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本發(fā)明考慮的范圍之內(nèi)。比對(duì)序列相同性的方法和工具也是本領(lǐng)域周知的，例如BLAST。
本發(fā)明的URO蛋白核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或URO蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的URO蛋白。一般來說有以下步驟
(1).用本發(fā)明的編碼URO蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，URO蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含URO蛋白編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。轉(zhuǎn)化植物也可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法。對(duì)于轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得快速生長(zhǎng)性/抗衰老性改變的植物。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的URO蛋白或多肽有多方面的用途。例如用于篩選促進(jìn)或?qū)筓RO蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組URO蛋白篩選多肽庫(kù)可用于尋找有價(jià)值的能抑制或刺激URO蛋白功能的多肽分子。
本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析。用URO蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測(cè)URO蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)或植物分子生物學(xué)-實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Plant MolecularBiology-A Laboratory Mannual，Melody S.Clark編，Springer-verlag BerlinHeidelberg，1997)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
II.實(shí)施例(A)材料與方法本發(fā)具體實(shí)施方式
中使用到以下的材料和方法。但應(yīng)理解，可采用這些方法的其它合適替換形式來實(shí)施本發(fā)明。本發(fā)明范圍并不受到這些具體實(shí)施例的限制。
一.植物材料的培養(yǎng)試劑PNS營(yíng)養(yǎng)液每升含2.5ml 1M磷酸緩沖液(pH5.5)，5ml 1M KNO3，2ml 1MMgSO4·7H2O，2ml 1M Ca(NO3)2·4H2O，2.5ml 20mM Fe.EDTA，1ml MS微量元素。
人工土3份蛭石，1份珍珠巖和1份黑土混合。
步驟將擬南芥種子種于澆過飽和PNS營(yíng)養(yǎng)液的人工土中，當(dāng)年收獲的種子種植后40C春化72h，隔年種子種植后春化24h.然后轉(zhuǎn)入人工培養(yǎng)室中在相對(duì)濕度80％，恒溫20-240C，光照強(qiáng)度80-200umol/M2/S，光照周期為8h黑暗、16h光照培養(yǎng)。
二.掃描電鏡樣品制作方法1.材料固定FAA固定液固定樣品，2小時(shí)以上。
2.材料脫水70％，80％，95％，100％乙醇梯度脫水，每級(jí)2小時(shí)，脫水劑體積高于材料的3倍。
3.臨界點(diǎn)干燥4.上銅臺(tái)將樣品用導(dǎo)電膠固定于銅臺(tái)上，并將樣品調(diào)整至適于觀察的位置。樣品噴金。
5.掃描電鏡觀察。
三.擬南芥轉(zhuǎn)化試劑滲透培養(yǎng)基(1L)1/2xMurashige-Skoog；5％蔗糖；0.5克MES；用KOH調(diào)至pH5.7再加10微升1mg/ml的6-BA母液；200微升Silwet L-77；Topagar(0.1％瓊脂PNS或水溶液)篩選培養(yǎng)基平板1xMS salt，或1XPNS(pH5.8)；0.8％瓊脂；卡那霉素30mg/l(Columbia，Landsberg)，潮霉素20mg/ml；活性氯5.2％原液，用無菌水臨時(shí)稀釋7％使用。
步驟1.植物生長(zhǎng)
1)建議在直徑7厘米的培養(yǎng)杯里種5處，每處種幾棵，萌發(fā)一周后，每處只留下一棵最好的苗。
2)將萌發(fā)的植物培養(yǎng)至莖高約3厘米時(shí)，去除其頂生花序。注意要避免傷及葉生花序。去除頂生花序?qū)⒋碳と~生花序的生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)化必須在去除頂生花序4天后進(jìn)行。
3)轉(zhuǎn)化前，將已授粉花以及果莢去除掉。并使土壤吸足水。
4)轉(zhuǎn)化操作5)制備好已轉(zhuǎn)化了相應(yīng)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液10ml，在轉(zhuǎn)化前一天，轉(zhuǎn)入大瓶培養(yǎng)過夜，第二天取出使用時(shí)農(nóng)桿菌液O.D600當(dāng)在1.2到1.6之間。室溫5000rpm離心15分鐘。棄上清，將農(nóng)桿菌沉淀懸浮于相應(yīng)體積的滲透培養(yǎng)基里，使O.D600在0.8左右。
6)用噴霧器將菌液均勻噴灑在待轉(zhuǎn)化植株上，移入恒溫室豎直培養(yǎng)。
7)培養(yǎng)3到4周后，收種子。放在干燥環(huán)境存放2周。
2.轉(zhuǎn)化子的篩選1)篩選前一般都要消毒先用70％乙醇浸泡2分鐘，再用次氯酸鈉溶液處理15分鐘，在上述處理時(shí)要不停地懸浮種子，最后用無菌水洗四次。處理后的種子用Top agar均勻涂布在固體篩選培養(yǎng)基表面。一塊150mm直徑的平皿最多種1500棵。低溫4度春化2到3天，移入恒溫室培養(yǎng)。
2)正常情況下最多4天種子就會(huì)萌發(fā)，萌發(fā)后5到7天，轉(zhuǎn)化子將很容易鑒別出來深綠色的子葉，根較長(zhǎng)。非轉(zhuǎn)化子葉發(fā)黃，根短，不能長(zhǎng)期存活。若已確定轉(zhuǎn)化子，而生長(zhǎng)不佳時(shí)，可將其轉(zhuǎn)入不加抗生素的平板，使其茁壯。但若已長(zhǎng)霉菌，則應(yīng)立即轉(zhuǎn)入土壤。
四.植物組織提取DNA試劑Lysis BufferTris-Hcl，pH8.0(0.2M)；尿素(7M)；十二烷基肌氨酸鈉(2％)；EDTA(0.05M)步驟1.植株的綠葉或花等組織適量，置于1.5ml的離心管中，加200ul裂解液，用小棒研磨成漿，再用400ul裂解液沖洗小棒2.加600ul的酚-氯仿，劇烈震蕩20sec，使蛋白質(zhì)變性3.12000rpm離心5min后取上清。
4.加50ul醋酸鈉，600ul異丙醇，混勻，12000rpm離心5min5.去上清，沉淀溶于400ul TE(Tris-EDTA)中6.再加40ul 3mol/L NaAC(PH5.2)，1ml無水乙醇，混勻，12000rpm離心5min。
7.去上清，用70％乙醇洗沉淀一次，離心；去清液，8.室溫干燥，沉淀溶于50ul無菌水中。
五.植物組織提取RNA試劑DEPC水RNA Extraction BufferTris Cl Ph 8.0(0.2M)；LiCl(0.4M)；EDTA(25Mm)；SDS(1％)；(DEPC水配制)3M NaAc pH5.2(DEPC水配制)(DEPC水配制)RNase free的水飽和酚，和酚氯仿。
步驟1.液氮中將材料研磨充分，2.研好的材料用烘過的藥勺撥適量到EP管中，管中已預(yù)先加好400ulRNA Extraction Buffer和400ul水飽和酚。
3.vortex多次。
4.13200rpm離心5分鐘，取上清(建議用酚抽兩次)5.加入0.5ml酚氯仿，震蕩，離心5分鐘。
6.取上清，加入40ul3MNaAc和1ml乙醇，混勻，-20℃放置一段時(shí)間。
7.13200rpm離心10分鐘，棄上清。
8.加入0.4ml 2M LiCl，盡量將DNA溶解。
9.離心，10分鐘，棄上清，加入100ul DEPC H2O，10ul3M NaAc，250ul預(yù)冷的無水乙醇，混合均勻，-20℃放置一段時(shí)間。
10.離心，10分鐘，棄上清。
11.70％乙醇洗一次，離心，棄上清.超凈臺(tái)吹干。
12.DEPC水溶解，-20℃短期保存，-70℃長(zhǎng)期存放。
六.RT-PCR試劑PROMEGA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，一般PCR試劑。
DNase(RNase free)步驟1.取RNA模板，用DNase(RNase free)處理30分鐘，之后酚氯仿抽提，沉淀，吹千，DEPC水溶解。
2.反轉(zhuǎn)錄體系(20ul)MgCl(4ul)；10XBuffer(2ul)；10XdNTP(2ul)；Oligle(1u1)；total RNA(1ul)；RNase Inhibitor(1ul)；RTase(1ul)；ddH2O(DEPC)(8ul)；模板在加入體系前需在68℃加熱10分鐘。
3.用反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行一般PCR。
七.隨機(jī)引物法標(biāo)記探針探針標(biāo)記采用TAKARA公司的隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒Ver.2，1.于1.5ml離心管中加入5ml H2O；2ml引物(N6)；5mlDNA(0.1mg-1mg)2.充分混勻，98℃ 3分鐘。
3.離心1秒鐘，將離心管蓋上的汽化水甩下。
4.加入2.5ml dCTG(各2.SmM)；3ml緩沖液；6ml H2O；1mlKlenow酶；充分混勻，置于冰上，拿到同位素室。
5.加入1ml 32P-dATP37℃10分鐘。
6.加入100ml TE，混勻上到已在大管中加好4ml 6N NaOH的Sepherdex-G50柱，室溫下3000rpm離心3分鐘。
7.再加入100mlTE。室溫下3000rpm離心3分鐘。
8.將大管中標(biāo)好的探針加到雜交管中雜交即可。
八.Southern雜交試劑0.25N HCl；0.4N NaOH；預(yù)雜交液(20XSSC)；洗膜液(0.2XSSC、0.2％SDS)步驟1.將擬南芥的基因組DNA完全酶切。
2.1％瓊脂糖凝膠電泳。當(dāng)目的片段較大時(shí)，將膠置于0.25N HCl，使片段斷裂，轉(zhuǎn)膜更充分。
3.0.4N NaOH，浸泡30分鐘，
4.在0.4N NaOH中轉(zhuǎn)膜，過夜。
5.將膜在紫外交聯(lián)儀上交聯(lián)，或80℃烤2小時(shí).膜存放于4℃，備用。
6.65℃預(yù)雜交1小時(shí)，7.65℃雜交過夜。
8.室溫洗膜1分鐘。
9.65℃洗膜15分鐘。
10.將雜交膜用保鮮膜封好后于-70℃放射自顯影，或壓磷屏。
九.Northern試劑10XMOPS；甲酰胺；甲醛；上樣指示劑0.25％溴酚藍(lán)，0.25％二甲苯青；20XSSC；雜交液(7％SDS，1％BSA，1mM EDTA，0.25M NaHPO4(pH 7.2))步驟1.倒膠，將膠在水中加熱融化后，冷卻到60℃后，加入10xMOPS，和3％甲酰胺?；靹虻鼓z。
2.將200ml10xMOPS，350甲酰胺，1ml甲醛，和100ml上樣指示劑以及15-20ml(約5mgRNA)混勻后65℃加熱15分鐘。
3.上樣，電壓盡量小。
4.將膠在水中洗2次.將需要染色的泳道切下，EB(0.5mg/ml)染色，拍照。
5.不染色部分直接在10XSSC中轉(zhuǎn)膜，過夜。
6.以后操作同SOUTHERN雜交。
十.TAIL-PCRTAIL-PCR依照Liu等敘述的方法[178]。T-DNA左端嵌套引物序列是T-DNA-1，TCGAGGCGATCGTGAAGTTTCT；T-DNA-3，CGCCTATAAATACGACGGATCGTAA；和T-DNA-5，TAATAACGCTGCGGACATCTA。
這三個(gè)引物分別與八個(gè)隨機(jī)的簡(jiǎn)并引物AD1-AD8當(dāng)中的一個(gè)配對(duì)組合進(jìn)行PCR[178]，擴(kuò)增T-DNA左端的旁臨序列。TAIL-PCR產(chǎn)物于1.5％的瓊脂糖凝膠上電泳進(jìn)行分析。TAIL-PCR產(chǎn)物的回收方法如下在出現(xiàn)特異條帶的泳道的前面挖個(gè)洞，洞中注滿0.7％低熔點(diǎn)膠，冷卻后繼續(xù)電泳直到DNA條帶進(jìn)入低熔點(diǎn)膠，回收此低熔點(diǎn)膠并于液氮中快速冷凍，然后于Eppendorf小型離心機(jī)上13200rpm下離心5分鐘，上清液用酒精沉淀?；厥蘸筮B接到T載體上進(jìn)行測(cè)序。
十一.GUS染色試劑90％丙酮水溶液GUS染液750mg/ml X-Gluc，100mM NaHPO4(pH 7)，3mM K3F3(CN)6，10mM EDTA，0.1％Nonidet-P40。
100ml GUS染液5.77ml 1M Na2HPO4，4.23ml 1M NaH2PO4，加水80ml，0.1gK3F3(CN)6，0.3g EDTA，0.1ml N-P40，定溶100ml，加入0.075g X-Gluc步驟1.取新鮮組織，于90％丙酮水溶液中15min，冰上。
2.轉(zhuǎn)入GUS染液中，500mmHg真空抽氣。
3.37℃染色過夜。
(B)具體實(shí)施例實(shí)施例1uro突變體植株的獲得采用前述材料和方法，在Lansberg erect遺傳背景下T-DNA插入的突變體庫(kù)中篩得到uro(up-rightrossette)突變體，因其蓮座葉生長(zhǎng)不同于野生型葉片的生長(zhǎng)模式，表現(xiàn)出上舉生長(zhǎng)而得名(見圖1)。
實(shí)施例2uro突變體植株的形態(tài)學(xué)觀察(1)幼苗的生長(zhǎng)在相同的光照培養(yǎng)條件下(22℃)，野生型196粒種子全都能萌發(fā)成苗，而純合uro突變體的萌發(fā)率僅為89.5％(162/181)。比較野生型與uro純合突變體的種子表明，部分uro突變體的種子較野生型種子小。能正常生長(zhǎng)的純合uro突變體其下胚軸生長(zhǎng)較野生型快，但后期生長(zhǎng)減慢，在第6-8天左右表現(xiàn)出與野生型相同的下胚軸長(zhǎng)度。突變體與野生型在發(fā)育早期的差異暗示著URO基因從胚胎發(fā)育期開始就起到調(diào)控作用。
與野生型Ler相比，雜合的uro突變體植株株型矮小，沒有明顯的頂端優(yōu)勢(shì)。成熟的野生型植株具有明顯的一根長(zhǎng)的主莖，在主莖上長(zhǎng)一些短的側(cè)枝。而uro雜合的突變體沒有明顯的主枝生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，而且分枝靠近莖的基部。純合的uro突變體表現(xiàn)出與雜合的uro突變體相似的植株表型，而且更加嚴(yán)重，長(zhǎng)成矮小的一叢。對(duì)ColXuro的F2代進(jìn)行觀察表明，uro突變體的生長(zhǎng)模式與在Ler遺傳背景下相似，表明URO基因調(diào)控的發(fā)育過程與生態(tài)型背景無關(guān)。這一表型暗示著URO基因參與了擬南芥植株頂端優(yōu)勢(shì)建立的調(diào)控過程。
(2)葉的生長(zhǎng)不論是純合還是雜合的uro突變體，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期除子葉外葉片的生長(zhǎng)均表現(xiàn)出向上生長(zhǎng)的特點(diǎn)。與野生型相比，突變體的蓮座葉數(shù)目沒有變化，但葉片更加寬而且略有革質(zhì)化。突變體的莖生葉數(shù)目多于野生型，而且突變體的葉片寬而且略扭曲。對(duì)葉脈的分析表明，無論是雜合(結(jié)果未顯示)還是純合的突變體其葉脈的發(fā)育與野生型相比沒有發(fā)生改變。另外，野生型的每個(gè)莖生分枝的基部常常伴隨一片莖生葉，而在純合的uro突變體中，經(jīng)常可以觀察到在本應(yīng)長(zhǎng)莖生分枝的部位生長(zhǎng)出荷葉狀葉的結(jié)構(gòu)，這種葉的葉柄生長(zhǎng)在葉片的腹部。這些表型表明URO基因不參與擬南芥植株葉片發(fā)育的調(diào)控過程。但純合突變體中出現(xiàn)了荷葉狀葉，已有報(bào)道表明，當(dāng)生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸受抑制時(shí)植株可能出現(xiàn)荷葉狀葉，uro純合突變體主莖的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重的抑制，因此在uro純合突變體中生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸可能也受到了抑制。
(3)莖的生長(zhǎng)與野生型相比，uro突變體的莖在生長(zhǎng)早期就表現(xiàn)出明顯的增粗。蓮座葉與蓮座葉間的節(jié)間距較野生型大。雜合uro突變體的第一莖生分枝點(diǎn)較野生型明顯低。并且抽苔后雜合的uro突變體的枝生長(zhǎng)無明顯的主從枝關(guān)系。純合的uro突變體的主枝生長(zhǎng)往往會(huì)提前終止，側(cè)枝長(zhǎng)于主枝。uro突變體莖生長(zhǎng)的另一個(gè)明顯特征是莖軟，在培養(yǎng)土中水份含量低時(shí)整個(gè)植株就會(huì)萎焉(結(jié)果未顯示)。
對(duì)野生型及uro雜合突變體的葉片數(shù)目及分枝數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明與野生型相比，uro雜合突變體的蓮座葉及蓮座葉分枝沒有增長(zhǎng)，而莖生葉及莖生分枝均多于野生型。對(duì)次級(jí)分枝的統(tǒng)計(jì)也表明，Col生態(tài)型背景下，uro突變體的次級(jí)分枝明顯增多。可見URO基因參與調(diào)控了擬南芥次級(jí)分枝發(fā)育的調(diào)控過程。可參見圖3。
在野生型中，束間纖維的產(chǎn)生與植株生長(zhǎng)發(fā)育的時(shí)期成正相關(guān)，它的發(fā)育也正是植株莖迅速伸長(zhǎng)需要機(jī)械支持力的時(shí)期。莖中的纖維組織可以通過特異的染料甲苯胺藍(lán)進(jìn)行染色觀察。因?yàn)橛^察到uro突變體莖軟而且變粗，我們通過徒手切片的方法在細(xì)胞學(xué)水平上觀察突變體的莖與野生型有什么不同。對(duì)5周生長(zhǎng)期的野生型及uro突變體觀察的結(jié)果表明野生型不論是在莖的基部還是頂部都能在束間纖維組織及維管組織中觀察到明顯的藍(lán)色。而在uro雜合突變體的莖中沒有觀察到如野生型中的拱形生長(zhǎng)的束間纖維組織。雖然在突變體莖基部的橫切面中能看到少許束間纖維組織的染色，但纖維組織的次生化生長(zhǎng)較野生型明顯要差。另外，uro突變體莖的皮層組織發(fā)生了增大和增生。對(duì)野生型和突變體的莖進(jìn)行木質(zhì)素特異性染色分析(Wiesner反應(yīng))分析也表明，uro突變體的木質(zhì)素比野生型少。
主莖的生長(zhǎng)異常表明URO基因也參與了擬南芥植株莖的發(fā)育，但因?yàn)樵趗ro純合突變體主莖生長(zhǎng)受到嚴(yán)重的抑制，這可能與突變體的頂端分生組織的異常發(fā)育有關(guān)。而對(duì)側(cè)枝發(fā)育的統(tǒng)計(jì)表明，URO基因的確參與了擬南芥植株頂端優(yōu)勢(shì)建立的調(diào)控過程，調(diào)節(jié)了擬南芥植株的側(cè)枝生長(zhǎng)。另外，對(duì)突變體莖的細(xì)胞學(xué)分析表明，URO基因參與調(diào)控了擬南芥植株的束間纖維組織的建立，并參與了莖中皮層和內(nèi)皮層細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控。
實(shí)施例3URO基因的克隆uro突變體是從T-DNA插入的突變體庫(kù)中篩得的。對(duì)T-DNA在uro突變體的插入情況進(jìn)行了分析，T-DNA的結(jié)構(gòu)可見圖4A(其序列見SEQ ID NO3的第1-3000位)，含有GUS、NPTII和IAAH基因，具體構(gòu)建可見http//genetrap.cshl.org/。遺傳學(xué)分析表明，T-DNA插入與uro突變體的表型緊密連鎖。
用TAIL-PCR的方法從純合的uro突變體中只克隆到一個(gè)片段，在NCBI中BLAST比對(duì)表明uro突變體中T-DNA的旁鄰序列為At3g23140(見圖4C)。圖5A顯示的是T-DNA的左臂，圖B的綠色顯示的是At3g23140基因的編碼起始位置，可見T-DNA插入在At3g23140基因起始編碼框前164bp處(見圖5B黑色橫向箭頭)。
實(shí)施例4URO基因的序列分析將TAIL-PCR克隆得到的序列“At3g23140”進(jìn)行網(wǎng)上序列分析(見圖5)。At3g23140基因是一個(gè)未知功能的含有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。圖6B中的藍(lán)色橫線標(biāo)示的區(qū)域中含有“YDCDICKPGFUNPQALGGHNNIHRRERER”的典型的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)(圖6A)。植物界中含有許多具有一個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子(圖6)。大部分是功能未知的基因。與At3g23140基因的氨基酸序列同源性很高的豌豆中的LIF(lateral shoot inducer)基因功能剛被報(bào)道。過量表達(dá)LIF基因表明LIF基因正向調(diào)控了植物側(cè)枝的發(fā)育。這與uro突變體的表型有相似之處。暗示著At3g23140就是URO基因。我們將At3g23140基因命名為URO。
實(shí)施例5URO蛋白純化和分析在該實(shí)施例中，以實(shí)施例2中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用序列如下的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擬南芥URO DNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′端寡核苷酸引物序列為5′-gaattgagagagatgaaccacc-3′(SEQ ID NO4)該引物含有EcoRI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的部分編碼序列；3′端引物序列為5′-gtcgacccgctgcaagcttaatg-3′(SEQ ID NO5)，該引物含有SalI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是翻譯終止子和擬南芥URO的部分編碼序列。
擬南芥URO蛋白cDNA PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)與質(zhì)粒pUC 18按常規(guī)方法重組并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5a，挑取陽性克隆鑒定后純化并測(cè)序(ABI公司的377型測(cè)序儀，BigDye Terminator試劑盒，PE公司)。將正確序列的擬南芥URO蛋白cDNA EcoR I和SalI酶切片段克隆至表達(dá)載體pGEX-28a(Novagen公司)，形成載體pGEX-28a-URO，然后轉(zhuǎn)化人DH5a。陽性克隆用BamH I酶切鑒定，酶切產(chǎn)物行2％瓊脂糖凝膠電泳分析。經(jīng)測(cè)序證實(shí)，已插入了完整的URO編碼序列。
挑表達(dá)URO的陽性DH5a克隆接種于100ml 2′YTA培養(yǎng)基中，37℃ 300rpm振蕩培養(yǎng)12-15hr，1∶10稀釋于預(yù)熱的2′YTA培養(yǎng)基繼續(xù)振蕩培養(yǎng)1.5hr，加100mMIPTG至0.1mM后30oC誘導(dǎo)2-6hr，5,000g 4℃離心10min去上清，置冰上用50ml 1′PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)重懸，超聲(B.Braun Labsonic U)破碎后再加入20％Triton X-100至1％輕搖30min，然后12,000g 4℃離心10min，上清用0.8mm濾膜過濾后，過1ml 50％谷胱甘肽Sepharose 4B層析柱，1′PBS充分洗滌后，加入500ul谷胱甘肽洗脫緩沖液(10mM谷胱甘肽，50mM Tris-HCl，pH 8.0)室溫靜置30分鐘后收集洗脫液，重復(fù)洗脫2-3次，得到擬南芥URO蛋白。測(cè)得蛋白分子量為18783Da。
實(shí)施例6URO基因的過量表達(dá)是引起uro突變體表型的原因?yàn)榱诉M(jìn)一步確定所克隆的At3g23140基因是引起uro突變體表型的基因，我們根據(jù)T-DNA插入基因組中的情況進(jìn)行了一系列的構(gòu)建，具體構(gòu)建示意圖如圖7。
首先，將IAAH-pURO-23145構(gòu)建引入到野生型植株中，共得到116棵轉(zhuǎn)化子，其表型如圖8D和G-I所示，轉(zhuǎn)化子的表型與uro雜、純合突變體表型一致(圖8B和C)。另外，我們分別將IAAH-p和35S::23145構(gòu)建也引入到野生型植株中，以觀察是否會(huì)引起植株生長(zhǎng)發(fā)育的異常，圖8E和F分別是這兩個(gè)構(gòu)建的轉(zhuǎn)化子表型，其表型與野生型相似，可見正是由于T-DNA插入引起URO基因表達(dá)量的上升引起了擬南芥植株的異常生長(zhǎng)(圖8J)。
另外，對(duì)URO基因的表達(dá)情況分析表明，URO基因的過量表達(dá)與uro突變體的表型有著密切的關(guān)系。因此，我們用35S啟動(dòng)子過量表達(dá)URO基因于野生型中，以期能得到與uro突變體表型類似的轉(zhuǎn)化子。所得到的轉(zhuǎn)化子如圖9D所示，35S::URO轉(zhuǎn)化子在生長(zhǎng)早期子葉向上生長(zhǎng)，而且頂端生長(zhǎng)受抑制，這些轉(zhuǎn)化子在生長(zhǎng)到7-10天時(shí)死亡。結(jié)合對(duì)IAAH-pURO-23145轉(zhuǎn)化子的分析，表明URO基因?qū)M南芥的生長(zhǎng)起到了重要的調(diào)控作用，是一種表達(dá)量上的精確調(diào)控，而且，T-DNA的插入起到的是一個(gè)精細(xì)上調(diào)URO基因的作用。
因?yàn)檫^量表達(dá)URO基因到野生型中所得的轉(zhuǎn)化子是致死的，所以我們構(gòu)建了雙鏈反義抑制URO基因的構(gòu)建(35S::fURO-rURO，如圖7所示)。將這一構(gòu)建分別引入uro純合突變體和野生型中。如圖9中(E)-(K)所示，反義URO基因的構(gòu)建能回復(fù)uro純合突變體的頂端優(yōu)勢(shì)喪失的表型。共篩得uro純合突變體背景下51棵轉(zhuǎn)化子，其中有30棵轉(zhuǎn)化子表型回復(fù)得很好，表型與野生型相似(見圖9P和G)；有13棵轉(zhuǎn)化子表型得到了中等的回復(fù)，表型與雜合的uro植株相似(見圖9E、I和J)；另外，還得到8棵表型未回復(fù)的表型與純合uro突變體表型相似的轉(zhuǎn)化子(見圖9K)。將反義URO基因的構(gòu)建轉(zhuǎn)化到野生型植株中共獲得12棵轉(zhuǎn)化子，所得的轉(zhuǎn)化子表型與野生型相似(見圖9H和L)。
由此可見反義URO基因能回復(fù)uro突變體的表型，為了進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子的表型回復(fù)是URO基因表達(dá)下降所起的作用，我們用RT的方法檢測(cè)不同的轉(zhuǎn)化子單株中URO基因的表達(dá)量。如圖9中M所示，1為表型回復(fù)最好的轉(zhuǎn)化子，2為表型中等回復(fù)的轉(zhuǎn)化子，3為表型未回復(fù)的轉(zhuǎn)化子，4為35S::fURO-rURO構(gòu)建引入到野生型植株中獲得的轉(zhuǎn)化子，可見URO基因的表達(dá)在表型得到回復(fù)的轉(zhuǎn)化子中表達(dá)量下降了，而且下降值與表型回復(fù)程度關(guān)系密切。T-DNA插入的鑒定進(jìn)一步驗(yàn)證了表型回復(fù)的轉(zhuǎn)化子是從uro純合突變體背景下篩得的(圖9N)。因此，我們可以定論，所克隆的At3g23140基因即為URO基因，URO基因的過量表達(dá)引起了uro突變體的異常表型。
根據(jù)已有的結(jié)果，即過量表達(dá)At3g23140基因使植株致死，而反義抑制該基因可以回復(fù)uro突變體的表型，我們推測(cè)URO基因的表達(dá)量與擬南芥植物的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)密切的關(guān)系，而T-DNA的插入是一種非常特異的方式，適量的使At3g23140基因過量表達(dá)不會(huì)引起植物致死。因此，T-DNA的插入位點(diǎn)可能是URO基因啟動(dòng)子的關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)。為此，我們將T-DNA插入位點(diǎn)后的序列接上At3g23140基因進(jìn)行表達(dá)(p-URO，如圖7所示)，所得的轉(zhuǎn)化子都為野生型植株表型(結(jié)果未顯示)。表明At3g23140基因在uro突變體中的過量表達(dá)并非由于其啟動(dòng)子調(diào)控元件的改變所致。
實(shí)施例7關(guān)于URO基因功能的進(jìn)一步分析前面的分析表明，uro突變體中生長(zhǎng)素的時(shí)空分布的特異性發(fā)生了改變。在克隆到URO基因后，我們將URO基因過量表達(dá)到DR5::GUS植株中，所獲得的轉(zhuǎn)化子表型與轉(zhuǎn)化野生型植株所獲得的轉(zhuǎn)化子表型一致(如圖10E和F)。將這一生長(zhǎng)受抑的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行GUS染色分析表明，過量表達(dá)URO基因的轉(zhuǎn)化子中大量積累了GUS的分布，在子葉和頂端分生組織特別明顯(如圖10F和G)?？梢奤RO基因的確影響到了擬南芥植株中生長(zhǎng)素的時(shí)空分布的特異性。但這一調(diào)控的機(jī)制還需深入的研究。
對(duì)URO基因的表達(dá)模式的初步分析表明URO基因在野生型植株中遍在表達(dá)，但表達(dá)量很低。為了進(jìn)一步的分析URO基因的功能，我們對(duì)URO基因的表達(dá)模式進(jìn)行了進(jìn)一步的分析，將URO基因起始編碼框前的1.5kb序列克隆后接上GUS表達(dá)基因(SEQ ID NO6)，將這一構(gòu)建轉(zhuǎn)化到野生型植株中以觀察URO基因的表達(dá)模式。結(jié)果如圖10所示，URO基因在雄蕊及細(xì)嫩的胚中表達(dá)明顯。其他組織的染色正在進(jìn)行中。
對(duì)URO基因表達(dá)模式的仔細(xì)分析不僅可以讓我們更清楚的了解URO基因的作用方式，對(duì)URO基因的功能分析也有很大的幫助，因此，仍需用更精確的方法研究URO基因的表達(dá)模式，如原位雜交等。針對(duì)URO基因?qū)χ参锏纳L(zhǎng)發(fā)育有量上的調(diào)節(jié)作用，可以用誘導(dǎo)URO基因適量適時(shí)表達(dá)的方法對(duì)URO基因的作用方式進(jìn)行更深的分析?，F(xiàn)有的分析表明，uro突變體中的T-DNA插入是引起URO基因過量表達(dá)的原因，對(duì)這一調(diào)控機(jī)制的研究也將有助于了解URO基因的功能。
序列表<110>中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>URO基因及其用途<130>053918<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>519<212>DNA<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1atgaaccacc gggacaaaca aattgattcc ggctctggct ctggagaaaa ccgccggact 60tatgactgcg acatctgcaa gagaggtttc acgaatcctc aagccctcgg tggtcacaat120aacatccacc gcagggaacg cgaaagatac ccctcctcct cttcttcttc tcactcattt180ccattttctc ttccgttacc atctcagtct ccctcctcct ccacaaactt cacaaaccct240cctccttatt ttccgaccat tgagtcatac ctacaccaag ggtctcagcc acctattaac300cctagccaca acacacaata ctttggatca tcatcatcat caagaggagg agggagattt360gctcaagggg cgtctcatga tcttaatttg agcttagggc tcggatccat gaatgaagat420gatgacactc accggagccc accagagacc ggaggttctc aacctcaaga tggtgatctt480gatcttgatc ttcgactcgg cggtcatcgt catcattaa 519<210>2<211>172<212>PRT<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>2Met Asn His Arg Asp Lys Gln Ile Asp Ser Gly Ser Gly Ser Gly Glu1 5 10 15Asn Arg Arg Thr Tyr Asp Cys Asp Ile Cys Lys Arg Gly Phe Thr Asn20 25 30Pro Gln Ala Leu Gly Gly His Asn Asn Ile His Arg Arg Glu Arg Glu35 40 45Arg Tyr Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser His Ser Phe Pro Phe Ser Leu50 55 60Pro Leu Pro Ser Gln Ser Pro Ser Ser Ser Thr Asn Phe Thr Asn Pro65 70 75 80Pro Pro Tyr Phe Pro Thr Ile Glu Ser Tyr Leu His Gln Gly Ser Gln85 90 95Pro Pro Ile Asn Pro Ser His Asn Thr Gln Tyr Phe Gly Ser Ser Ser100 105 110Ser Ser Arg Gly Gly Gly Arg Phe Ala Gln Gly Ala Ser His Asp Leu115 120 125Asn Leu Ser Leu Gly Leu Gly Ser Met Asn Glu Asp Asp Asp Thr His130 135 140Arg Ser Pro Pro Glu Thr Gly Gly Ser Gln Pro Gln Asp Gly Asp Leu145 150 155 160Asp Leu Asp Leu Arg Leu Gly Gly His Arg His His165 170
<210>3<211>4836<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3000)<223>T-DNA序列<220>
<221>misc_feature<222>(3001)..(3519)<223>URO序列<220>
<221>misc_feature<222>(3520)..(4836)<223>下游序列<400>3acgaattcga gctcggtacc cggggatcct ctagagatgt ttatttcggc gtgtaggaca 60tggcaaccgg gcctgaattt cgcgggtatt ctgtttctat tccaactttt tcttgatccg 120cagccattaa cgacttttga atagatacgc tgacacgcca agcctcgcta gtcaaaagtg 180taccaaacaa cgctttacag caagaacgga atgcgcgtga cgctcgcggt gacgccattt 240cgccttttca gaaatggata aatagccttg cttcctatta tatcttccca aattaccaat 300acattacact agcatctgaa tttcataacc aatctcgata caccaaatcg atggtggcca 360ttacctcgtt agcccaaagc ctagaacacc tgaaacggaa agactactcc tgcttagaac 420tagtagaaac tctgatagcg cgttgtgaag ctgcaaaatc attaaacgcc cttctggcta 480cagactggga tggtttgcgg cgaagcgcca aaaaaattga tcgccatgga aacgccggag 540taggtctttg cggcattcca ctctgtttta aggcgaacat cgctaccggc gtatttccca 600caagcgccgc tacgccggcg ctgataaacc acttgccaaa gataccatcc cgcgtcgcag 660aaagactttt ttcagctgga gcactgccgg gtgcctcggg aaatatgcat gagttatcgt 720ttggaattac aagcaacaac tatgccaccg gggcggtgcg aaacccgtgg aatccagatc 780tgataccagg gggctcaagc ggtggtgtgg ctgctgcggt agcaagccga ttgatgttag 840gcggcatagg caccgatacc ggtgcatctg ttcgcctacc cgcagccctg tgtggcgtag 900taggatttcg accgacgctt ggtagatatc cgggagatcg gataataccg gttagcccta 960cccgggacac tcccggaatc atagcgcagt gcgtagccga tgttgtaatc ctcgaccgga1020taatttccgg cacaccggag agaataccac ccgtgccgct gaaggggcta aggatcggcc1080tccctacaac ctacttttat gatgaccttg atgctgatgt ggccctagca gctgaaacaa1140cgattcgcct gctagcaaac aaaggcgtaa cttttgttga agctaacatt ccccaccttg1200acgaactgaa taaaggggcc agcttcccag ttgcactcta tgaatttcca cacgctctaa1260aacagtatct cgacgacttt gtaaaaactg tttctttttc tgacgtcatc aaaggaattc1320gtagccctga tgtagccaac attgccaatg cgcaaattga tggacatcaa atttccaaag1380ctgaatatga actggcccgc cactccttca gaccaagact tcaagccacc tatcgcaact1440acttcaaact gaatagatta gatgctattc tcttcccaac agcacccttg gtggccagac1500ccataggtca ggattcctca gttatccaca atggcacgat gctggacaca ttcaagatct1560acgtgcgaaa tgtggaccca agcagcaacg caggcctacc tggcttgagc attcctgttt1620gcctgacacc tgatcgcttg cctgttggaa tggagatcga tggattagcg gattcagacc1680aacgtctgtt agcaatcggg ggggcattgg aagaagccat tggattccga tattttgccg1740gtttacccaa ttaaactttc taccatgttc gtttttacaa tttttcagat tgatgacaat1800caatccttgt attgcgtcta tgaacaacag tgccttatgt tataaatcga ataataactt1860gcgatggaga ttttgaacaa actttaattt atgatttaac caataaaagt ctttgcaata1920atcatgttcg ataaataatt ttattatcag tgataaactt tagatatttc ttggaatagg1980catcttcata taacaataat tctttttcga atttaaatta tatatcttaa gcaaattaca2040tttttcctaa attataggga aatataatta aagttcaagc aatcctattt aggcataaag2100tagttaatac aatttatata atatataatt tgccgtccac tatcctttac aaatttgtca2160aatctgcatt atgaaattaa tgactttttt gaattgtctc gccgtgtgag gacagacgtg2220aaggcaccca ccttttaatt tggatgcacc tctcacctgc tacaacatcg ataccgtcga2280
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1.一種分離的URO蛋白，其特征在于，它含有具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的URO蛋白，其特征在于，該多肽選自(a)具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的、且具有影響植物木質(zhì)素含量或分枝數(shù)量的由(a)衍生的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，該核苷酸序列編碼權(quán)利要求1所述的URO蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQID NO2所示氨基酸序列的多肽和驅(qū)動(dòng)該基因表達(dá)的上游啟動(dòng)子區(qū)序列。
5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸選自以下序列中的一種(a)具有SEQ ID NO1所示的序列；(b)在SEQ ID NO3中第1-3519位所示的序列；(c)具有SEQ ID NO3中1-4836位所示序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體或基因組中整合有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
8.一種降低植物中木質(zhì)素含量或增加植物分枝數(shù)量的方法，其特征在于，該方法包括增加所述植物中URO基因或其同源基因的表達(dá)。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，通過插入T-DNA序列而增強(qiáng)該URO基因或其同源基因的表達(dá)。
10.一種改良植物的方法，其特征在于，它包括步驟(1)提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有URO蛋白DNA編碼序列，所述的影響植物木質(zhì)素含量或分枝數(shù)量蛋白選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的、且具有影響植物木質(zhì)素含量或分枝數(shù)量的由(a)衍生的多肽；(2)將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟(1)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使該URO蛋白DNA編碼序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；(3)選擇出轉(zhuǎn)入所述URO蛋白DNA編碼序列的植物細(xì)胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細(xì)胞或組織或器官再生成植株。
全文摘要
本發(fā)明提供一種擬南芥UPRIGHT ROSETTE(URO)基因及其用途。通過調(diào)控該基因可降低植物中木質(zhì)素含量和增加植物分枝數(shù)量。本發(fā)明還涉及該基因在降低植物木質(zhì)素和增加植物分枝數(shù)量方面的用途。
文檔編號(hào)A01H1/00GK1887904SQ20051002716
公開日2007年1月3日 申請(qǐng)日期2005年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月27日
發(fā)明者孫越, 袁政, 黃海 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院