穩定的免疫調節寡核苷酸的制作方法

專利名稱：穩定的免疫調節寡核苷酸的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學、免疫學和醫學領域。更具體地，本發明涉及免疫刺激性寡核苷酸及其在治療中的應用。
背景技術：
免疫系統已進化為特異性識別含有未甲基化的CpG二核苷酸基序的DNA，所述的基序在病原微生物如細菌和病毒的DNA中廣泛存在。結果，含有未甲基化CpG的DNA成為脊椎動物免疫系統的有效刺激劑。通過DNA免疫刺激的第一個報道來自應用細菌DNA和含有回文序列的DNA小片段的研究，所述的DNA都是具有磷酸二酯骨架的雙鏈結構。Tokunaga，T等(J.Natl.Cancer Inst.72955-962(1984))報道了分離自牛分枝桿菌(Mycocacterium bovis)BCG的DNA有效的抗腫瘤活性。Kataoka，T等.，(Jpn.J.Cancer Res.83244-247(1992))、Hartmann等.(European Journal ofImmunology 331673-1641(2003))、Marshall等(Journal of Leukocyte Biology73781-792(2003)顯示了合成的脫氧寡核苷酸的相似類型的抗腫瘤活性，所述合成的脫氧寡核苷酸的設計基于牛分枝桿菌BCG cDNA序列。
Sato，Y，等(Science 273352-354(1996))顯示了含有CpG的DNA在DNA疫苗應用中的重要性(也參見Gurunathan S.，等(Annu.Rev.Immunol.18927-974(2000))。Pisetsky，D.S.，等(Mol.Biol.Rep.18217-221(1993))和Krieg，A.M.，等.，(Nature 374546-549(1995))顯示，在特定序列的環境中含有未甲基化的CpG-二核苷酸的DNA(CpG DNA)激活脊椎動物的免疫系統，導致B細胞增殖，并且激活巨噬細胞、單核細胞、天然殺傷細胞(NK細胞)和樹突細胞。出于對CpG DNA激活的應答，免疫細胞分泌大量的細胞因子，包括IL-12、IFN-γ、INF-α、IL-6和TNF-α，并且表達幾個共刺激分子(例如，參見Pisetsky，D.S.，等和Krieg，A.M.，等，見前文)Kandimalla，E.R.，等(Curr.Opin.Mol.Ther.4 122-129(2002))指出CpG-二核苷酸的存在和位置以及其側翼的序列對于其免疫刺激活性是關鍵的。Agrawal，S.，等(Current Cancer Drug Targets 1197-209(2001))公開了由于CpG寡核苷酸的側翼序列中的核糖修飾而產生的重大影響。這些影響取決于取代基的位置和性質，包括2’-O-甲氧基乙氧基和2’-或3’-O-甲基。Yu，D.，等(Bioorg.Med.Chem.92803-2808(2001))證明了磷酸鹽修飾因修飾位點不同也能增高或降低免疫刺激活性。Yu D.，等(Bioorg.Med.Chem.Lett.112263-2267(2001))和Yu D.，等(Bioorg.Med.Chem.11459-464(2003))公開了通過缺失某些核苷酸堿基能增加活性。此外Yu D.，等(Bioorg.Med.Chem.11459-464(2003))公開了通過用非核苷酸連接體取代某些側翼核苷酸可增加免疫刺激活性。
Yu D.，等(Bioorg.Med.Chem.Lett.102585-2588(2000))，Yu D.，等(Nucleic Acids Res.304460-4469(2002))，Yu D.，等(Biochem.Biophys.Res.Commun.29783-90(2002))，Bhagat L.，等(Biochem.Biophys.Res.Commun.300853-861(2003))以及Kandimalla E.R.，等(Nucleic Acids Res.312393-2400(2003))先前已經顯示5’-末端參與了受體的識別，該末端的易接近性對于活性是關鍵的。Kandimalla E.R.，等(Bioconj.Chem.13966-974(2002))公開了5’-末端連接比熒光素大的配基或5’-5’連接的二核苷酸使免疫刺激活性損失。由于3’-連接無影響，因此攝取上的改變不是所述結果的原因(同上)。然而，沒有任何系統的研究以闡明DNA的二級結構在引起的免疫應答中的作用。本發明在這里通過具有5’或3’-發夾環或能形成雙鏈體的粘性末端的免疫刺激性DNA提供了免疫刺激的信息。
免疫刺激性DNA誘導Th1細胞因子產生和促進增加免疫球蛋白產生的CTL應答的能力已經用于治療廣譜的疾病適應癥，其包括癌癥、病毒及細菌感染、炎癥性疾病以及作為免疫治療中的佐劑。因此提高或調節免疫刺激性DNA活性的益處是顯而易見的，而且在本技術領域中存在開發改進的免疫刺激性核酸的需求。

發明內容
本發明提供了包括具有增強或降低的免疫刺激性特性的免疫刺激性寡核苷酸的物質的新型組合物。本發明也提供了可進行具有增強或降低的免疫刺激性特性的或具有增加的代謝穩定性的免疫刺激性寡核苷酸的設計的方法。發明人令人驚訝地發現在免疫刺激性寡核苷酸的3’-端或5’-端引入二級結構可以明顯影響這些寡核苷酸的免疫刺激活性和穩定性。
第一方面，本發明提供了免疫刺激性核酸。該免疫刺激性核酸包含寡核苷酸序列，該寡核苷酸序列至少包含一個二核苷酸，該二核苷酸選自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*，其中，C是胞苷或2’-脫氧胞苷，G是鳥苷或2’-脫氧鳥苷C*是胞苷、2′-脫氧胸苷、1-(2′-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤、2’-雙脫氧-5-鹵代胞苷、2’-雙脫氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2′-脫氧-2′-取代阿糖胞苷、2′-O-取代阿糖胞苷、2′-脫氧-5-羥基胞苷、2′-脫氧-N4-烷基-胞苷、2′-脫氧-4-硫代尿苷或其它嘧啶核苷類似物，G*是2′脫氧-7-脫氮-鳥苷、2′-脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2′-脫氧-2′取代-阿糖鳥苷、2′-O-取代-阿糖鳥苷、2′-脫氧肌苷或其它嘌呤核苷類似物，p是核苷之間的連接體，其選自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。在一些優選的實施方案中，寡核苷酸序列在該寡核苷酸序列的3’-末端有二級結構。在一些優選的實施方案中，所述的免疫刺激性二核苷酸不是CpG。
在一些實施方案中，免疫刺激性核酸長度為約2-約50個核苷酸。在一些實施方案中免疫刺激性核酸長度為約12-約26個核苷酸。在一些實施方案中，所述寡核苷酸每個具有約3-約35個核苷殘基，優選約4-約30個核苷殘基，更優選約4-約20個核苷殘基。在一些實施方案中，所述的寡核苷酸具有約5-約18個或約5-約14個核苷殘基。如在這里應用的，術語“約”意味著確切的數字并不重要。因而在所述寡核苷酸中核苷殘基的數目并不重要，具有1或2個較少的核苷殘基的寡核苷酸或者有一個到幾個額外核苷殘基的寡核苷酸，預期作為前述的每個實施方案的相等物。在一些實施方案中，有一個或多個寡核苷酸有11個核苷酸。
在一些實施方案中，免疫刺激性核酸具有3’-末端莖環二級結構。在一些實施方案中，免疫刺激性核酸通過與互補序列氫鍵結合的方式在3’-末端具有二級結構。在一些實施方案中，免疫刺激性核酸選自SEQ ID NOS2，3，4，9，12，13，14，18，19，20，21，24，25，26，27，28，29，30，32，33，34，35，36，37或38。
第二方面，本發明提供了具有降低的免疫刺激活性的核酸。在此方面，所述的核酸包含寡核苷酸序列，該寡核苷酸序列至少包含一個二核苷酸，該二核苷酸選自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*，其中，C是胞苷或2’-脫氧胞苷，G是鳥苷或2’-脫氧鳥苷，C*是2′-脫氧胸苷、1-(2′-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤、2’-雙脫氧-5-鹵代胞苷、2’-雙脫氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2′-脫氧-2′-取代阿糖胞苷、2′-O-取代阿糖胞苷、2′-脫氧-5-羥基胞苷、2′-脫氧-N4-烷基-胞苷、2′-脫氧-4-硫代尿苷，或者其它嘧啶核苷類似物；G*是2′脫氧-7-脫氮鳥苷、2′-脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2′-脫氧-2′取代-阿糖鳥苷、2′-O-取代-阿糖鳥苷、2′-脫氧肌苷，或其它嘌呤核苷類似物，p是核苷之間的連接體，選自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。在一些優選的實施方案中，寡核苷酸序列在該寡核苷酸序列的3’-端具有二級結構。在一些優選的實施方案中，所述的免疫刺激性二核苷酸不是CpG。
在一些實施方案中，所述免疫刺激性核酸是長度為約2-約50個核苷酸的寡核苷酸序列。在一些實施方案中，所述免疫刺激性核酸是長度為約12-約26個核苷酸的寡核苷酸序列。
在一些實施方案中，具有降低的免疫刺激活性的核酸形成5’-端莖環二級結構。在一些實施方案中，具有降低的免疫刺激活性的核酸通過與互補序列氫鍵結合的方式在5’-端具有二級結構。在一些實施方案中，具有降低的免疫刺激活性的核酸選自SEQ ID NOS5，6，7，10，15，16或17。
第三方面，本發明提供了包含至少2個寡核苷酸的免疫刺激性核酸，其中該免疫刺激性核酸有二級結構。在這個方面，該免疫刺激性核酸包含如公式(I)詳細描述的結構結構域A-結構域B-結構域C (I)結構域的長度可為約2-約12個核苷酸。結構域A可以是5’-3’或3’-5或2’-5’DNA、RNA、RNA-DNA、DNA-RNA，它們具有或不具有回文區域或自我互補區域，該區域包含或不包含至少一個二核苷酸，該二核苷酸選自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*，其中，C是胞苷或2’-脫氧胞苷，G是鳥苷或2’脫氧鳥苷，C*是2′-脫氧胸苷、1-(2′-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤、2’-雙脫氧-5-鹵代胞苷、2’-雙脫氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2′-脫氧-2′-取代阿糖胞苷、2′-O-取代阿糖胞苷、2′-脫氧-5-羥基胞苷、2′-脫氧-N4-烷基-胞苷、2′-脫氧-4-硫代尿苷，或者其它嘧啶核苷類似物；G-是鳥苷或2′脫氧鳥苷、2′脫氧-7-脫氮鳥苷、2′-脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2′-脫氧-2′取代-阿糖鳥苷、2′-O-取代-阿糖鳥苷、2′-脫氧肌苷或其它嘌呤核苷類似物。在一些實施方案中，結構域A具有一個以上二核苷酸，該二核苷酸選自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*。
結構域B，如下文圖示的“X”，是一個連接結構域A和結構域C的連接體，其可以是一個3’-5’連接、2’-5’連接、3’-3’連接，可以是磷酸基團、核苷，或者非核苷連接體，所述的非核苷連接體可以是脂肪族的、芳香族的、芳基的、環狀的，手性、非手性的，可以是肽，碳水化合物、脂類、脂肪酸、單-、三-或六聚乙二醇，或者雜環部分。在一些實施方案中，結構域B優選非核苷酸連接體，其連接結構域A和結構域C的寡核苷酸，它們被稱為“免疫子(immunomer)”。
結構域C可以是5’-3’或3’-5’、2’-5’DNA、RNA、RNA-DNA，DNA-RNAPoly I-Poly C，它們具有或不具有回文序列或自我互補序列，該序列具有或不具有二核苷酸，該二核苷酸選自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*，其中C是胞苷或2’-脫氧胞苷，G是鳥苷或是2’-脫氧鳥苷，C*是2′-脫氧胸苷，1-(2′-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤，阿糖胞苷，2′-脫氧-2′-取代阿糖胞苷，2′-O-取代阿糖胞苷，2′-脫氧-5-羥基胞苷，2′-脫氧-N4-烷基-胞苷，2′-脫氧-4-硫代尿苷，或者其它嘧啶核苷類似物，G*是2′-脫氧-7-脫氮鳥苷，2′-脫氧-6-硫代鳥苷，阿糖鳥苷，2′-脫氧-2′-取代-阿糖鳥苷，2′-O-取代-阿糖鳥苷，2′-脫氧肌苷，或其它嘌呤核苷類似物，p是核苷之間的連接體，其選自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。在一些優選的實施方案中，免疫刺激性二核苷酸不是CpG。在一些優選的實施方案中，結構域C沒有二核苷酸CpG，C*pG，C*pG*或CpG*。
在一些實施方案中，公式(I)中所包括的寡核苷酸長度為約2-約50個核苷酸。在一些實施方案中，公式(I)中所包括的寡核苷酸長度為約12-約26個核苷酸。
通過非限制性實施例的方式，在該方面的一些實施方案中，免疫刺激性核酸會有如公式(II)詳細描述的結構。
該領域的技術人員會識別出，在該分子的3’端有分子內莖環形式的二級結構元件。
通過非限制性實施例的方式，在該方面的一些實施方案中，免疫刺激性核酸會有如公式(III)詳細描述的結構。
此處由公式(III)描述的結構被稱為“末端二聚體”，因為兩個分子的3’端由于兩個3’端序列互補允許分子間氫鍵結合而封閉。另外，結構域A和A’區可以等同也可以不等同，結構域B和B’區可以等同也可以不等同，結構域C和C’區可以等同也可以不等同。
通過非限制性實施例的方式，在該方面的一些實施方案中，免疫刺激性核酸會有如公式(IV)詳細描述的結構。
該領域的技術人員會識別出，在所描述的分子的3’端有二級結構，由于其3’端的互補序列通過氫鍵結合在這個區域。
在一些實施方案中，本發明的免疫刺激性核酸具有選自SEQ ID NOS1-38的序列。在一些實施方案中，本發明的免疫刺激性核酸具有選自SEQ IDNOS39-68的序列。
第四方面，本發明提供了降低或去除寡核苷酸的免疫刺激活性的方法。該方法包括在該寡核苷酸的5’-端引入包含二級結構的核酸序列。在該方面一些實施方案中，所述的二級結構是莖-環結構。在該方面一些實施方案中，所述的二級結構是通過在所述寡核苷酸序列的5’-端氫鍵結合互補序列而獲得的。
第五方面，本發明提供了提高免疫刺激性寡核苷酸穩定性的方法。該方法包括在免疫刺激性寡核苷酸的3’-端引入含二級結構的核酸序列。在該方面的一些實施方案中，該二級結構是莖環結構。在該方面的一些實施方案中，該二級結構是通過在所述寡核苷酸序列的3’-端氫鍵結合互補序列而獲得的。
第六方面，本發明提供了調節免疫刺激性寡核苷酸的免疫刺激活性的方法。該方法包括在免疫刺激性寡核苷酸的3’-端或5’-端引入含二級結構的核酸序列。在該方面的一些實施方案中，該二級結構是莖環結構。在該方面的一些實施方案中，該二級結構是通過在所述寡核苷酸的3’-端或5’-端氫鍵結合互補序列而獲得的。
第七方面，本發明提供了藥物組合物。這些組合物包括單獨或組合在本發明第一、二、三、四、五、六方面公開的任何一種組合物，以及可藥用的載體。


圖1A是一個示意圖，其顯示在BALB/c小鼠脾細胞培養物中，由寡核苷酸1，2，和5在濃度為1.0μg/mL時誘導的細胞增殖。
圖1B是一個示意圖，其顯示通過將寡核苷酸1，2，和5以5mg/kg的劑量向BALB/c小鼠腹膜內給藥誘導的脾腫大。
圖2是一個示意圖，其顯示在BALB/c小鼠脾細胞培養物中，與寡核苷酸1-7在濃度為3μg/mL溫育24小時后，誘導細胞因子IL-12和IL-6的情況。
圖3是一個示意圖，其顯示在BALB/c小鼠脾細胞培養物中，與寡核苷酸8-10在濃度為3μg/mL溫育24小時后，誘導細胞因子IL-12和IL-6的情況。
圖4顯示，用10μg/mL的寡核苷酸1-8在刺激1小時后，J774巨噬細胞中的NF-κB途徑的激活。M代表用培養基處理的對照，C是用非-CpG寡核苷酸處理的細胞。
圖5是一個示意圖，其顯示在J774巨噬細胞培養物中，寡核苷酸1-7在濃度為10μg/mL時，誘導細胞因子IL-12和IL-6。M代表用PBS處理的對照，ND是指沒有檢測到。
圖6是一個示意圖，其顯示暴露在濃度為10μg/ml的寡核苷酸11，12，14，15和17之后，漿細胞樣樹突狀細胞中α-干擾素(IFN-α)的誘導。
圖7是一個示意圖，其顯示暴露在濃度為10μg/ml的寡核苷酸18，19，20和21之后，漿細胞樣樹突狀細胞中α-干擾素(IFN-α)的誘導。
圖8是一個示意圖，其顯示暴露在濃度為10μg/ml的寡核苷酸41，44和45之后，漿細胞樣樹突狀細胞中α-干擾素(IFN-α)的誘導。
圖9是平行合成本發明的免疫子(immunomer)的合成方案。DMTr＝4，4′二甲氧基三苯甲基，CE＝氰乙基。
圖10描述一組有代表性的，適合線性合成本發明的免疫子的小分子連接體。
圖11是線性合成本發明的免疫子的合成方案。DMTr＝4，4′二甲氧基三苯甲基，CE＝氰乙基。
圖12描述一組有代表性的，適合平行合成本發明免疫子的小分子連接體。
圖13自我穩定的CpG DNA(A)通過人pDC誘導IFN-α分泌及(B)誘導人B-細胞在培養物中的增殖。(A)pDC從5-8個健康捐獻者的人PBMC中分離，用濃度為10μg/mL的CpG DNA刺激24小時，并通過ELISA檢測上清液的IFN-α分泌。(B)B細胞從4-7個健康捐獻者的人PBMC中分離，用濃度為1μg/mL的CpG DNA刺激72小時，檢測[3H]-胸苷攝取。符號代表從每個捐獻者獲取的數據，而加號代表兩個圖面中所有捐獻者的平均值。
圖14人B細胞增殖對CpG DNA濃度的依賴性。B細胞從4-6個健康捐獻者的人PBMC中分離，用不同濃度的CpG DNA刺激72小時。數據顯示的是平均值±SD圖15(A)CpG基序以及二級結構的存在對于通過人pDC誘導IFN-α分泌來說是必需的。顯示的數據是6-8個人捐獻者在CpG DNA濃度為10μg/mL的平均值±SD。(B)人B-細胞增殖需要DNA中有CpG刺激基序的存在而不是二級結構。數據顯示的是5-8個捐獻者在CpG DNA濃度為1μg/mL的平均值±SD。
圖16發夾二級結構中的2’-O-甲基核糖核苷酸片段(A)對于通過人pDC分泌IFN-α的影響和(B)對于人B-細胞增殖的影響。顯示的數據是在pDC培養物中在10μg/mL的CpG DNA濃度6-8個人捐獻者的平均值±SD和在B細胞培養物中在1μg/mL的CpG DNA濃度5-8個捐獻者的平均值±SD。
發明詳述本發明提供了包括具有增強或降低的免疫刺激性特性的免疫刺激性寡核苷酸的物質的新型組合物。本發明也提供了得以設計具有增強或降低的免疫刺激性特性的或具有增加的代謝穩定性的免疫刺激性寡核苷酸的方法。發明人令人驚訝地發現在免疫刺激性寡核苷酸的3’-端或5’-端引入二級結構可以明顯影響這些寡核苷酸的免疫刺激活性或穩定性。
本文所引用的已發布專利、專利申請、參考文獻都被納入本文以同等程度作參考，如同每一個都被具體地、個別地標明被納入以作參考。如果在本文中引用的任何參考文獻的任何教導與本說明書有矛盾，為了本發明目的，優先適用后者。
在第一個方面，本發明提供了免疫刺激性核酸。該免疫刺激性核酸包含寡核苷酸序列，該寡核苷酸序列至少包括一個二核苷酸，該二核苷酸選自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*，其中C是胞苷或2’-脫氧胞苷，G是鳥苷或2’-脫氧鳥苷，C*是2′-脫氧胸苷、1-(2′-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤、2’-雙脫氧-5-鹵代胞苷、2’-雙脫氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2′-脫氧-2′-取代阿糖胞苷、2′-O-取代阿糖胞苷、2′-脫氧-5-羥基胞苷、2′-脫氧-N4-烷基-胞苷、2′-脫氧-4-硫代尿苷，或者其它嘧啶核苷類似物；G*是2′-脫氧-7-脫氮鳥苷、2′-脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2′-脫氧-2′取代-阿糖鳥苷、2′-O-取代-阿糖鳥苷、2′-脫氧肌苷，或其它嘌呤核苷類似物，p是核苷之間的連接體，選自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯，而且其中，在所述寡核苷酸序列的3’-端有二級結構。在一些優選的實施方案中，所述免疫刺激性二核苷酸不是CpG。
在一些實施方案中，免疫刺激性核酸的長度為約2-約50個核苷酸。在一些實施方案中，免疫刺激性核酸的長度為約12-約26個核苷酸。在一些實施方案中，每個寡核苷酸具有約3-約35個核苷殘基，優選約4-約30個核苷殘基，更優選約4-約20個核苷殘基。在一些實施方案中，所述的寡核苷酸具有約5-約18或約5-約14個核苷殘基。如在這里應用的，術語“約”意味著確切的數字并不重要。因而在所述的寡核苷酸中核苷殘基的數目并不重要，具有1或2個較少的核苷殘基的寡核苷酸或者有一個到幾個額外核苷殘基的寡核苷酸，預期作為前述的每個實施方案的相等物。在一些實施方案中，一個或多個寡核苷酸有11個核苷酸。
在一些實施方案中，免疫刺激性核酸在3’-末端有莖環二級結構。在一些實施方案中，免疫刺激性核酸通過與互補序列氫鍵結合的方式在3’-端具有二級結構。在一些實施方案中，免疫刺激性核酸選自SEQ ID NOS2，3，4，9，12，13，14，18，19，20，21，24，25，26，27，28，29，30，32，33，34，35，36，37或38。
為了本發明的目的，術語“寡核苷酸”是指由大量的連接的核苷單位組成的多聚核苷。這樣的寡核苷酸可以從現有的核酸來源獲得，包括基因組核酸或cDNA，但是優選通過合成方法產生。在優選的實施方案中，每個核苷單位包括雜環堿基和呋喃戊糖基(pentofuranosyl)，2’-脫氧呋喃戊糖基(2’-deoxypentfuranosyl)，海藻糖(trehalose)，阿拉伯糖(arabinose)，2’-脫氧-2’-取代阿拉伯糖(2’-deoxy-2’-substituted arabinose)，2’-O-取代阿拉伯糖(2’-O-substituted arabinose)或己糖基團(hexose sugar group)。核苷殘基可通過大量已知的核苷之間的連接中的任一種彼此偶聯。這樣的核苷間連接包括，但不限于磷酸二酯(phosphodiester)，硫代磷酸酯(phosphorothioate)，二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)，烷基膦酸酯(alkylphosphonate)，烷基硫代磷酸酯(alkylphosphonothioate)，磷酸三酯(phosphotriester)，氨基磷酸酯(phosphoramidate)，硅氧烷(siloxane)，碳酸酯(carbonate)，烷氧羰基(carboalkoxy)，乙酰胺化物(acetamidate)，氨基甲酸酯(carbamate)，嗎啉代(morpholino)，硼烷(borano)，硫醚(thioether)，橋連氨基磷酸酯(bridgedphosphoramidate)，橋連亞甲基膦酸酯(bridged methylene phosphonate)，橋連硫代磷酸酯(bridged phosphorothioate)和砜(sulfone)核苷間連接。術語“寡核苷酸”也包括具有一個或多個立體特異性的核苷間連接的多聚核苷(例如，(RP)-或(SP)-硫代磷酸酯，烷基膦酸酯或磷酸三酯連接)。如本文應用的，術語“寡核苷酸”和“二核苷酸”明顯地旨在包括具有任意上述核苷間連接的多聚核苷和二核苷，而不管該連接是否包含磷酸基團。在一些優選實施方案中，這些核苷間連接可以是磷酸二酯，硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯連接，或其組合。
術語“寡核苷酸”也包括含有額外的取代基的多聚核苷，所述的取代基包括，但不限于，蛋白基團，親脂基團，嵌入劑，二元胺(diamine)，葉酸，膽固醇和金剛烷。術語“寡核苷酸”也包括任何其它含有聚合物的核苷酸堿基，所述的聚合物包括，但不限于，肽核酸(PNA)，具有磷酸基團的肽核酸(PHONA)，封閉的核酸(LNA)，嗎啉代-骨架寡核苷酸和具有帶烷基連接體或氨基連接體的骨架部分的寡核苷酸。
本發明的寡核苷酸可以包括天然存在的核苷，經修飾的核苷或其混合物。如本文所應用的，術語“經修飾的核苷”是指包括經修飾的雜環堿基，經修飾的糖基部分，或其組合的核苷。在一些實施方案中，經修飾的核苷是如本文所描述的非-天然的嘧啶或嘌呤核苷。在一些實施方案中，經修飾的核苷是2′-取代核糖核苷，阿拉伯糖核苷或2’-脫氧-2’-取代阿拉伯糖苷。
為了本發明目的，術語“2′-取代核糖核苷”或“2’-取代阿拉伯糖苷”包括核糖核苷或者阿拉伯糖核苷，其中在該戊糖部分的2′位置的羥基被取代而產生2′-取代或2′-O-取代核糖核苷。優選地，這樣的取代是以含有1-6個飽和的或不飽和的碳原子的低級烷基，或者以具有6-10個碳原子的芳基取代，其中，所述的烷基或芳基可以是未取代的也可以是取代的，例如以鹵基(halo)，羥基，三氟甲基(trifluoromethyl)，氰基(cyano)，硝基(nitro)，酰基(acyl)，酰氧基(acyloxy)，烷氧基(alkoxy)，羧基(carboxyl)，烷氧羰基(carboalkoxy)或氨基取代。2′-O-取代核糖核苷或2′-O-取代-阿拉伯糖苷的實例包括，但不限于2′-O-甲基核糖核苷，2′-O-甲基阿拉伯糖苷，和2′-O-甲氧基乙氧基核糖核苷(2′-O-methoxyethoxyribonucleoside)或2′-O-甲氧基乙氧基阿拉伯糖苷(2’-O-methoxyethoxyarabinoside)。
術語“2′-取代核糖核苷”或“2′-取代阿拉伯糖苷”也包括其中2′-羥基被含有1-6個飽和或不飽和碳原子的低級烷基所取代或被氨基或鹵素基團取代的核糖核苷或阿拉伯糖苷。所述的2′-取代核糖核苷或2′-取代阿拉伯糖苷的實例包括，但不限于，2’-氨基，2’-氟(2’-fluoro)，2’-烯丙基(2’-allyl)和2’-炔丙基(2’-propargyl)核糖核苷或阿拉伯糖苷。
術語“寡核苷酸”包括雜合(hybrid)寡核苷酸和嵌合(chimeric)寡核苷酸。“嵌合寡核苷酸”是具有一個以上類型的核苷間連接的寡核苷酸。所述的嵌合寡核苷酸的一個優選實例是包含硫代磷酸酯，磷酸二酯或二硫代磷酸酯區域和非-離子鍵例如烷基膦酸酯或烷基硫代膦酸酯連接的嵌合寡核苷酸(參見，例如Pederson等.U.S.專利No.5,635,377和5,366,878)。
“雜合寡核苷酸”是具有一個以上類型核苷的寡核苷酸。所述的雜合寡核苷酸的一個優選實例是包含核糖核苷酸或2′取代核糖核苷酸區域，和脫氧核糖核苷酸區域(參見，例如Metelev和Agrawal，美國專利No.5,652,355，6,346,614和6,143,881)。
如本文應用的，所述的術語“二級結構”是指分子內和分子間的氫鍵結合。分子內氫鍵結合導致莖-環結構的形成，分子間氫鍵結合導致雙鏈體核酸分子的形成。
如本文應用的，所述的術語“大約”意味著精確的數字并不重要。因此，寡核苷酸中的核苷殘基數不重要，為了本發明之目的，具有一個或兩個較少的核苷殘基，或一個到幾個附加的核苷殘基的寡核苷酸，預期作為前述的每個實施方案的相等物。
如本文應用的，所述的術語“互補”是指具有與核酸雜交的能力。所述的雜交通常是在互補鏈之間經氫鍵結合的結果，優選形成Watson-Crick或Hoogsteen堿基對，盡管氫鍵的其它模式以及堿基堆積也能導致雜交。
第二方面，本發明提供了具有降低的免疫刺激活性的核酸。在該方面所述的核酸包含寡核苷酸序列，該寡核苷酸序列至少含有一個二核苷酸，該二核苷酸選自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*，其中C是胞苷或2’-脫氧胞苷，G是鳥苷或2’-脫氧鳥苷，C*是2′-脫氧胸苷、1-(2′-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤、2’-雙脫氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2′-脫氧-2′-取代阿糖胞苷、2′-O-取代阿糖胞苷、2′-脫氧-5-羥基胞苷、2′-脫氧-N4-烷基-胞苷、2′-脫氧-4-硫代尿苷，或者其它嘧啶核苷類似物，G*是2′-脫氧-7-脫氮鳥苷、2′-脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2′-脫氧-2′取代-阿糖鳥苷、2′-O-取代-阿糖鳥苷、2′-脫氧肌苷，或其它嘌呤核苷類似物，p是核苷之間的連接體，選自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。其中寡核苷酸序列在該寡核苷酸序列的5’-端具有二級結構。在一些優選實施方案中，所述的免疫刺激性二核苷酸不是CpG。
在一些實施方案中，免疫刺激性核酸是長度為約2-約50個核苷酸的寡核苷酸序列。在一些實施方案中，免疫刺激性核酸是長度為約12-約26個核苷酸的寡核苷酸序列。在一些實施方案中，每個寡核苷酸具有約3-約35個核苷殘基，優選約4-約30個核苷殘基，更優選約4-約20個核苷殘基。在一些實施方案中，寡核苷酸具有約5-約18，或約5-約14個核苷殘基。如本文應用的，術語“約”意味著精確的數字并不重要。因此，寡核苷酸中核苷殘基數目不重要，并且具有一個或兩個更少的核苷殘基，或一個到幾個附加核苷殘基的寡核苷酸，預期作為前述的每個實施方案的相等物。在一些實施方案中，1個或多個寡核苷酸有11個核苷酸。
在一些實施方案中，具有降低的免疫刺激活性的核酸形成5’-端莖環二級結構。在一些實施方案中，所述具有降低的免疫刺激活性的核酸在5’-端通過與互補序列氫鍵結合具有二級結構。在一些實施方案中，具有降低的免疫刺激活性的核酸選自SEQ ID NOS5，6，7，10，15，16和17。
第三方面，本發明提供了包含至少2個寡核苷酸的免疫刺激性核酸，其中該免疫刺激性核酸具有二級結構。在該方面，該免疫刺激性核酸包含一個如公式(I)詳細描述的結構。
結構域A-結構域B-結構域C (I)結構域的長度可為約2-約12個核苷酸。結構域A可以是5’-3’或3’-5’或2’-5’DNA、RNA、RNA-DNA、DNA-RNA，它們具有或不具有回文區域或自我互補區域，該區域包含或不包含至少一個二核苷酸，該二核苷酸選自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*，其中C是胞苷或2’-脫氧胞苷，G是鳥苷或2’脫氧鳥苷，C*是2′-脫氧胸苷、1-(2′-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤、2’-雙脫氧-5-鹵代胞苷、2’-雙脫氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2′-脫氧-2′-取代阿糖胞苷、2′-O-取代阿糖胞苷、2′-脫氧-5-羥基胞苷、2′-脫氧-N4-烷基-胞苷、2′-脫氧-4-硫代尿苷，或者其它嘧啶核苷類似物；G*-是2′-脫氧-7-脫氮鳥苷、2′-脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2′-脫氧-2′-取代-阿糖鳥苷、2′-O-取代-阿糖鳥苷、2′-脫氧肌苷或其它嘌呤核苷類似物。p是核苷之間的連接體，其選自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。在一些優選實施方案中，所述的免疫刺激性二核苷酸不是CpG。
在一些實施方案中，結構域A將具有一個以上二核苷酸，該二核苷酸選自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*。
結構域B，即下文圖示的“X”，是連接結構域A和結構域C的連接體，其可以是3’-5’連接、2’-5’連接、3’-3’連接，可以是磷酸基團、核苷，或者非核苷連接體，所述的連接體可以是脂肪族的、芳香族的、芳基的、環狀的，手性的、非手性的，可以是肽，碳水化合物、脂類、脂肪酸、單-、三-或六聚乙二醇，或者雜環部分。
結構域C可以是5’-3’或3’-5’、2’-5’DNA、RNA、RNA-DNA、DNA-RNAPoly I-Poly C，它們具有或是不具有一個回文序列或自我互補序列，該序列可具有或不具有二核苷酸，該二核苷酸選自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*，其中C是胞苷或2’-脫氧胞苷，G是鳥苷或是2’-脫氧鳥苷，C*是2′-脫氧胸苷，1-(2′-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤，2’-雙脫氧-5-鹵代胞苷，2’-雙脫氧-5-鹵代胞苷，阿糖胞苷，2′-脫氧-2′-取代阿糖胞苷，2′-O-取代阿糖胞苷，2′-脫氧-5-羥基胞苷，2′-脫氧-N4-烷基-胞苷，2′-脫氧-4-硫代尿苷，其它嘧啶核苷類似物，G*是2′-脫氧-7-脫氮鳥苷，2′-脫氧-6-硫代鳥苷，阿糖鳥苷，2′-脫氧-2′-取代-阿糖鳥苷，2′-O-取代-阿糖鳥苷，2′-脫氧肌苷，或其它嘌呤核苷類似物，p是核苷之間的連接體，選自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。在一些優選實施方案中，所述的免疫刺激性二核苷酸不是CpG。在一些優選的實施方案中，結構域B優選是連接結構域A和結構域C的寡核苷酸的非-核苷連接體，其被稱為“免疫子”。在一些優選實施方案中，結構域C不具有二核苷酸CpG，C*pG，C*pG*或CpG*。
在一些實施方案中，公式(I)中含有的寡核苷酸的長度是約2-約50個核苷酸。在一些實施方案中，公式(I)中含有的寡核苷酸的長度是約12-約26個核苷酸。在一些實施方案中，每個寡核苷酸具有約3-約35個核苷殘基，優選約4-約30個核苷殘基，更優選約4-約20個核苷殘基。在一些實施方案中，寡核苷酸具有約5-約18，或約5-約14個核苷殘基。本文所述的術語“約”意味著精確的數字不是重要的。因此，寡核苷酸中核苷殘基數目不是重要的，并且具有一個或兩個更少的核苷殘基，或具有一個到幾個附加核苷殘基的寡核苷酸，預期作為前述的每個實施方案的相等物。在一些實施方案中，一個或多個寡核苷酸有11個核苷酸。
通過非限制性實施例的方式，在該方面的一些實施方案中，免疫刺激性核酸會有如公式(II)詳細描述的結構。

該領域的技術人員識別出，在該分子的3’端有分子內莖環形式的二級結構元件。
通過非限制性實施例的方式，在該方面的一些實施方案中，免疫刺激性核酸會有如公式(III)詳細描述的結構。
此處由公式(III)描述的結構被稱為“末端二聚體”，因為兩個分子的3’端由于兩3’端序列互補允許分子間氫鍵結合而封閉。另外，結構域A和A’區可以相同也可以不相同，結構域B和B’區可以相同也可以不相同，結構域C和C’區可以相同也可以不相同。
通過非限制性實施例的方式，在該方面的一些實施方案中，免疫刺激性核酸會有如公式(IV)詳細描述的結構。
該領域的技術人員會識別出，在所描述的分子的3’端有二級結構，由于其3’端的互補序列通過氫鍵結合在這個區域。在一些實施方案中，分子例如配體結合在3’-端以利于細胞的攝取或改善分子的穩定性。
本發明的一些核酸的非限制性的實例列于表1中。
表1



*大寫-PS；小寫-PO；粗體-2’-O-甲基核糖核苷酸(在26和27中)；G-2’-脫氧-7-脫氮-G(在28中)；G-araG(在29中)；X-C3-連接體(在37和38中)。
可選地，本發明的核酸分子可以是通過非核苷酸連接體連接的兩個免疫子。表2中列出了這些分子的非限制的代表性實例。
表2

*大寫-PS；小寫-PO；X-C3-連接體，Y-四乙二醇連接體(tetraethyleneglycol)；Z-六乙二醇連接體(hexaethyleneglycol)；粗體-2’-O-甲基核糖核苷酸(methylribonucleotides)(在44和57中)；G-2’-脫氧-7-脫氮-G(在45中)。
在一些實施方案中，本發明的免疫刺激性核酸具有選自SEQ ID NOS1-38的序列。在一些實施方案中，本發明的免疫刺激性核酸具有選自SEQ IDNOS39-68的序列。
在本發明的一些實施方案中，至少本發明的一個免疫刺激性寡核苷酸包含式5′-Pyr-Pur-3′的免疫刺激性二核苷酸，其中Pyr是天然的嘧啶核苷或其類似物。Pur是天然嘌呤核苷或其類似物。如本文應用的，術語“嘧啶核苷”是指一種核苷，其中所述核苷的堿基組成是嘧啶堿基。類似地，術語“嘌呤核苷”是指一種核苷，其中所述核苷的堿基組成是嘌呤堿基。為了本發明目的，“合成的”嘧啶或嘌呤核苷包括非天然存在的嘧啶或嘌呤堿基，非天然存在的糖部分，或其組合。
在本發明的方法中應用的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子中優選的嘧啶核苷，具有結構(I) 其中D是氫鍵供體；D′選自氫、氫鍵供體、氫鍵受體、親水基團、憎水基團、吸電子基團或給電子基團。
A是氫鍵受體或親水基團；A’選自氫鍵受體、親水基團、憎水基團、吸電子基團和給電子基團；X是碳或氮；和S′是戊糖環或己糖環或非-天然存在的糖。
優選糖環是用磷酸部分、修飾的磷酸部分或其它適于將所述的嘧啶核苷與其它核苷或核苷類似物連接的連接體部分衍生的。
優選的氫鍵供體包括，但不限于，-NH-，-NH2，-SH和-OH。優選的氫鍵受體包括，但不限于，C＝O，C＝S，和芳香雜環中的環氮原子，例如，胞嘧啶的N3。
在一些實施方案中，(I)中的堿基部分是非天然存在的嘧啶堿基。優選非天然存在的嘧啶堿基的實例包括，但不限于，5-羥基胞嘧啶，5-羥甲基胞嘧啶，N4-烷基胞嘧啶(N4-alky cytosine)，優選N4-乙基胞嘧啶(N4-ethyl cytosine)和4-硫尿嘧啶(4-thiouracil)。在一些實施方案中，(I)中的糖部分S′是非天然存在的糖部分。為了本發明之目的，“天然存在的糖部分”是天然作為核酸的一部分存在的糖基，例如，核糖和2′-脫氧核糖，而且“非天然存在的糖部分”是任何不天然作為核酸的一部分存在的糖基，但其可以用作寡核苷酸的骨架，例如，己糖。阿拉伯糖或阿拉伯糖衍生物是優選糖部分的實例。
本發明的方法中應用的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子中優選的嘌呤核苷類似物具有結構(II) 其中D是氫鍵供體；D’選自氫、氫鍵供體和親水基團；A是氫鍵受體或親水基團；X是碳或氮；每個L獨立地選自C，O，N或S；和S′是戊糖環或己糖環，或非-天然存在的糖。
優選地，糖環是用磷酸部分、修飾的磷酸部分或其它適于將所述的嘧啶核苷與其它核苷或核苷類似物連接的連接體部分衍生的。
優選的氫鍵供體包括，但不限于，-NH-，-NH2，-SH和-OH。優選的氫鍵受體包括，但不限于，C＝O，C＝S，和芳香雜環中的環氮原子，例如，鳥嘌呤的N1。
在一些實施方案中，(VI)中的堿基部分是非天然存在的嘌呤堿基。優選非天然存在的嘌呤堿基的實例包括，但不限于，6-硫代鳥嘌呤(6-thioguanine)和7-脫氮鳥嘌呤(7-deazaguanine)，在一些實施方案中，(II)中的糖部分S′是天然存在的糖部分，如前面的結構(I)所述。
第四方面，本發明提供了降低或去除寡核苷酸的免疫刺激活性的方法。該方法包括在含CpG的寡核苷酸的5’-端引入包含二級結構的核酸序列。在該方面的一些實施方案中，二級結構是莖環結構。在該方面一些實施方案中，該二級結構是通過在所述寡核苷酸序列的5’-端氫鍵結合互補序列而獲得的。
第五方面，本發明提供了提高免疫刺激性寡核苷酸穩定性的方法。該方法包括在免疫刺激性寡核苷酸的3’-端引入含二級結構的核酸序列。在該方面的一些實施方案中，該二級結構是莖環結構。在該方面的一些實施方案中，該二級結構是通過在所述寡核苷酸序列的3’-端氫鍵結合互補序列而獲得的。
第六方面，本發明提供了調節免疫刺激性寡核苷酸的免疫刺激活性的方法。該方法包括在免疫刺激性寡核苷酸的3’-端或5’-端引入含二級結構的核酸序列。在該方面的一些實施方案中，該二級結構是莖環結構。在該方面的一些實施方案中，該二級結構是通過在所述寡核苷酸序列的3’-端或5’-端氫鍵結合互補序列而獲得的。
如本文應用的，術語“調制”或“調節”意思是指相對于親代免疫刺激性核酸，提高或降低免疫刺激性核酸的免疫刺激活性。
第七方面，本發明提供了藥物組合物。這些組合物包括在本發明第一、二、三方面單獨或共同公開的任何一種組合物，以及可藥用的載體。
如本文應用的，術語“生理可接受的”意思是指一種物質，其不干擾本發明第一、二、三方面的組合物的有效性，并且與生物學系統如細胞、細胞培養物、組織或生物體相適合。優選地，生物學系統是活的生物體，例如脊椎動物。
如本文應用的，術語“載體”包含任何賦形劑、稀釋劑、填充劑、鹽、緩沖液、穩定劑、增溶劑、脂類，或者本領域中公知用于藥物制劑的其它物質。可以理解，對于一個具體的應用來說，這些載體、賦形劑或稀釋劑的特性依賴于給藥途徑。制備含有這些物質的可藥用的制劑在，例如，Remington’sPharmaceutical Sciences，18th Edition，ed.A.Gennaro，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990，ISBN0-912734-04-3中描述。
本發明的藥物組合物也可包含癌疫苗，包含選自EFG、抗個體基因型的癌疫苗、Gp75抗原、GMK黑色素瘤疫苗、MGV神經節苷脂結合疫苗、Her2/new、Ovarex、M-Vax、O-Vax、L-Vax、STn-KHL theratope、BLP25(MUC-1)、脂質體個體基因型疫苗、黑素瘤疫苗(Melacine)，肽抗原疫苗、毒素/抗原疫苗、MVA-vased疫苗、PACIS、BCG疫苗、TA-HPV、TA-CIN、DISC-病毒和ImmunCyst/TheraCys的癌疫苗。
在本發明不同的實施方案中，本發明第一、二、三、四、五、或六方面的組合物可以與抗原共價連接或與抗原以另外的方式可操作地連接。如本文應用的，術語“可操作地連接”是指能保持本發明第一、二、或三方面的組合物和抗原的活性的任何連接。所述可操作的連接的非限制性實例包括作為同一脂質體的一部分或者其它所述的運載工具(delivery vehicle)或試劑。在本發明第一、二、或三方面組合物與抗原共價連接的一些實施方案中，所述的共價連接優選在本發明第一、二、三方面組合物上免疫刺激性寡核苷酸的可接近的5′端之外的任何位置。例如，抗原可以附著在核苷間連接上，或附著在非核苷酸的連接體。可選地，抗原本身可為非核苷酸的連接體。
在本發明的各種實施方案中，本發明的第一、二、三、四、五、或六方面的組合物可以包括具有反義活性的寡核苷酸。如本文應用的，“反義活性”是指當把寡核苷酸導入細胞或動物時，會引起互補的基因表達的減少。
在本發明的各種實施方案中，本發明的第一、二、三、四、五、或六方面的組合物可以包括適體(aptamer)的寡核苷酸序列。適體是依據它們結合其它分子的能力選自于隨機池(random pool)中的核酸分子。選擇的適體結合核酸、蛋白、小分子有機化合物，以及甚至整個生物體。這些新的分子在醫學和技術中有許多潛在的用途(參見，例如，Burgstaller P.，等Curr Opin DrugDiscov Devel. 5690-700(2002))。
本發明的藥物組合物可通過任何合適的途徑給藥，包括，但不限于，胃腸外、口服、舌下、經皮、局部、鼻內、噴霧、眼內、氣管內、直腸內、陰道、通過基因槍、皮膚貼片或滴眼劑或漱口水形式。這些藥物組合物可以應用已知的方法以有效獲得理想療效的劑量和時間輸送，例如，治療癌癥，治療感染和治療自身免疫性疾病。當系統地給藥時，所述藥物組合物優選以足夠劑量給藥以使本發明的第一、第二和/或第三方面的組合物的血藥濃度達到約0.0001微摩爾到大約10微摩爾。對于局部給藥，遠遠低于此的濃度是有效的，而高得多的濃度是可以耐受的。優選地，免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子的總劑量范圍為每位病人每天約0.0001毫克到每公斤體重每天約200毫克。需要同時或順序地將有效量的本發明的一種或多種治療的組合物給予個人作為單個治療階段。
此外，當免疫刺激性寡核苷酸作為免疫子產生時，下列方案可用于合成。本發明的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子可方便地應用自動化合成儀和亞磷酰胺方法合成，如圖9和圖11示意地描繪。在一些實施方案中，所述的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子通過線性合成方法合成(參見圖9)。該合成的代表性連接體在圖10中列出。如本文應用的，術語“線性合成”是指由免疫子的一個末端開始呈線性進行到另一末端的合成。線性合成允許將相同的或不相同的(就長度、堿基組成和/或摻入的化學修飾而言)單體單元并入免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子。
合成免疫子的可選擇的模式是“平行合成”，其中合成從中心的連接體部分向外進行(參見圖11)。該合成方法代表性的連接體在圖12中列出。如美國專利No.5,912,332所述，附著于固體支持物的連接體可以用于平行合成。可選地，可應用通用的固體支持物，如有磷酸鹽附著的可控孔度玻璃支持物。
免疫子的平行合成比線性合成具有幾個優勢(1)平行合成允許摻入相同的單體單位；(2)與線性合成不同，兩個(或所有)單體單位同時合成，因而合成的步驟數和合成所需要的時間與單體單位相同；并且(3)減少合成步驟會提高最終免疫子產物的純度和收率。
通過線性合成或平行合成方案，在合成的最后階段，本發明的免疫刺激性寡核苷酸或免疫子可方便地用濃縮的氨水脫保護，或如果摻入修飾的核苷如亞磷酰胺供應商的推薦。產物免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫子優選用反相HPLC純化、脫三苯甲基、脫鹽和透析。
CpG DNA 18-21的刺激性區域在5’-末端包含人特異性的‘GTCGTT’基序。在結構性結構域中，形成7、11、15或19堿基對(bp)發夾莖-環結構的互補序列被摻入以與刺激性結構域的3’-端相鄰(表3)。設計自我穩定的CpGDNA以使刺激性結構域不包含任何結構基序(堿基對)，結構性結構域不存在CpG刺激性基序。CpG DNA中的刺激性基序和二級結構是pDC激活所需要的。CpG DNA誘導培養物中的人B細胞的強的濃度依賴性增殖。但是，B-細胞增殖不依賴發夾雙鏈體的長度。自我穩定的CpG DNA激活pDC和B細胞的能力可允許開發治療試劑用于抗癌、哮喘、過敏和感染性疾病，并且作為比刺激B細胞或pDC的那些更有效的佐劑。
序列22具有刺激性區域，但是不包含在其3’-端(結構性結構域)形成發夾結構所必需的互補序列。正相反，CpG DNA 30形成發夾結構(結構性結構域)，但沒有刺激性基序(表3)。序列69，是序列19的類似物，在發夾序列的一條鏈中含有2’-O-甲基-核糖核苷酸。
通過熱溶解(表3)和EMSA研究證實通過CpG DNA形成穩定的發夾結構。如預期的，與不同長度寡核苷酸的標記物相比，CpG DNA 18-21在非變性聚丙烯酰胺凝膠上顯示出具有必需的移動性(mobility)條帶和結構得以確認的發夾結構的形成(數據未顯示)。
人pDCs表達TLR9，且被認為是CpG DNA誘導的IFN-α的主要來源。CpG DNA 18-21誘導IFN-α在人pDC培養物中產生，如圖13所示。IFN-α分泌的水平依賴發夾雙鏈體結構的長度。形成19-bp雙鏈體的CpG DNA 21誘導最高水平的IFN-α(圖13)。盡管所述的應答隨供體不同而變化，CpGDNA中的趨勢是一致的(圖13)。CpG DNA 70，其為含聚(dG)序列的回文CpG寡核苷酸，并已知刺激人pDC，被用作陽性對照。
所有的四種CpG DNA誘導人B細胞在培養物中強的濃度依賴性增殖(圖14)。但是，B-細胞增殖不依賴于所述發夾雙鏈體的長度(圖13)。
研究了通過CpG DNAs 18，19，22和30激活人pDC以誘導IFN-α分泌如前述實驗所示，序列18和19都誘導IFN-α的產生(圖15)。具有刺激性基序，但無二級結構的序列22和無刺激性基序、但有二級結構的序列30不能在pDC培養物中誘導IFN-α產生(圖15)。這些結果說明CpG DNA中的刺激性基序和二級結構對于pDC激活是必需的。
列于圖4B中的B-細胞增殖的數據顯示，形成二級結構的CpG DNA 18和19，以及不能形成二級結構的22，誘導強的B細胞增殖。沒有刺激性基序的序列30誘導最小的增殖，這說明CpG基序對活性是必需的，而二級結構則不是。
TLR9特異地識別CpG DNA而不是RNA。但是2’-O-烷基核糖核苷酸遠端位點特異性摻入在側翼序列中的CpG二核苷酸是容許的。我們合成了CpG DNA 19的類似物，其中靠近含有環區的3’-端的莖序列，被2’-O-甲基核糖核苷酸所取代。CpG DNA 69和19誘導相似水平的IFN-α在人pDC培養物中的分泌(圖16)和在人B-細胞培養物中的增殖(圖16)。這些結果顯示通過這些取代而產生的2’-O-甲基核糖核苷酸取代或構象變化不干擾pDC或B-細胞活化。
Toll-like受體9(TLR9)識別未甲基化的CpG DNA并激活幾個信號途徑，包括壓力激酶(stress kinase)和NF-κB途徑，導致在體外和體內分泌大量的趨化因子和細胞因子包括IFN-α/β、IFN-γ、IL-12，IL-6和TNF-α。但是還沒有建立CpG DNA和它的受體TLR9之間直接的相互作用。的替換受體或共受體(co-receptor)在CpG DNA免疫刺激中的可能的作用已經被提出。具有不同的骨架、序列和結構的CpG DNA以細胞特異的但是以依賴TLR9的方式激活免疫系統。
二級結構在CpG DNA 3’-端的最優布置可以誘導不同的細胞因子譜(profile)。具有人特異性基序的CpG DNA結構在人pDC培養物中誘導高水平的IFN-α，這說明二級結構對于pDC激活可為必需的(數據未發表)。
本發明的CpG DNAs被設計成包括2個不同的結構域，在5’端具有CpG-基序的刺激性結構域，和在3’端含有允許形成發夾雙鏈體的序列的結構性結構域。這些CpG DNAs形成分子內二級結構的能力提供了額外的抗普遍存在的3’-核酸酶的穩定性，因此被命名為自我穩定的CpG DNA。自我穩定的CpG DNA與早期報道的回文序列CpG DNA不同，回文序列CpGDNA形成分子間二級結構，而在結構性結構域不具有CpG基序。
包含CpG二核苷酸的回文序列激活免疫細胞以產生IFN-α/β和IFN-γ。本文描述的自我穩定的CpG DNA允許我們分解被人B細胞和pDC都識別的CpG DNA的刺激性和結構性特點。CpG DNA 18-21以發夾雙鏈體長度依賴性的方式激活pDC。無結構性結構域的控制DNA分子22和無刺激性區域的30都不能誘導IFN-α分泌，這說明刺激性結構域和結構性結構域對于pDC激活都是必需的。與其相反，B-細胞激活只需要刺激性結構域，而不需要結構性結構域。CpG DNA 20和21的低活性顯示CpG DNA中的二級結構可干擾B-細胞激活。事實上，沒有結構性結構域，且核苷酸長度與CpG DNA18相同的CpG DNA 30激活B細胞的水平和19相當，這說明單鏈DNA優選用于B-細胞激活。用30觀察到的B細胞的較低激活可能與非特異性活性相關。
應用CpG DNA 69的本結果顯示DNA/RNA雜合異源雙鏈體不阻礙pDC或B細胞激活。這些結果顯示在結構性結構域區域由2’-O-甲基核糖核苷酸取代所造成的B到A的構像變化對于免疫刺激影響很小或無影響。因此在這些位置允許取代。
綜上所述，在這些研究中，為了人免疫細胞的TLR9-陽性子集pDC和B細胞的最佳激活，我們提出合理組合CpG DNA中的刺激性結構域和結構性結構域。此處顯示的研究允許我們確定激活pDC和B細胞所必需的CpGDNA的特異性特征。CpG刺激性基序對于激活人B細胞是必需的，而刺激性基序和附加的結構性結構域對于人pDC激活都是必需的。不清楚為什么同樣的TLR9受體對于在兩類不同的細胞群中的刺激需要其配體的不同的結構特征。這些事實可能說明涉及到pDC和B細胞中TLR9信號傳導中的不同的適配分子。自我穩定的CpG DNA激活pDC和B細胞的能力允許開發治療劑用于抗癌、哮喘、過敏和感染性疾病，并作為比刺激B細胞或pDC的那些更有效的佐劑。
表3 CpG DNA的示意圖a、序列、二級結構和Tm
a新型的CpGDNA設計的示意圖(方框)顯示重要的刺激性結構域和結構性結構域。刺激性結構域而不是結構性結構域含有適當CpG基序b除去70之外，所有的序列均為硫代磷酸酯修飾的。69中以斜體顯示的核苷酸表示2’-O-甲基核糖核苷酸，70中加下劃線的核苷酸表示磷酸二酯骨架；cND-未檢測到。
以下的實施例旨在進一步闡明本發明一些優選地實施方案，但無意限制本發明的范圍。
實施例實施例1寡核苷酸的合成、純化和熱溶解譜在PerSeptive Biosystem的8909 Expedite DNA合成儀(PerSeptiveBiosystem，Boston，MA)上用β-氰乙基亞磷酰胺以1-2微摩爾的規模合成CpG寡核苷酸。dA，dG，dC和T的亞磷酰胺獲自PE Biosystems(Foster City，CA)。如Iyer R.P.，等(J.Am.Chem.Soc.1121253-1254(1990))所述，用碘氧化試劑獲得所述的硫代磷酸酯骨架修飾。所有的寡核苷酸用標準程序脫保護，用HPLC純化，通過以USP標準的無菌水透析用于沖洗。將所述寡核苷酸凍干并在蒸餾水中重新溶解，通過260nm UV吸收值測定濃度。以CGE和MALDI-TOF質譜(Applied Biosystem’s Voyager-DETM STRBiospectrometryTM Workstation)對所有寡核苷酸的純度和分子量分別進行表征。全長寡核苷酸的純度范圍是90-96％，其余則為通過CGE和/或變性PAGE確定的短1-2個核苷酸(n-1和n-2)。所有寡核苷酸包含經Limulus實驗(Bio-Whittaker，現在稱為Cambrex Bio Science Walkersville，Inc.，Walkersville，MD)確定的低于0.1EU/mL的內毒素。
熱溶解研究在1mL 10mM磷酸氫二鈉溶液中進行，其pH 7.2±0.2，含150mM NaCl和2mM MgCl2。將該溶液加熱到95℃10分鐘，且允許在4℃過夜貯存之前緩慢達到室溫。寡核苷酸鏈的終濃度為2.0μM。UV熱溶解測定在連接于peltier溫控裝置和個人計算機的Perkin-Elmer Lambda 20分光光度計上，用1cm通道長度石英比色杯以0.5℃/分鐘的加熱速度的在260nm進行。將一半解離的溫度視為熔解溫度(Tm)，并由第一次衍生圖獲得。每個Tm值是二或三個獨立實驗的平均值，而且該值在±1.0℃之內。
17-元(17-mer)的包含‘GACGTT’六聚體基序的硫代磷酸酯寡核苷酸(1)被用做陽性對照(表1)。寡核苷酸2-7包含與1的部分互補的5-、11-或17個核苷酸的附加序列。延伸在3’-端(2-4)或5’-端(5-7)連接，并包含如Hirao，I.，等(Nucleic Acids Res.22576-582(1994))所述的允許形成穩定莖-環的GAA三聚體。通過UV熱溶解試驗確定2-7的發夾結構的形成。在含150mM NaCl和2mM MgCl2，pH7.2的10mM磷酸鈉中，40-66℃的Tm值顯示，在暴露于10μg/ml的寡核苷酸18、19、20和21之后在漿細胞樣樹突狀細胞中α干擾素(IFN-α)的實驗條件下，2-7形成了穩定的二級結構(表1)。
實施例2細胞培養條件和試劑來自4-8周大的BALB/c、C57BL/6或C3H/HeJ小鼠的脾細胞在如Zhao，Q.等(Biochem Pharmacol.51173-182(1996))和Branda，R.F.，等(Biochem.Pharmacol.452037-2043(1993))所述的RPMI完全培養基中培養。小鼠J774巨噬細胞(American Type Culture Collection，Manassas，VA)在加入10％(v/v)胎牛血清和抗生素(100IU/mL青霉素G/鏈霉素)的Dulbecco’s改良Eagles培養基中培養。所有其它培養試劑購自Mediatech(Gaithersburg，MD)。
實施例3脾細胞增殖實驗通常，小鼠(Balb-C)脾細胞與濃度為0.1，1.0和10.0μg/ml的CpG寡核苷酸一起培養48小時，并用3H-尿嘧啶核苷摻入來測定細胞增殖，如Zhao，Q.，等(Biochem Pharmacol.51173-182(1996))所述。
起初，檢測寡核苷酸1，2和5在培養物中誘導BALB/c小鼠脾細胞增殖的能力。寡核苷酸1和2誘導劑量依賴性的脾細胞增殖。沒有莖-環結構的親代寡核苷酸1在1.0μg/mL的濃度顯示增殖指數為6.0±0.3(圖1A)。在其3’-端形成莖-環結構的寡核苷酸2在同樣濃度下得到增殖指數為9.0±2.5。然而，在其5’-端形成莖-環結構的寡核苷酸5在同樣濃度下顯示出較低的增殖指數1.5±0.3，這與PBS對照近似(圖1A)。
實施例4細胞因子誘導實驗小鼠脾細胞或J774細胞分別以5×106或1×106個細胞/mL鋪入24孔板中。將溶解在TE緩沖液(10mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA)的CpG寡核苷酸加入細胞培養物中分別至0.03，0.1，0.3，1.0，3.0或10.0μg/mL的終濃度。然后將細胞在37℃溫育24小時，收集上清進行ELISA實驗。每個CpG寡核苷酸進行2到3次實驗，并且每個濃度重復3次。IL-12和IL-6的分泌通過夾心ELISA進行測定，如Bhagat L.，等(Biochem.Biophys.Res.Commun.300853-861(2003))所述。所需要的試劑，包括細胞因子抗體和標準物購自BD Biosciences Pharmingen(San Diego，CA)。
CpG寡核苷酸誘導大量的細胞因子，包括IL-12和IL-6。在BALB/c小鼠脾細胞培養物中，測試化合物1和2通過濃度-依賴機制誘導IL-12和IL-6。親代寡核苷酸1在3.0μg/mL的濃度，誘導1514±113pg/mL的IL-12和7681±839pg/mL的IL-6(圖2)。包含3’-發夾的寡核苷酸2誘導稍多的IL-12(1771±286pg/mL)和較少的IL-6(2582±300pg/mL)。但是具有5’-發夾的寡核苷酸5不能誘導細胞因子分泌。這些結果顯示5’-端而不是3’-端的穩定發夾環封閉了免疫刺激活性。
CpG DNA 3和4具有延伸至GACGTT基序或者一直到達5’-端的3’-發夾莖。結果，它們含有2個CpG基序，上端鏈中含有GACGTT，在底部是它的互補序列AACGTC(表1)。寡核苷酸6和7具有近似的長5’-發夾。盡管具有2個CpG基序，與寡核苷酸1相比，CpG DNA 3和4誘導較低水平的IL-12，誘導最少的或不誘導IL-6(圖2)。具有5’-發夾的寡核苷酸6和7在同樣的實驗條件下都不能誘導細胞因子分泌。寡核苷酸4誘導最少的細胞因子顯示莖結構延伸至5’-端是有害的，并且可能干擾識別和后續的免疫刺激。這些結果說明延伸至5’-端的雙鏈體莖結構干擾免疫刺激。
由于在寡核苷酸4的5’-端的堿基-配對抑制了免疫刺激，用CpG DNA8-10來研究在兩個末端的雙鏈體的形成。寡核苷酸8包含18個核苷酸，和與寡核苷酸1一樣的GACGTT基序。寡核苷酸9和10中自我互補的3’-或5’-端延伸作為粘性末端以形成8個堿基對的二聚體(表1)。這些雙鏈體含有磷酸二酯鍵以減少對于免疫刺激的任何長度-依賴性的硫代磷酸酯效應。寡核苷酸9在3’-端二聚化并且顯示與親代寡核苷酸8相似的IL-12和IL-6誘導(圖3)。然而，形成5’-雙鏈體的寡核苷酸10誘導最少的IL-12和IL-6(圖3)。因此，形成5’-雙鏈體的特性與免疫刺激的損失高度相關。這些結果說明在5’-而不是在3’-端的雙鏈體干擾免疫刺激。
也檢測了寡核苷酸1-7在J774細胞培養物誘導細胞因子分泌的能力。在寡核苷酸濃度為10μg/mL時獲得的IL-12和IL-6數據補充了來自脾細胞培養物試驗中得到的結果(圖5)。這些結果進一步證實了受體從其5’-端閱讀CpG DNA序列，可接近的5’-端對于CpG DNA活性是必需的。在CpG寡核苷酸中存在延伸至5’-端的二級結構可干擾受體閱讀，并由此干擾免疫刺激活性。
也研究了本發明的寡核苷酸在漿細胞樣樹突狀細胞中誘導α干擾素(INF-α)產生的能力。關于分離和培養這些細胞參考Krug，A.，等(Eur.J.Immunol，312154-2163(2001)。結果顯示于圖6，7和8。這些數據說明具有3’發夾結構的本發明的核酸分子刺激α干擾素的產生，而5’-端發夾結構則抑制免疫刺激作用，所述的免疫刺激作用即這些分子產生α干擾素。
實施例5小鼠脾腫大實驗雌性BALB/c小鼠(4-6周，19-21gm)被分為3組。將CpG寡核苷酸溶解在無菌的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，以5mg/kg的劑量皮下給藥(SC)于小鼠。如Zhao，Q等(Biochem Pharmacol.51173-182(1996))和Branda，R.F.，等(Biochem.Pharmacol.452037-2043(1993))所述，48小時后處死小鼠，收獲其脾臟并稱重。
將寡核苷酸1，2和5以5mg/kg的劑量給藥于BALB/c小鼠，以確定它們是否在體內誘導脾臟增大。與注射PBS的對照組的小鼠相比，對寡核苷酸處理應答而致的脾臟重量的增加被認為是CpG寡核苷酸免疫刺激活性的結果(Zhao，Q.，等Biochem Pharmacol.51173-182(1996)；Branda，R.F.，等Biochem.Pharmacol.452037-2043(1993))。體內的研究結果列于圖1B。沒有莖-環結構的寡核苷酸1和在5’-端具有莖-環形成序列的寡核苷酸5，與接受PBS的對照組相比，分別使脾臟增重大約29％和15％。相比之下，在3’-端具有莖-環結構的寡核苷酸2與對照組相比引起大約48％的脾臟增重。
實施例6NF-κB途徑的激活已經顯示Toll-like受體9(TLR9)識別細菌、質粒和合成DNA中未甲基化的CpG-二核苷酸(Hemmi H.，等Nature 408740-745(2000))以及激活壓力激酶(stress kinase)(Yi A.K.，等J.Immunol.1614493-4497(1998))和NF-κB途徑(Stacey K.J.，等J.Immunol.1572116-2122(1996))。在用CpG DNA處理的J774細胞中進行NF-κB激活并通過EMSA分析，如Yu D.，等(Biochem.Biophys.Res.Commun.29783-90(2002))和Bhagat L.，等(Biochem.Biophys.Res.Commun.300853-861(2003))所述。
應用EMSA在小鼠巨噬細胞核提取物中檢測寡核苷酸1-7在J774中激活NK-κB途徑。圖4顯示出獲得的結果。如復合物的存在所顯示，親代寡核苷酸1和8都激活NF-κB。在3’-端具有環的寡核苷酸2-4如適當的復合物的存在所顯示，也激活NF-κB。相比之下，具有5’-端環的寡核苷酸5-7在J774細胞中不能激活轉錄因子NF-κB(圖4)。對照的非CpG寡核苷酸在同樣的實驗條件下不能激活NF-κB(C道)。這些結果與小鼠脾細胞培養物實驗中獲得的數據是一致的。
實施例7電泳遷移率變動分析(EMSA)將大約0.2OD的CpG DNA和其它標記物溶解于25μL的100mMNaCl，10mM磷酸鈉，pH 7.2的緩沖液中，加熱至90℃15分鐘，允許回到室溫，并保存在4℃直到在凝膠上分析。將制備好的DNA樣品與甘油緩沖液混合，并溶解在15％的非變性聚丙烯酰胺凝膠上。在260nm紫外光下觀察凝膠。
實施例8人B細胞和漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)的分離來自新鮮抽取的健康志愿者血液的PBMC(CBR Laboratories，Boston，MA)通過Ficoll密度梯度離心法(Histopaque-1077，Sigma)進行分離，而B細胞用CD19細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec)按照廠商說明通過陽性選擇從PBMC中進行分離。
實施例9B細胞增殖實驗總量為1×105B細胞/200μl以0.3，1.0，3.0或10.0μg/mL濃度的CpGDNA刺激64小時，再以0.75μCi的[3H]-胸苷脈沖，8小時后收獲。用液體閃爍計數器(liquid scintillation counter)測量放射性的摻入。表4顯示6種CpGDNA在終濃度為10.0μg/mL時的B細胞增殖的平均值±SD。
表4人B-細胞增殖實驗中的免疫子結構和免疫刺激活性(72小時) 正常狀態代表硫代磷酸酯連接，下劃線代表2’-O-甲基核糖核苷酸；X代表C3連接體。
實施例10人pDC培養和IFN-αELISA用BDCA-4細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec)按照廠商說明從人PBMC中分離pDC。將pDC以1×106細胞/mL，200μL/孔鋪于96孔板。將寡核苷酸加入細胞培養物至終濃度為0.3，1.0，3.0或10.0μg/mL，并在37℃溫育24小時。然后收集上清，用ELISA試劑盒(PBL)檢測α干擾素、IL-6和IL-10。表5A和5B顯示6種寡核苷酸在濃度為10.0μg/mL時α干擾素的平均值±SD。
表5A人樹突狀細胞實驗中的免疫子結構和免疫刺激活性(24小時)

正常狀態代表硫代磷酸酯連接，下劃線代表2’-O-甲基核糖核苷酸，X代表C3連接體R＝2’-脫氧-7-脫氮鳥苷表5B人樹突狀細胞實驗中的免疫子結構和免疫刺激活性(24小時)



正常狀態代表硫代磷酸酯連接，斜體代表磷酸二酯連接。
下劃線＝2’-OMe-核苷酸R＝2’-脫氧-7-脫氮鳥苷G1＝2’-脫氧-7-脫氮guanoiseX＝甘油連接體實施例11細胞因子分析IFN-2和IL-6在脊椎動物細胞，優選BALB/c小鼠脾細胞或人PBMC中的分泌，通過夾心ELISA測定。所需試劑包括細胞因子抗體和細胞因子標準物購自PharMingen，San Diego，CA。將ELISA板(Costar)在PBSN緩沖液(PBS/0.05％疊氮鈉，pH 9.6)中與5μg/mL的適當抗體在4℃溫育過夜，然后以PBS/1％ BSA 37℃封閉30分鐘。細胞培養物上清和細胞因子標準物用PBS/10％FBS適當稀釋，一式三份加入所述的板中，并在25℃溫育2小時。將板用1μg/mL適當的生物素化的抗體覆蓋，并在25℃溫育1.5小時。然后用PBS-T緩沖液(PBS/0.05％吐溫20)充分洗滌，加入抗生物素蛋白鏈菌素結合的過氧化物酶(streptavidin conjugated peroxidase)(Sigma，St.Louis，MO)后再次在25℃溫育1.5小時。將所述的板用Sure BlueTM(Kirkegaard and Perry)的顯色試劑顯影，并通過加入終止溶液(Kirkegaard and Perry)終止所述反應。用Ceres 900 HDI分光光度計(Bio-Tek Instruments)測定顏色變化。
人外周血單核細胞(PBMC)通過Ficoll-Paque密度梯度離心(Histopaque-1077，Sigma，St.Louis，MO)從健康志愿者的外周血中分離。簡言之，肝素化血液在錐形離心機中于Histopaque-1077(等體積)上分層，并在室溫以400xg離心30分鐘。小心分離包含單核細胞的血沉棕黃層(buffy coat)，用等滲的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)通過250xg離心10分鐘洗兩次。然后將得到的細胞沉淀重懸于含有L-谷氨酰胺的RPMI 1640培養基(MediaTech，Inc.，Herndon，VA)，并補充10％的熱滅活FCS和青霉素-鏈霉素(100U/ml)。在24孔板中按照1×106細胞/ml/孔在存在或不存在寡核苷酸的情況下將細胞培養不同的時間。在溫育期的末尾，收獲上清液，并在-70℃凍存，直到通過夾心ELISA對包括IL-6(BD Pharmingen，San Diego，CA)和IFN-α(BioSourceInternational)的不同細胞因子進行檢測。結果在下面的表6A和6B中顯示。
在所有的實例中，細胞培養物上清中IFN-2和IL-6的水平分別由IFN-2和IL-6在相同實驗條件下構建的標準曲線計算而得。
表6A人PBMC實驗中的免疫子結構和免疫刺激活性(24小時) 正常狀態代表硫代磷酸酯連接，下劃線代表2’-OMe-核糖核苷酸，X代表C3-連接體R＝2’-脫氧-7-脫氮鳥苷表6B人PBMC實驗中的免疫子結構和免疫刺激活性(24小時)



正常狀態代表一個硫代磷酸酯連接，斜體代表一個磷酸二酯連接。
下劃線＝2’-OMe-核苷酸R＝2’-脫氧-7-脫氮鳥苷G1＝2’-脫氧-7-脫氮guanoiseX＝甘油連接體實施例12B細胞實驗將B細胞以1×106個細胞/mL，200μL/孔鋪于96孔板。將寡核苷酸加入細胞培養物至終濃度為0.3，1.0，3.0或10.0μg/mL，并在37℃溫育24小時。然后收集上清液并用ELISA試劑盒(由PBL提供)檢測IL-6。表7顯示供體5-10在寡核苷酸終濃度為10.0μg/mL時的平均值±SD。
表7人B細胞實驗中的免疫子結構和免疫刺激活性(24小時) 正常狀態代表硫代磷酸酯連接；下劃線代表2’-OMe-核糖核苷酸；X代表C3-連接體R＝2’-脫氧-7-脫氮鳥苷流式細胞分析CD69和CD86的細胞表面標記物以Coulter Epics-XL流式細胞儀利用購自BD Pharmingen(San Diego，USA)的抗-人CD69-Fitc和CD86-Fitc進行檢測。染色方法簡述如下。激活的培養物細胞用10％的人AB血清(Sigma)在染色緩沖液(含1％BSA和0.1％NaN3的PBS)中在40℃封閉1小時，并用所述的抗體在4℃過夜染色。PBMC(4×105)用CD69-Fitc和CD86-Fitc染色，PDC(2×105)用CD86-Fitc染色。用Coulter System II軟件獲取和分析細胞染色數據。
表8來自人PBMC的BC的免疫子結構和表達(24小時)





正常狀態代表硫代磷酸酯連接；斜體代表磷酸二酯連接。
下劃線＝2’-OMe-核苷R＝2’-脫氧-7-脫氮烏苷G1＝2’-脫氧-7-脫氮guanoiseX＝甘油連接體表9來自人PBMC的DC的免疫子結構和表達(24小時)




正常狀態代表硫代磷酸酯連接，斜體代表磷酸二酯連接。
下劃線＝2’-OMe-核苷R＝2’-脫氧-7-脫氮鳥苷G1＝2’-脫氧-7-脫氮guanoise
X＝甘油連接體相等物為了清楚和理解的目的，已經相當詳細地描述了上述發明，本領域的技術人員通過閱讀此公開可以理解，在不背離本發明和附加的權利要求的真實范圍的情況下，可以對形式和細節進行各種不同的改變。
權利要求
1.一種免疫刺激性核酸，其包含寡核苷酸序列，該寡核苷酸至少包含一個二核苷酸，該二核苷酸選自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*，其中，C是胞苷或2，-脫氧胞苷，G是鳥苷或2’-脫氧鳥苷，C*是2′-脫氧胸苷、1-(2′-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤、2’雙脫氧-5-鹵代胞苷、2’雙脫氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2′-脫氧-2′-取代阿糖胞苷、2′-O-取代阿糖胞苷、2′-脫氧-5-羥基胞苷、2′-脫氧-N4-烷基-胞苷、2′-脫氧-4-硫代尿苷，或其它非天然嘧啶核苷，G*是2′脫氧-7-脫氮-鳥苷、2′-脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2′-脫氧-2′取代-阿糖鳥苷、2′-O-取代-阿糖鳥苷、2′-脫氧肌苷，或其它非天然嘌呤核苷，p是核苷之間的連接體，其選自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯，其中所述的寡核苷酸序列在該寡核苷酸序列的3’-末端有二級結構。
2.權利要求1的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列的長度為約12到約50個核苷酸。
3.權利要求1的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列的長度為約12到約26個核苷酸。
4.權利要求1的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列形成了3’-端莖環二級結構。
5.權利要求1的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列在3’-端具有回文或互補序列。
6.權利要求1的免疫刺激性核酸選自SEQ ID NOS2，3，4，9，12，13，14，18，19，20，21，24，25，26，27，28，29，30，32，33，34，35，36，37或38。
7.一種免疫刺激性核酸，其具有降低的免疫刺激活性，包含寡核苷酸序列，該寡核苷酸序列包含至少一個二核苷酸，該二核苷酸選自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*，其中，C是胞苷或2’-脫氧胞苷，G是鳥苷或2’-脫氧鳥苷，C*是2′-脫氧胸苷、1-(2′-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤、2’-雙脫氧-5-鹵代胞苷、2’-雙脫氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2′-脫氧-2′-取代阿糖胞苷、2′-O-取代阿糖胞苷、2′-脫氧-5-羥基胞苷、2′-脫氧-N4-烷基-胞苷、2′-脫氧-4-硫代尿苷，或者其它非天然嘧啶核苷，G*是2′-脫氧-7-脫氮鳥苷、2′-脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2′-脫氧-2′取代-阿糖鳥苷、2′-O-取代-阿糖鳥苷、2′-脫氧肌苷，或其它非天然嘌呤核苷，p是核苷之間的連接體，其選自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯，其中，所述的寡核苷酸序列在該寡核苷酸序列的5’-端有二級結構。
8.權利要求7的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列的長度為約12到約50個核苷酸。
9.權利要求7的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列的長度為約12到約26個核苷酸。
10.權利要求7的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列形成5’-端的莖環二級結構。
11.權利要求7的免疫刺激性核酸，其中寡核苷酸序列在5’-端具有回文或互補序列。
12.權利要求7的免疫刺激性核酸選自SEQ ID NOS5，6，7，10，15，16或17。
13.一種降低或去除寡核苷酸的免疫刺激活性的方法，該寡核苷酸具有至少一個選自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*的二核苷酸，其中，C是胞苷或2’-脫氧胞苷，G是鳥苷或2’-脫氧鳥苷，C*是2′-脫氧胸苷、1-(2′-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤、2’-雙脫氧-5-鹵代胞苷、2’-雙脫氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2′-脫氧-2′-取代阿糖胞苷、2′-O-取代阿糖胞苷、2′-脫氧-5-羥基胞苷、2′-脫氧-N4-烷基-胞苷、2′-脫氧-4-硫代尿苷，或者其它非天然嘧啶核苷，G*是2′-脫氧-7-脫氮鳥苷、2′-脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2′-脫氧-2′取代-阿糖鳥苷、2′-O-取代-阿糖鳥苷、2′-脫氧肌苷，或其它非天然嘌呤核苷，p是核苷之間的連接體，其選自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯，該方法包括在寡核苷酸的5’-端引入含二級結構的核酸序列。
14.權利要求13的方法，其中二級結構是莖環結構。
15.權利要求13的方法，其中二級結構是氫鍵結合至回文序列或互補序列。
16.一種包含權利要求1的免疫刺激性核酸和一種可藥用的載體的藥物組合物。
17.一種包含權利要求7的免疫刺激性核酸和一種可藥用的載體的藥物組合物。
18.一種包含至少兩個寡核苷酸的免疫刺激性核酸，其中該免疫刺激性核酸具有二級結構，而且該免疫刺激性核酸包含常規結構結構域A-結構域B-結構域C(I)其中結構域A可以是5’-3’或3’-5’或2’-5’DNA、RNA、RNA-DNA、DNA-RNA，它們具有或不具有回文或自我互補結構域，該結構域包含或不包含至少一個二核苷酸，該二核苷酸選自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*，其中，C是胞苷或2’-脫氧胞苷，G是鳥苷或2’-脫氧鳥苷，C*是2′-脫氧胸苷、1-(2′-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤、2’-雙脫氧-5-鹵代胞苷、2’-雙脫氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2′-脫氧-2′-取代阿糖胞苷、2′-O-取代阿糖胞苷、2′-脫氧-5-羥基胞苷、2′-脫氧-N4-烷基-胞苷、2′-脫氧-4-硫代尿苷，或者其它非天然嘧啶核苷，G*是2′-脫氧-7-脫氮鳥苷、2′-脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2′-脫氧-2′-取代-阿糖鳥苷、2′-O-取代-阿糖鳥苷、2′-脫氧肌苷或其它非天然嘌呤核苷，而且p是核苷之間的連接體，其選自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯，結構域B是連接結構域A和C的連接體，可以是3’-5’連接、2’-5’連接、3’-3’連接、磷酸基團、核苷，或者非核苷連接體，所述的非核苷連接體可以是脂肪族的、芳香族的、芳基的、環狀的，手性的、非手性的，可以是肽，碳水化合物、脂類、脂肪酸、單-、三-、六聚乙二醇，或者雜環部分，并且結構域C可以是5’-3’或3’-5’、2’-5’DNA、RNA、RNA-DNA，DNA-RNA Poly I-Poly C，它們具有或不具有回文序列或自我互補序列，該序列可以有或沒有二核苷酸，該二核苷酸選自CpG，C*pG，C*pG*或CpG*，其中，C是胞苷或2’-脫氧胞苷，G是鳥苷或是2’-脫氧鳥苷，C*是2′-脫氧胸苷，1-(2′-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤，2’-雙脫氧-5-鹵代胞苷，2’-雙脫氧-5-硝基胞苷，阿糖胞苷，2′-脫氧-2′-取代阿糖胞苷，2′-O-取代阿糖胞苷，2′-脫氧-5-羥基胞苷，2′-脫氧-N4-烷基-胞苷，2′-脫氧-4-硫代尿苷，或者其它非天然嘧啶核苷，G*是2′-脫氧-7-脫氮鳥苷，2′-脫氧-6-硫代鳥苷，阿糖鳥苷，2′-脫氧-2′-取代-阿糖鳥苷，2′-O-取代-阿糖鳥苷，2′-脫氧肌苷，或其它非天然嘌呤核苷，p是核苷之間的連接體，其選自磷酸二酯或硫代磷酸酯。
19.權利要求18的免疫刺激性核酸，其具有選自SEQ ID NOS1-38的序列。
20.權利要求18的免疫刺激性核酸，其具有選自SEQ ID NOS39-68的序列。
全文摘要
本發明提供了免疫刺激性核苷酸，其含有至少一個CpG二核苷酸和一個在5’－或3’－端的二級結構。這些寡核苷酸具有降低或增強免疫刺激性的特性。本發明確定了5’－端二級結構比3’－端二級結構更顯著地影響免疫刺激活性。本發明也提供了增高或降低含有CpG的核酸的免疫刺激活性的方法。
文檔編號A01N43/04GK1835963SQ200480023195
公開日2006年9月20日 申請日期2004年6月10日 優先權日2003年6月11日
發明者埃坎巴·R·坎迪馬拉, 拉克什米·巴加特, 雷詹德拉·K·潘德伊, 郁東, 薩德希爾·阿格拉沃爾 申請人:艾德拉藥物股份有限公司