專利名稱：高效番茄基因轉化方法
所屬領域本發明屬于農業生物技術領域或植物基因工程領域，尤其是一種高效番茄基因轉化方法。
背景技術：
轉基因抗衰老、耐貯藏系列番茄品種的培育是由天津農學院和中國農業大學聯合研究和開發的項目。從1995年開始由國家自然基金資助，通過基因沉默技術獲得轉反義ACS和ACC基因耐貯藏番茄新品種T95-1、T96-2、T98-3。2001年又由天津教委資助將乙烯受體蛋白基因-反義NR基因導入番茄獲得抗衰老、耐貯藏新品種N2，又相繼獲得轉反義CTR1、ENT1和EIN2基因新品種F1、F2、F3。目前我們已經獲得7個品種、28個類型；已經進行了F1代和F2代的觀察和篩選；我們曾獲得了該轉基因品種的環境釋放。上述轉基因番茄主要表現出抗衰老、耐貯藏、貨架期可延長2個多月，抗逆性增強，并保持了品種原有的風味和品質。
我國農產品產后損失十分驚人(損失率在20％)，其主要原因就是品種不耐貯藏、貯藏量和加工量低直接導致我國農產品采后價值很低。僅我國番茄醬生產中加工前的經濟損失為3774萬元。減少番茄產后損失，可大大提高農民收入。
我國僅番茄的種植面積就達217千公頃，對其種子的總需求量為195噸，而種子每千克的單價為47.06美元，形成了一個充滿商機與潛力的廣闊市場。
世界上現有100個以上基因的50種農作物基因工程產品被正式批準投入商品化生產。全世界轉基因作物推廣面積已經從1996年的170萬公頃猛增至4420萬公頃。其中美國的轉基因作物種植面積最廣，達到了3030萬公頃而我國僅為50萬公頃，占1％。
所以，轉基因耐貯藏番茄具有質量和價格方面的雙重趨勢。
在利用農桿菌進行轉基因研究中遇到的主要問題是如何提高轉化率。影響轉化率的因素主要有轉化所用的農桿菌的株型、Ti質粒的構建、外植體的再生率，篩選標記的可靠性以及轉化過程中外部環境的控制。其中前幾個因素在轉化研究確立后很難有大的調整和改變，而轉化的外部環境可以按照操作者根據實際情況和主觀需要作出較大調整。這些調整在提高轉化率上往往收效顯著，其中有報道的主要有改變農桿菌侵染的濃度，預培養的時間，用化學試劑對農桿菌和外植體進行處理等。本專利通過在番茄轉化過程中這些外部環境的改變，找出提高轉化率的有效方法和措施，從而建立一套標準的轉化體系。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中的難題，提供一種高效番茄基因轉化方法。該方法采用農桿菌轉基因工程技術，通過克隆和反義構建乙烯受體蛋白基因并轉化番茄，以此得到抗衰老、耐儲藏的番茄。
本發明的目的是這樣實現的該高效番茄基因轉化方法的步驟為(1).將番茄種子消毒后播種在MS培養基上進行培養，至兩片子葉長大；(2).取攜帶番茄反義乙烯基因的農桿菌單菌落接種到YEB液體培養基上，在搖床上培養；(3).馬鈴薯傷流液與農桿菌對番茄子葉外植體進行侵染，在抗性培養基上誘導再生芽；(4).采用IAA以及IBA與農桿菌對番茄子葉外植體進行侵染，在抗性培養基上誘導再生芽；(5).在含有選擇標記的分化培養基上篩選轉化芽；(6).將該轉化芽在伸長培養基內進行長大培養；(7).植入生根培養基進行生根培養；(8).生根移栽；(9).入土栽培。
而且，所述的番茄種子消毒采用含氯離子濃度為2.8的次氯酸鈉溶液進行番茄種子消毒，消毒時間為10～20分鐘，然后用無菌水沖洗三次；接種到MS培養基上培養的時間為1-3周，培養的環境條件是溫度為25～28℃，光照每天12小時左右，光強2500～5000LUX。
而且，所述的在搖床上培養攜帶番茄反義乙烯基因的農桿菌單菌落接種到YEB液體培養基上的方法是取攜帶番茄反義乙烯基因的農桿菌單菌落接種到YEB液體培養基上，在25～28℃溫度條件下，在搖床上以200轉/min搖擺48小時，該液體培養基內添加50mg/L的卡那霉素和100mg/L的慶大霉素，待其OD值為0.6時待用。
而且，所述的馬鈴薯傷流液與農桿菌對番茄子葉外植體進行侵染的方法是取番茄幼嫩組織傷流液經抽濾滅菌后分別稀釋1-5倍，與培養過夜地農桿菌一起侵染番茄子葉外植體，浸泡10分鐘，然后放在抗性培養基上誘導再生芽。
而且，所述的采用IAA或IBA與農桿菌對番茄子葉外植體進行侵染的方法是用1-5mg/L濃度的IAA以及IBA分別與農桿菌一起侵染番茄子葉外植體，浸泡10分鐘，然后放在抗性培養基上誘導再生芽。
而且，在含有選擇標記的分化培養基上篩選轉化芽采用的方法是將上述處理后的外植體從菌液中取出，用無菌濾紙吸干，將子葉接種到分化培養基上進行共培養，48小時后轉入生芽培養基；該分化培養基由MS培養基、2～6mg/L的BA、0.1～0.4mg/L的IAA等構成；在該分化培養基上放一層濾紙，把該子葉放置在濾紙上，25～28℃溫度下的密閉、暗條件下培養48小時取出，然后去掉濾紙，在分化培養基上再添加卡那霉素50-100mg/l和500mg/L的羧變青霉素；在此過程中，子葉的傷口要充分接觸培養基，在25～28℃溫度條件下，光強2500～5000LUX的條件下，晝夜光照，培養2-4周后，產生再生轉化芽。
而且，所述的該轉化芽在伸長培養基內進行長大培養的方法是將該轉化芽切下，在伸長培養基內進行長大培養，在25～28℃溫度條件下，光強2500～5000LUX的條件下，每天光照培養12小時；該伸長培養基由MS培養基、0.5-2mg/L BA、0.1～0.4mg/L的IAA、卡那霉素50-100mg/L和500mg/L的羧變青霉素構成。
而且，所述的植入生根培養基進行生根培養的方法為待再生轉化芽生長到2～3cm長度時切下，在25～28℃溫度條件下，光強2500～5000LUX的條件下，植入生根培養基進行培養，每天光照培養12小時；該生根培養基為MS培養基、0.2～0.4mg/L的IAA、50-100mg/l卡那霉素和500mg/L的羧變青霉素構成。
而且，所述的生根移栽為取出再生芽，沖洗掉培養基，將其栽到蛭石培養基內，澆MS營養液，保持每天3～4小時太陽光直射，在25～28℃溫度條件下，當生長3～4個葉片時，入土栽培。
具體實施例方式
下面對本發明實施例做進一步詳述本發明所述的轉化方法由以下步驟構成(1)番茄種子消毒后播種在MS培養基上進行培養，至兩片子葉長大。
首先采用含氯離子濃度為2.8的次氯酸鈉溶液消毒番茄種子10～20分鐘，然后用無菌水沖洗三次，接種到MS培養基上進行培養，培養時間為1-3周，培養的環境條件是溫度為25～28℃，光照每天12小時左右，光強2500～5000LUX。
(2)用于轉化的農桿菌液的準備取攜帶番茄反義乙烯基因的農桿菌單菌落接種到YEB液體培養基上，在25～28℃溫度條件下，以200轉/min搖擺48小時，該液體培養基內添加50mg/L的卡那霉素和100mg/L的慶大霉素，待其OD值為0.6時待用。
(3)馬鈴薯傷流液預處理。
取番茄幼嫩組織傷流液經抽濾滅菌后分別稀釋1-5倍，與培養過夜的農桿菌一起侵染番茄子葉外植體，浸泡10分鐘，放在抗性培養基上誘導再生芽。
(4)生長素預處理。
用1-5mg/L濃度的IAA，IBA分別與農桿菌一起侵染番茄子葉外植體，浸泡10分鐘，放在抗性培養基上誘導再生芽。
(5)放在含有選擇標記的分化培養基上進行轉化芽的篩選。
將上述處理后的外植體從菌液中取出，用無菌濾紙吸干，將子葉接種到分化培養基上進行共培養，48小時后轉入生芽培養基。該分化培養基由MS培養基、2～6mg/L的BA、0.1～0.4mg/L的IAA等構成。在該分化培養基上放一層濾紙，把該子葉放置在濾紙上，25～28℃溫度下的密閉、暗條件下培養48小時取出，然后去掉濾紙，在分化培養基上再添加卡那霉素50-100mg/l和500mg/L的羧變青霉素。在此過程中，子葉的傷口要充分接觸培養基，在25～28℃溫度條件下，光強2500～5000LUX的條件下，晝夜光照，培養2-4周后，產生再生轉化芽。
(6)將該轉化芽在伸長培養基內進行長大培養。
把該轉化芽切下，在伸長培養基內進行長大培養，在25～28℃溫度條件下，光強2500～5000LUX的條件下，每天光照培養12小時。該伸長培養基由MS培養基、0.5-2mg/L BA、0.1～0.4mg/L的IAA、卡那霉素50-100mg/L和500mg/L的羧變青霉素構成。
(7).植入生根培養基進行生根培養待再生轉化芽生長到2～3cm長度時切下，在25～28℃溫度條件下，光強2500～5000LUX的條件下，植入生根培養基進行培養，每天光照培養12小時。該生根培養基為MS培養基、0.2～0.4mg/L的IAA、50-100mg/l卡那霉素和500mg/L的羧變青霉素構成。
(8)生根移栽。
取出再生芽，沖洗掉培養基，將其栽到蛭石培養基內，澆MS營養液，保持每天3～4小時太陽光直射，在25～28℃溫度條件下，當生長3～4個葉片時，入土栽培。
(9)入土栽培。
本發明的優點和積極效果是通過馬鈴薯傷流液預處理、生長素預處理、轉化芽的篩選、伸長培養基等步驟，使番茄的抗衰老基因—反義乙烯基因的轉化率大大提高；而且，整個轉化工藝比較簡單，成本較低，花費時間較少。
下面是本發明的主要實驗數據
權利要求
1.一種高效番茄基因轉化方法，其特征在于該轉化方法的步驟為(1).將番茄種子消毒后播種在MS培養基上進行培養，至兩片子葉長大；(2).取攜帶番茄反義乙烯基因的農桿菌單菌落接種到YEB液體培養基上，在搖床上培養；(3).馬鈴薯傷流液與農桿菌對番茄子葉外植體進行侵染，在抗性培養基上誘導再生芽；(4).采用IAA以及IBA與農桿菌對番茄子葉外植體進行侵染，在抗性培養基上誘導再生芽；(5).在含有選擇標記的分化培養基上篩選轉化芽；(6).將該轉化芽在伸長培養基內進行長大培養；(7).植入生根培養基進行生根培養；(8).生根移栽；(9).入土栽培。
2.根據權利要求1所述的高效番茄基因轉化方法，其特征在于所述的番茄種子消毒采用含氯離子濃度為2.8的次氯酸鈉溶液進行番茄種子消毒，消毒時間為10～20分鐘，然后用無菌水沖洗三次；接種到MS培養基上培養的時間為1-3周，培養的環境條件是溫度為25～28℃，光照每天12小時左右，光強2500～5000LUX。
3.根據權利要求1所述的高效番茄基因轉化方法，其特征在于所述的在搖床上培養攜帶番茄反義乙烯基因的農桿菌單菌落接種到YEB液體培養基上的方法是取攜帶番茄反義乙烯基因的農桿菌單菌落接種到YEB液體培養基上，在25～28℃溫度條件下，在搖床上以200轉/min搖擺48小時，該液體培養基內添加50mg/L的卡那霉素和100mg/L的慶大霉素，待其OD值為0.6時待用。
4.根據權利要求1所述的高效番茄基因轉化方法，其特征在于所述的馬鈴薯傷流液與農桿菌對番茄子葉外植體進行侵染的方法是取番茄幼嫩組織傷流液經抽濾滅菌后分別稀釋1-5倍，與培養過夜地農桿菌一起侵染番茄子葉外植體，浸泡10分鐘，然后放在抗性培養基上誘導再生芽。
5.根據權利要求1所述的高效番茄基因轉化方法，其特征在于所述的采用IAA或IBA與農桿菌對番茄子葉外植體進行侵染的方法是用1-5mg/L濃度的IAA以及IBA分別與農桿菌一起侵染番茄子葉外植體，浸泡10分鐘，然后放在抗性培養基上誘導再生芽。
6.根據權利要求1所述的高效番茄基因轉化方法，其特征在于在含有選擇標記的分化培養基上篩選轉化芽采用的方法是將上述處理后的外植體從菌液中取出，用無菌濾紙吸干，將子葉接種到分化培養基上進行共培養，48小時后轉入生芽培養基；該分化培養基由MS培養基、2～6mg/L的BA、0.1～0.4mg/L的IAA等構成；在該分化培養基上放一層濾紙，把該子葉放置在濾紙上，25～28℃溫度下的密閉、暗條件下培養48小時取出，然后去掉濾紙，在分化培養基上再添加卡那霉素50-100mg/l和500mg/L的羧變青霉素；在此過程中，子葉的傷口要充分接觸培養基，在25～28℃溫度條件下，光強2500～5000LUX的條件下，晝夜光照，培養2-4周后，產生再生轉化芽。
7.根據權利要求1所述的高效番茄基因轉化方法，其特征在于所述的該轉化芽在伸長培養基內進行長大培養的方法是將該轉化芽切下，在伸長培養基內進行長大培養，在25～28℃溫度條件下，光強2500～5000LUX的條件下，每天光照培養12小時；該伸長培養基由MS培養基、0.5-2mg/L BA、0.1～0.4mg/L的IAA、卡那霉素50-100mg/L和500mg/L的羧變青霉素構成。
8.根據權利要求1所述的高效番茄基因轉化方法，其特征在于所述的植入生根培養基進行生根培養的方法為待再生轉化芽生長到2～3cm長度時切下，在25～28℃溫度條件下，光強2500～5000LUX的條件下，植入生根培養基進行培養，每天光照培養12小時；該生根培養基為MS培養基、0.2～0.4mg/L的IAA、50-100mg/l卡那霉素和500mg/L的羧變青霉素構成。
9.根據權利要求1所述的高效番茄基因轉化方法，其特征在于所述的生根移栽為取出再生芽，沖洗掉培養基，將其栽到蛭石培養基內，澆MS營養液，保持每天3～4小時太陽光直射，在25～28℃溫度條件下，當生長3～4個葉片時，入土栽培。
全文摘要
本發明屬于農業生物技術領域或植物基因工程領域的一種高效番茄基因轉化方法。主要技術特點是該方法采用農桿菌轉基因工程技術，采用克隆和反義構建乙烯受體蛋白基因并轉化番茄，通過馬鈴薯傷流液預處理、生長素預處理、轉化芽的篩選、伸長培養基等步驟，使番茄的抗衰老基因—反義乙烯基因的轉化率大大提高，以此得到抗衰老、耐儲藏的番茄；而且，整個轉化工藝比較簡單，成本較低，花費時間較少。
文檔編號A01H1/00GK1871896SQ20051001357
公開日2006年12月6日 申請日期2005年6月1日 優先權日2005年6月1日
發明者楊靜慧, 劉艷軍, 羅云波, 張偉玉, 楊恩芹 申請人:天津農學院