專利名稱：棉花產量性狀或纖維品質的分子標記的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種棉花產量性狀或纖維品質的分子標記。具體地，本發明涉及一種利用SSR標記和BSA方法篩選棉花產量性狀或纖維品質的分子標記的方法，以及公開了所述分子標記的序列。另外，本發明公開了所述分子標記在棉花育種中的應用。
背景技術：
棉花是我國重要的經濟作物，在國民經濟和人民生活中發揮著極為重要的作用。棉纖維是紡織工業的主要原料，具有保溫、隔熱、吸濕、透氣、舒適和容易染色等特點，自古以來就倍受青睞。在崇尚天然、追求舒適的現代社會生活中棉纖維更加受到人們的關注，它的種種優點也是化學纖維所無法取代的。
棉花纖維品質的優劣，決定著棉紗和織布的質量，所以品質育種一直是棉花育種家的主要目標。經濟的全球化和紡織工業的發展以及人民生活水平的提高，對棉花纖維品質提出了更高的要求。
棉花纖維品質常用指標為棉花的纖維強度、纖維長度、整齊度、麥克隆值、成熟度。
世界棉花纖維品質改良最初是增加纖維長度開始的，直到20世紀80年代初，棉花品質還是主要與長纖維有關。20世紀80年代末，國內外棉花育種家開始重視以增加纖維強度為主的品質改良研究。
二十世紀八十年代以后，棉花的纖維品質備受育種家的關注，育種重點向加強內在品質的轉移，纖維品質的改良列為育種的重要目標，取得顯著成效，我國均將隨著我國先后育成了一些達到國際中等水平的棉花品種，以“中棉所12”為代表的一批抗病、優質、高產(比強度20.18cN·tex-1)棉花新品種，取代了高產但感病且纖維內在品質較差的“魯棉1號”(比強度16.46cN·tex-1)”等一些品種，使我國棉花纖維品質由低強度上升到中高強度水平。大部分棉纖維比強度為17.8cN·tex-1(ICC標準)，到1995年70％以上的纖維比強度為21.7cN·tex-1(黃滋康，1996)。“九五”棉花育種攻關項目中，把創造優質纖維種質和培育優質親本材料作為重要研究內容，前三年中我國選育出高強纖維種質12份，比強度在24.5cN·tex-1以上。近10年來，纖維比強度在22cN·tex-1以上的品種明顯增多，麥克隆值在3.7-4.2之間。
上世紀90年代中后期，我國棉花品質改良進入瓶頸期，雖然目標仍是在保持其他品質指標的同時，重點提高纖維強度，但由于缺乏優異種質系和親本材料，也缺乏創新技術，所以主要品質指標改觀并不明顯(郭香墨，1999)。
近15年來國內外棉花育種家除了在利用常規育種方法通過回交和互交等雜交方式，在打破產量與纖維品質性狀的負相關方面取得較大進展，但傳統育種周期長，成本高，預見性差(張天真，2000)。目前國內已經利用分子生物學手段大規模開展了改良棉纖維品質的分子育種研究。與常規育種相比，分子育種快捷、預見性好、周期短、選擇效率高。
鑒定、分離和克隆優良纖維品質基因，是國內外棉花生物技術的熱點之一。利用分子手段對棉花纖維性狀進行遺傳操作依賴于識別和分離控制控制纖維發育或間接影響特定的纖維結構性狀的基因。在棉花纖維的改良中，特異啟動子是首要的基因工程元件，特別是驅動外源基因在纖維中表達，更需要特異性強、活性高的啟動子，以實現定向操作。因此強特異性、高活性的啟動子和功能基因的分離克隆與鑒定研究將非常重要(趙廣榮等，2002)。
棉花自開花受精至胚胎發生到萌發早期可以分成胚胎形成早期、中期、晚期三個階段，胚胎發生過程中大約25000-30000種不同的mRNA參與，這些mRNA按其在胚胎發生過程中表達的時間差異可以分成六大類，其中第五類mRNA在胚胎發生晚期出現，含量十分豐富，并在種子萌發后迅速消失。這一類mRNA統稱為胚胎發生晚期豐富mRNA。編碼這些mRNA的基因統稱為Lea基因家族。Galau等人利用陸地棉Coker 201構建的cDNA文庫，通過減法雜交的方法率先分離Lea基因家族的17個cDNA克隆，并把這些基因分成LeaI、Lea2(2A和2B)兩大基因家族。LeaI基因家族表達受ABA調節，LeaE基因家族的表達極少受ABA調節，mRNA行為在家族內表現出協同調節的特征。
目前，已經通過三種途徑分離和測序十幾個基因。第一條途徑是利用其它作物中已知序列的克隆與cDNA文庫克隆值直接雜交，篩選出與外來序列高度同源的cDNA克隆。目前采用該方法已經分離到基因有P36A、rbcI、trn4、rbcs、Cab-151等幾個基因。第二條途徑是構建陸地棉(如Coker201、Coker312)的cDNA文庫，然后利用減法雜交的方法篩選出與棉花發育相關的cDNA克隆，并對有關cDNA克隆進行測序，通過體外翻譯系統進行蛋白質結構分析，如E6基因、Lea基因家族。抽提不同發育階段的棉花組織mRNA，進行反轉錄，然后進行序列膠的分析的DDRT-PCR方法是目前棉花進行基因克隆與分離的最新途徑。利用這種差異顯示的方法獲得了編碼抗黃萎病半萜類植保素的cDNA片斷，纖維發育中關鍵酶基因。此外，M.E.John等還分離到在棉花花藥中特異表達的啟動子，通過與Gus接合，獲得轉基因煙草能夠特異表達。與該啟動子相連的結構基因編碼類似于PG基因功能(左開井，1998)。
王學德等(2000)以野生型陸地棉遺傳標準系“TM-1”為對照，用RT-PCR技術從4種纖維突變體的纖維細胞RNA及其基因組DNA中分別克隆了在纖維細胞中優勢表達的mRNA及其基因，通過野生型與突變體間核苷酸序列的比較，發現在纖維突變體基因組DNA中該基因的結構和表達發生了明顯的變異，并就這些變異與棉纖維發育間可能存在的關系進行了初步的探討。
從棉花中克隆的E6基因是一類在纖維細胞中優勢表達的特異表達基因。克隆這一基因不但有助于棉花纖維發育的分子機理的研究，而且可用于棉花纖維性狀改良的基因工程。例如John等人利用纖維特異啟動子構建的纖維特異表達載體，使微生物(alcaligenes eutrophus)的兩個熱塑性聚酯化合物基因(Pha B和Pha C)在棉花纖維中特異表達，轉基因棉花的纖維具有更好的隔熱特性。又如，在木質醋桿菌(Acetobaceter xylinum)中，現已發現和鑒定了纖維素合成酶的操縱子，內含有4個纖維素合成所必需的基因bscA，bcsB bcsC bcsD，其中bcsB或bcsA可能是纖維素合成酶基因，bcsD可能參與纖維素的結晶化過程，就有可能提高棉纖維品質。如果將E6啟動子與木質醋桿菌的纖維素合成酶基因融合轉化到棉花中，就有可能提高棉纖維品質。
選擇是育種中最重要的環節之一，傳統的基于表型的選擇方法存在許多缺點、效率較低，分子標記為實現對基因型的直接選擇提供了可能，即分子標記輔助選擇(Molecular marker-assisted selection，MAS)。利用與目標性狀緊密連鎖的分子標記可在生育早期階段作出判斷，進行選擇，不受田間自然條件的影響。對重要農藝性狀進行早期鑒定可以大大縮短育種時間，提高效率加快育種進程。理論上只要回交3代就可選到理想的材料。
MAS是現代分子生物學與傳統遺傳育種的結合點，借助分子標記可以對育種材料從DNA水平上進行選擇，從而達到作物產量、品質和抗性等綜合性狀的高效改良。如篩選到與主要農藝性狀連鎖的分子標記，則通過利用分子標記進行連鎖分析，利于棉花基礎理論研究和育種工作開展。應用分子標記構建棉花遺傳圖譜，可以提高育種工作的預見性。
Reddy等(1996)利用長絨海島棉3-79×陸地棉TM-1的F2及雙親進行AFLP分析，所使用的64對引物中，每一對引物均檢測到3～16個AFLP標記在F2群體中發現了300個標記與親本的長絨和高產性狀有關。張天真等科研工作者在棉花纖維品質的分子標記輔助育種方面做了大量的工作，并初見成效。分子標記輔助的QTL定位是近十年來發展起來的新興研究領域，進展很快。棉花的許多經濟性狀也是由QTL控制(Quantitative Trait Loci)，因而進行棉花QTL定位具有重要的理論與實踐意義。沈新蓮等(2001)選用篩選出的2個與高強纖維連鎖的FSR1933、FSR41047等2個RAPD標記和一個SSR標記，研究主效QTL的穩定性和分子標記輔助選擇的效果。結果證明這三個標記在不同遺傳背景、不同分離世代遺傳穩定，有、無標記個體的纖維強度達極顯著水平，主效QTL進行分子標記輔助選擇提高棉花纖維強度是有效的。
尋找與目標基因緊密連鎖的分子標記離不開強有力的分子標記技術和特殊的遺傳材料及分析手段。尋找與目標基因緊密連鎖的分子標記目標性狀基因的方法主要有兩種目標基因的近等位基因系分析NIL(Young，1998；Martin G.B.，1991)以及目標基因F2代分離群體的分離群體分組分析法(BulkedSegregant Analysis，BSA)。
分子標記輔助的QTL定位是近十年來發展起來的新興研究領域，進展很快。國外進行棉花QTL品質性狀定位的較多，且多與強度有關。
隨著生物技術的發展，棉花的分子標記的研究也越來越受到關注。目前被廣泛應用于棉花的分子標記技術主要有RFLP、RAPD、AFLP和SSR等，研究的領域涉及遺傳圖譜的構建、基因標記和基因定位、親緣關系分析、品種純度鑒定、分子標記輔助選擇等多個方面，并取得了長足進展。
棉花的許多重要農藝性狀是由QTL控制(Quantitative Trait Loci)，因而進行棉花QTL定位具有重要的理論和實踐意義。分子標記技術已經在棉花遺傳育種中廣泛應用，并發揮越來越大的作用，不同的分子標記可以互相聯合共同作用，使棉花分子生物學研究更深入發展下去。
發明內容
為提高棉花單產水平，改良棉花纖維品質，最根本最直接的辦法就是找到影響棉纖維的關鍵因子，并對其基因進行定位，進而分離并克隆出相關基因。然后再將其導入到主栽棉花品種中，即可獲得高效表達的優質棉品種。通過對棉花高品質纖維基因的分子標記篩選，篩選出與高品質纖維基因或QTL連鎖的分子標記，用于輔助選擇，提高選擇效率，從而提高纖維品種的纖維品質水平。
因此，本發明的目的是提供一種利用SSR標記和BSA方法篩選棉花纖維強度的分子標記的方法，以及公開了所述分子標記的序列。
本發明的另一個目的是提供與棉花纖維產量和品質性狀連鎖的分子標記。
本發明的再一個目的是提供所篩選分子標記在棉花育種中的應用。
本發明人以分子標記輔助育種為目標，直接針對控制纖維性狀的基因，應用(中16×中G97038)F2分離群體，借助SSR分子標記技術，尋找與棉花纖維產量和品質性狀連鎖的分子標記，作為分子遺傳改良的依據，從而在苗期就鑒定出具有優良纖維性狀的單株，提高纖維性狀的選擇效率，從而加快我國棉花品種的育種進程。其中篩選花纖維強度的分子標記的方法，包括步驟a).利用棉花中G97038株系，與中棉所16株系(中16)進行雜交，F1代自交產生F2代；b).用CTAB法提取F2(中G97038×中16)分離群體的葉片總DNA；c).利用BSA法建立目標性狀極值庫；d).通過SSR引物對親本進行篩選，親本間表現有差異的引物再用所建立的極值DNA池篩選，對極值DNA池所獲得的有差異的引物，對所有F2單株進行擴增檢測，得到多態性標記；e).進行SSR擴增和檢測；f).數據統計分析。
可以理解，通過建立分子標記輔助育種可用的SSR分子標記，為棉花分子育種奠定基礎，以利于后續研究者深入開展有關纖維各性狀基因分離與克隆等工作。該研究是分子標記輔助育種在棉花上的實踐，對陸地棉分子育種研究及應用具有理論與實踐意義。
篩選方法中的SSR(Simple Sequence Repeat)標記，即簡單重復序列標記，也稱為微衛星(microsatellite)。70年代初，人們便發現真核生物基因組中普遍存在著簡單重復序列，重復序列的兩端往往是趨于保守的DNA序列，因此可以在重復序列的兩端設計特殊的引物，經PCR擴增反應、凝膠電泳和染色，從而得到因簡單重復序列單位數不同而引起的擴增片段的多態性，即SSR標記。SSR標記的特點是一般檢測到的是一個單一的多等位基因位點；表現為共顯性遺傳，故可鑒別雜合子和純合子；結果重復性好。SSR被廣泛用于資源鑒定、連鎖圖繪制及目標性狀基因的分子標記等研究。然而，SSR分析需要較多的基因組序列信息和合成大量的寡核苷酸引物，這無疑要投入大量的人力、物力、財力，因此限制了該技術的使用。
BSA(Bulked Segregant Analysis，BSA)法是Michelmore等1991年提出的，為目的基因的標記和定位提供了更為簡便有效的方法。即將F2分離群體中研究的目標性狀，根據表型性狀將F2群體分成(如抗病、感病)分為兩組，從每組中一定數量的植株的DNA等量混合，形成兩個按表型性狀區分的DNA池(Pool)，兩池內除目的基因所在的DNA片段有差異外其余基本相同。因此分析兩個池內DNA的多態性差異即可迅速獲得與目的基因連鎖的分子標記。近等基因系或BSA分析相結合是尋找與目標基因緊密連鎖的分子標記的理想有效方法。進而可以構建目標基因所在區域的精細遺傳圖和物理圖。
利用SSR標記和BSA方法對構建的高強和低強2個DNA池進行篩選，獲得棉花品質強度的SSR標記，并對F2群體進行分析，從而獲得標記與纖維品質強度基因之間的距離(具體步驟見具體實施方式
)
本發明所使用的材料為是(中16×中G97038)的F2分離群體，其親本材料均為陸地棉，其中母本“中16”為品種“中棉所16”的簡稱，由中國農業科學院棉花研究所培育，為短季棉典型品種。父本“中G97038”為一優質的親本材料，由中棉所系統選育于四川農學院李友成教授提供一份高強纖維材料。中16生育期短，棉鈴大、衣分高、結鈴性強，產量性狀較好。中G97038表現為較晚熟，但纖維強度極高。組合選配及其本實驗群體的構建均由中棉所完成。2000年夏季雙親雜交，當年冬季在海南島加代形成F1株行，全部單株自交。2001年夏季在中棉所實驗地播種F2代。實驗小區行長8m，行距80cm，株距25cm～30cm。中16的比強度為31.4cN/tex，中G97038的比強度為40.8cN/tex，親本之間纖維強度的差異較大，中G97038比中16高9.4cN·tex-1，高29.94％，比較適合構建分子標記分析的分離群體。所配組合為中棉所16×中G97038。通過對高強和低強2個DNA池進行SSR篩選，獲得了與纖維強度有關的SSR差異帶型，經過群體分析，纖維強度的最大效應的QTL在LOD值為4.3時在M111-M683之間距離M111標記2cM的位置上，能夠解釋的表型變異是48.2％，加性效應為0.2412顯性效應為5.587。
本發明中田間調查的產量性狀包括鈴數、鈴重和衣分。纖維品質性狀有纖維長度、整齊度、比強度、伸長率、麥克隆值。單株編號、分單株進行農藝性狀調查和纖維取樣。纖維品質的檢測由農業部棉花品質監督檢驗測試中心用大容量纖維測試系統(HVI900)進行。檢驗環境溫度和相對濕度分別為20℃和65％。
采用SAS軟件，對上述8個數量性狀作正態分布的假設檢驗。以Univariate過程中提供的W統計量為依據，當Wa＜W的概率小于0.01時，為小概率事件，認為其不符合正態分布。將所有數據用頻數分布進行分組，作出各性狀頻率分布圖。
附圖及說明
圖1SSR111標記在F2群體中的分離，其中1為Marker 2為P1，3為P2，其余為F2單株；圖2SSR 683標記在F2群體中的分離(8％非變性聚丙烯酰胺膠)，1為Marker其余為F2單株。
實施例實施例1棉花基因組DNA提取與純化參照宋國立等(1998)報道的方法，并稍加修改，基本步驟簡述如下(1)棉花基因組DNA提取第一步加入2％的β-巰基乙醇于提取液中，并置于65℃的水中預熱。
第二步自超低溫(-70℃)冰箱中取出冷凍葉片適量(約2g)，立即放入預冷過的研缽中，加入液氮，快速研磨成粉末，立即裝入放有少量活性炭的1.5ml的離心管中，加入0.6ml提取液混勻，65℃水浴60min。(每間隔10min左右混勻一次，使樣品充分散開)。
第三步水浴完畢，加入等體積的氯仿-異戊醇(24∶1，V/V)，蓋上蓋子后，緩慢上下顛倒離心管30～50次后，用氯仿-異戊醇(24∶1)平衡離心管，12000g離心15min。
第四步取上清，加入等體積的氯仿-異戊醇(24∶1)重新抽提一次。
第五步取上清，加入0.6倍體積的冰冷異丙醇，緩慢顛倒離心管，直至有絮狀沉淀集結。
第六步靜置30min(或放入-20℃冰箱中20min～40min)，將沉淀挑出沉淀鉤出，轉移到1.5ml離心管中，用70％酒精洗2～3遍，無水乙醇洗1遍，風干。
(2)棉花基因組DNA純化第一步干燥的粗提DNA中加入500μlTE，65℃水浴中20min助溶或過夜。
第二步TE溶解的DNA按照10μg RNase A/100μlDNA比例加入無DNA的RNA酶，37℃保溫1h。
第三步加入等體積的氯仿-異戊醇(24∶1)，緩慢顛倒離心管30～50次，平衡離心管，12000g離心15min。
第四步取上清，加0.1倍體積的3mol/l的NaAc(PH＝5.2)，混勻后，緩慢加入2倍體積的冰冷無水乙醇，靜止5分鐘后，絮狀沉淀鉤出，轉到1.5ml的離心管中。
第五步加入70％和100％的酒精各洗一次，風干，溶于200μl的TE，于-20℃的冰箱中保存備用。(注100ml提取液配方Tris 0.01mol；EDTA0.002mol；PvP40 2g；CTAB 2g；NaCl 0.15mol；用前加入巰基乙醇2ml)(3)DNA濃度的測定使用BACKMAN紫外分光光度計測定。
實施例2目標性狀極植庫的建立據Michelmore(1991)提出的BSA方法，從群體中分別選取F2單株各性狀的極端表現單株5株，取其DNA等量混合，構建各性狀的極值基因池，終濃度為10ng/μl。
實施例3標記的篩選根據F2群體的纖維性狀表現，構建了纖維強度、長度、麥克隆值、整齊度、衣分和伸長率等6個性狀極值DNA混合池，通過386對SSR引物首先對親本篩選，親本間表現有差異的引物再用所建立的極值DNA池篩選，對極值DNA池所獲得的有差異的引物，對所有F2單株進行擴增檢測，共得到5個多態性標記。
實施例4SSR擴增、檢測與帶型的統計(1)SSR擴增方法<1>所用試劑及其來源棉花SSR引物由上海Sangon公司合成；Taq酶、MgCl2、dNTP和10×Reaction buffer均購自北京華綠淵試劑公司。
<2>SSR反應體系DNA模板30ng；SSR引物各0.3μmol/L；dNTP 200μmol/L；1×Reaction buffer；MgCl21.5mmol/L和Taq酶0.5U，總體積為20μl。
<3>SSR擴增程序Step 194℃3min；1個循環；Step 294℃50sec，58℃45sec，72℃1min；35個循環；Step 372℃10min；Step 44℃保溫。
擴增反應在eppendorf mastercycler gradient PCR擴增儀上進行。
(2)SSR擴增產物的電泳PCR擴增產物用非變性聚丙烯酰胺凝膠在1×TBE緩沖液中電泳，280v穩壓3h。或者用6％變性聚丙烯酰胺凝膠在1×TBE緩沖液中電泳，1800恒壓下電泳2個小時左右。變性與非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳方法分述如下A、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳<1>PAGE膠的制備用洗潔精仔細擦刷長短兩塊玻璃板，將玻璃板置于通風櫥干燥。
玻璃板處理將0.5ml硅化劑均勻地涂擦于長玻璃板上，2min后用1ml乙醇按一個方向涂擦并置于一邊。將反硅化劑1ml(2μl反硅化劑加入1ml 95％乙醇、0.5％冰乙酸中)均勻地涂抹于短玻璃板上，2min后同樣用乙醇涂擦。
封膠將邊條置于短玻璃板邊緣，上下對齊后加蓋長玻璃板。用夾子夾住，使兩塊玻璃板固定，開始封膠。封膠時要特別注意玻板底腳，一般封兩層，保證不漏膠。封膠完畢后，將膠板以一定角度墊起，以利灌膠。
灌膠用100ml注射器一次吸足PAGE溶液(70mlPAGE溶液中加入380μl濃度為10％的過硫酸胺和38μlTEME，其中前者為凝固劑，TEMEP為加速劑)，朝較低一頭勻速灌入。若玻板清洗干凈，則溶液走線較直。若灌膠過程中出現氣泡，可將膠板往回傾起，再慢速下放，如此操作可以清除氣泡。
插梳將梳子沖洗干凈并擦干后，從玻板夾縫間沿一邊插入，輕按梳子使之緊貼下面玻板，以防氣泡產生。(灌制好的PAGE膠一般在1個小時后即可凝固)<2>PCR產物變性處理在PCR擴增產物中，加入4μl上樣緩沖液后于94℃變性5min，取出并立即置于冰水中，以防DNA復性。
<3>預電泳將凝固完全的PAGE膠置于Bio-rad 3000DNA測序儀上，加入1×TBE電泳緩沖液，80W恒功率預電泳30min，此時玻璃板溫度在45℃-55℃之間為好。
<4>電泳預電泳完畢后，用注射器沖洗凝膠界面，小心插入梳子，上樣5μl，然后在1800恒壓下電泳2個小時左右。
B、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳<1>非變性聚丙烯酰胺凝膠配制8％(w/v)非變性丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺76g，N’-甲叉雙丙烯酰胺4g，加10×TBE 100ml蒸餾水定容至1000ml)<2>點樣在擴增產物中加入上樣緩沖液(不含甲酰胺)后點樣即可。DYY-11128D型電泳槽凝膠大小180×120×1cm<3>電泳電泳緩沖液1×TBE恒定電壓(電泳DYY-8B型穩壓穩流電泳儀)325V。2-3小時(根據SSR分子量大小及差異帶型的可辨程度調節電泳時間)(3)銀染電泳結束后，有自來水稍微沖洗玻璃板，使之溫度下降至室溫，然后小心揭開玻璃板。銀染步驟步驟1、固定將膠板放入10％醋酸固定液中，搖床上固定30min；步驟2、漂洗蒸餾水漂洗3次，每次5min～10min；步驟3、銀染漂洗后將膠板轉入銀染液(500ml水加入0.5g硝酸銀，37％甲醛750μl)，80rpm搖床，染色30min；步驟4、漂洗染色后在蒸餾水中漂洗，不超過8sec～10sec，迅速取出；步驟5、顯影漂洗后將膠板轉入顯色液3％的碳酸鈉，(500ml水加入15g碳酸鈉，冷卻至4℃。使用前5分鐘加入37％甲醛750μl，10mg/ml硫代硫酸鈉100μl)。緩緩搖動，直至條帶出現，以marker為對照，掌握好顯色時間。
步驟6、固定充分顯色后，轉入終止顯色液10％醋酸中，10min后可將膠板取出，漂洗并晾干，讀帶。
實施例5數據統計分析<1>SSR帶型統計方法共顯性標記SSR絕大多數為共顯性標記，采用ABH記錄法。親本的純合帶型記為A，親本二的純合帶型記為B，雜合帶型記為H。“-”表示數據缺失。
顯性標記若為顯性標記帶型統計較復雜些，用“A”表示這個位點來自親本純合子(無帶)，用“B”表示這個位點來自親本純合子(無帶)，用“C”表示這個位點來自純合子或雜合子(有帶)；用“D”表示這個位點來自親本純合子或雜合子(有帶)；“-”表示數據缺失。
<2>數據分析將收集的數據輸入計算機，使用Mapmaker/Exp3.0軟件進行數據分析。
SSR標記篩選的結果根據F2群體的纖維性狀表現，構建了纖維強度性狀極值DNA混合池。
通過386對SSR引物對親本和極值DNA池的篩選，得到M111和M683等2個多態性標記。利用這2個標記對F2群體的分析，其最大效應的QTL的位置就在M111-M683之間距離M111標記2cM的位置上，LOD值為4.3，能夠解釋的表型變異是48.2％，加性效應為0.2412顯性效應為5.587。
序列表<110>中國農業科學院棉花研究所<120>棉花產量性狀或纖維品質的分子標記<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>G.hirsutum<400>1tgaagatttg gaggcaattg 20<210>2<211>20<212>DNA<213>G.hirsutum<400>2gaaatcaagc ctcaattcgg 20<210>3<211>19<212>DNA<213>G.hirsutum<400>3cagaggacga aggtagcag 19<210>4<211>20<212>DNA<213>G.hirsutum<400>4tggtgggttt cactttcaca 20
權利要求
1.一種篩選與棉花纖維強度連鎖的分子標記的方法，包括步驟a).利用棉花中G97038株系，與中棉所16株系(中16)進行雜交，F1代自交產生F2代；b).用CTAB法提取F2(中G97038×中16)分離群體的葉片總DNA；c).利用BSA法建立目標性狀極值庫；d).通過SSR引物對親本進行篩選，親本間表現有差異的引物再用所建立的極值DNA池篩選，用極值DNA池所獲得的有差異的引物，對所有F2單株進行擴增檢測，得到多態性標記；e).進行SSR擴增和檢測；f).數據統計分析。
2.根據權利要求1的方法，其中所獲得的有差異的引物具有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2或SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的核苷酸序列。
3.一種與棉花纖維強度連鎖的分子標記，其通過下述步驟制備a).利用棉花中G97038株系，與中棉所16株系(中16)進行雜交，F1代自交產生F2代；b).用CTAB法提取F2(中G97038×中16)分離群體的葉片總DNA；c).利用BSA法建立目標性狀極值庫；d).通過SSR引物對親本進行篩選，親本間表現有差異的引物再用所建立的極值DNA池篩選，用極值DNA池所獲得的有差異的引物，對所有F2單株進行擴增檢測，得到多態性標記；e).進行SSR擴增和檢測；f).數據統計分析。
4.根據權利要求3的與棉花纖維強度連鎖的分子標記，其中所獲得的有差異的引物具有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2或SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的核苷酸序列。
5.權利要求3-4任一所述的分子標記在棉花育種中的應用。
6.利用SSR技術篩選與棉花纖維強度連鎖的引物對，其特征在于具有SEQID No.1和SEQ ID No.2或SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的核苷酸序列。。
全文摘要
本發明涉及一種利用SSR技術篩選棉花產量性狀或纖維品質的分子標記的方法，包括步驟a)利用棉花中G97038株系，與中棉所16株系(中16)進行雜交，F1代自交產生F2代；b)用CTAB法提取F2(中G97038×中16)分離群體的葉片總DNA；c)利用BSA法建立目標性狀極值庫；d)通過SSR引物對親本進行篩選，親本間表現有差異的引物再用所建立的極值DNA池篩選，對極值DNA池所獲得的有差異的引物，對所有F2單株進行擴增檢測，得到多態性標記；e)進行SSR擴增和檢測；f)數據統計分析。本發明公開了棉花纖維品質的分子標記，所述分子標記具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.4的核苷酸序列。另外，本發明也公開了所述棉花產量性狀或纖維品質的分子標記在育種中的應用。
文檔編號A01H1/00GK1796572SQ20041009898
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月22日 優先權日2004年12月22日
發明者王坤波, 宋國立, 黎紹惠, 劉方, 王春英, 張香娣, 王立平 申請人:中國農業科學院棉花研究所