專利名稱：一種雪蓮組織培養(yǎng)中快速誘導(dǎo)叢生芽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雪蓮組織培養(yǎng)中快速誘導(dǎo)叢生芽的方法，具體是以植物組織培養(yǎng)為手段，用雪蓮成熟種子內(nèi)的子葉為外植體，在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，快速獲得雪蓮叢生芽的方法。
背景技術(shù)：
雪蓮(Saussurea involucrate Kar.et Kit)為菊科風(fēng)毛菊屬植物。國(guó)內(nèi)僅大面積分布以新疆，是我國(guó)中藥、民族藥中的珍稀名貴藥材。
在自然條件下，新疆雪蓮一般生長(zhǎng)在天山海拔2000米以上的高山冰磧石、流石、灘石隙、高山草甸上，生態(tài)環(huán)境極為嚴(yán)酷。由于近些年來(lái)的極度采挖，天山一帶的野生雪蓮頻臨滅絕。在《中國(guó)珍稀頻危保護(hù)植物名錄》中被列為國(guó)家3級(jí)漸危物種而受到保護(hù)。
由于雪連種子成熟時(shí)，高山地區(qū)已是大雪季節(jié)，不易采集到成熟的種子，造成了引種栽培上的困難。因此，通過(guò)植物組織培養(yǎng)，獲得雪蓮再生苗的方法就成為引種和保護(hù)雪蓮的首選方法之一。
現(xiàn)有技術(shù)表明，對(duì)雪蓮的組織培養(yǎng)均以雪蓮的鮮嫩葉片為外植體，誘導(dǎo)愈傷組織，分化出芽，并誘導(dǎo)生根?；蛞匝┥彑o(wú)菌苗為外植體誘導(dǎo)出愈傷組織，叢生芽試管苗。這兩種方法中，采自野外的嫩葉滅菌消毒相對(duì)困難，對(duì)外植體的損傷大，易污染，誘導(dǎo)愈傷的成功率較低。以無(wú)菌苗為外植體是目前雪蓮組織培養(yǎng)中較為通用的方法，但要先培育無(wú)菌苗，再對(duì)無(wú)菌苗的葉片進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，生產(chǎn)周期相對(duì)較長(zhǎng)。水母雪蓮為新疆雪蓮的同屬植物，國(guó)內(nèi)有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)水母雪蓮的組織培養(yǎng)作了深入的工作，取得了許多很好的成果。但水母雪蓮為雪兔子亞屬植物，未見(jiàn)以水母雪蓮成熟種子為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)的報(bào)道。中國(guó)專利CN01124108X公開(kāi)了細(xì)胞培養(yǎng)生成新疆雪蓮總黃酮的方法，該方法是采用氣升式生物反應(yīng)器培養(yǎng)新疆雪蓮細(xì)胞提取總黃酮的。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于，提供一種雪蓮組織培養(yǎng)中快速誘導(dǎo)叢生芽的方法，該方法包括在MS或BS培養(yǎng)基上進(jìn)行子葉培養(yǎng)，誘導(dǎo)形成愈傷組織；在MS或BS培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的轉(zhuǎn)代培養(yǎng)誘導(dǎo)形成叢生芽。以新疆雪蓮成熟種子為材料，由于雪蓮種子有外殼及內(nèi)膜的保護(hù)，有利于較為嚴(yán)格的滅菌消毒條件，愈傷誘導(dǎo)過(guò)程中污染率較低，避免了由于消毒損傷所造成的外植體褐變現(xiàn)象。采用雪蓮成熟種子直接誘導(dǎo)出芽，速度快，一般經(jīng)一個(gè)月的培養(yǎng)即可完成從外植體移植至叢生芽的誘導(dǎo)過(guò)程，叢生芽得率相對(duì)較高，成熟種子誘導(dǎo)愈傷發(fā)生得率在95％以上，愈傷誘導(dǎo)叢生芽的率近80％。
本發(fā)明所述的一種雪蓮組織培養(yǎng)中快速誘導(dǎo)叢生芽的方法，該方法包括在MS或BS培養(yǎng)基上進(jìn)行子葉培養(yǎng)，誘導(dǎo)形成愈傷組織；在MS或BS培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的轉(zhuǎn)代培養(yǎng)誘導(dǎo)形成叢生芽；具體操作按下列步驟進(jìn)行a、選取成熟的雪蓮種子，剝?nèi)シN子外殼，撕去種子內(nèi)膜，取出種仁，切除種芽，將子葉平鋪于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷發(fā)生，時(shí)間13-17天；b、將誘導(dǎo)形成的愈傷轉(zhuǎn)至叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢生芽發(fā)生，轉(zhuǎn)代周期為5-18天，培養(yǎng)溫度為20-28℃，光照強(qiáng)度為2200-2700/ux，光照時(shí)間為12-15小時(shí)/天；c、愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基和叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值為5.5-6。
愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS或BS培養(yǎng)基，同時(shí)附加6-BA0.0-4.0mg/L；NAA0.0-2.0mg/L；2.4-D0.0-1.0mg/L。
叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS或BS培養(yǎng)基，同時(shí)附加6-BA0.0-4.0mg/L；NAA0.0-2.0mg/L。
雪蓮種子的滅菌消毒條件為75％乙醇浸泡25-35秒，用滅菌水沖洗數(shù)次，用2‰的優(yōu)氯凈溶液浸泡25-35分鐘，滅菌水沖洗數(shù)次，再浸泡于滅菌水中2-4小時(shí)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1a、選取采自哈密的新疆雪蓮成熟的種子10粒，在超凈工作臺(tái)上用75％乙醇浸泡35秒，無(wú)菌水沖洗數(shù)次，再用2‰的優(yōu)氯凈溶液浸泡25分鐘，無(wú)菌水沖洗數(shù)次，再浸泡于無(wú)菌水中2小時(shí)；剝?nèi)シN子外殼，撕去種子內(nèi)膜，取出種仁，切除種芽，將子葉平鋪于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷發(fā)生，時(shí)間15天，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為BS培養(yǎng)基，同時(shí)附加含有0.0-4.0mg/L的6-氨基腺嘌呤(6-BA)，0.0-2.0mg/L萘乙酸(NAA)，0.0-1.0mg/L的2.4-D，3％的蔗糖，0.55％的瓊脂，pH值為5.5，子葉接種5-7天后開(kāi)始膨大，10-15天形成愈傷組織；b、15天后將誘導(dǎo)形成的愈傷組織轉(zhuǎn)入?yún)采空T導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢生芽發(fā)生，叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為BS培養(yǎng)基，同時(shí)附加含有0.0-2.0mg/L的6-BA，0.0-1.0mg/L的NAA，3％的蔗糖，0.55％的瓊脂，pH值為5.5，轉(zhuǎn)代周期培養(yǎng)5-7天后愈傷開(kāi)始出現(xiàn)芽點(diǎn)突起，10-15天出現(xiàn)大量叢生芽，培養(yǎng)溫度為20℃，光照強(qiáng)度為2200/ux，光照時(shí)間為12小時(shí)/天，出芽愈傷是總愈傷的80％，從接種外植體之大量出現(xiàn)叢生芽需1個(gè)月時(shí)間。
實(shí)施例2a、選取采自和靜縣的新疆雪蓮成熟的種子300粒，分成3份，每份100粒，在超凈工作臺(tái)上用75％乙醇浸泡25秒，無(wú)菌水沖洗數(shù)次，再用2‰的優(yōu)氯凈溶液浸泡35分鐘，無(wú)菌水沖洗數(shù)次，再浸泡于無(wú)菌水中3小時(shí)；剝?nèi)》N子外殼，撕去種子內(nèi)膜，取出種仁，切除種芽，將子葉平鋪于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷發(fā)生，時(shí)間13天，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，同時(shí)附加含有0.0-4.0mg/L的6-氨基腺嘌呤(6-BA)，0.0-2.0mg/L萘乙酸(NAA)，0.0-1.0mg/L的2.4-D，3％的蔗糖，0.55％的瓊脂，pH值為5.8，子葉接種5-7天后開(kāi)始膨大，10-15天形成愈傷組織；b、15天后將誘導(dǎo)形成的愈傷轉(zhuǎn)至叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢生芽發(fā)生，叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，同時(shí)附加含有0.0-2.0mg/L的6-BA，0.0-1.0mg/L的NAA，3％的蔗糖，0.55％的瓊脂，pH值為5.5，轉(zhuǎn)代周期培養(yǎng)5-7天后愈傷開(kāi)始出現(xiàn)芽點(diǎn)突起，10-17天出現(xiàn)大量叢生芽，其中個(gè)別愈傷形成船形，船內(nèi)出現(xiàn)大量球狀體，橢圓形體，長(zhǎng)柱狀體及帶有雙芽尖的子葉胚，培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2500/ux，光照時(shí)間為14小時(shí)/天，經(jīng)3份種子統(tǒng)計(jì)，子葉誘導(dǎo)愈傷發(fā)生的出愈率均超過(guò)95％，只有個(gè)別未成熟的種子所剝?nèi)〉淖尤~未能誘導(dǎo)愈傷發(fā)生，此類未成熟種子的子葉為一層薄皮，即使將誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)至1個(gè)月，也不能誘導(dǎo)發(fā)生。只有那些從接近成熟的種子剝?nèi)〉淖尤~，在延遲后的誘導(dǎo)培養(yǎng)中形成愈傷組織，誘導(dǎo)時(shí)間較成熟種子多了一至兩倍。
實(shí)施例3a、選取采自和靜縣的新疆雪蓮成熟的種子50粒，在超凈工作臺(tái)上用75％乙醇浸泡30秒，無(wú)菌水沖洗數(shù)次，再用2‰的優(yōu)氯凈溶液浸泡30分鐘，無(wú)菌水沖洗數(shù)次，再浸泡于無(wú)菌水中4小時(shí)；剝?nèi)》N子外殼，撕去種子內(nèi)膜，取出種仁，切除種芽，將子葉平鋪于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷發(fā)生，時(shí)間15天，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，同時(shí)附加含有0.0-4.0mg/L的6-氨基腺嘌呤(6-BA)，0.0-2.0mg/L萘乙酸(NAA)，0.0-1.0mg/L的2.4-D，3％的蔗糖，0.55％的瓊脂，pH值為6，子葉接種5-7天后開(kāi)始膨大，10-15天形成愈傷組織；b、15天后將誘導(dǎo)形成的愈傷轉(zhuǎn)至叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢生芽發(fā)生，叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，同時(shí)附加含有0.0-2.0mg/L的6-BA，0.0-1.0mg/L的NAA，3％的蔗糖，0.55％的瓊脂，pH值為5.5，轉(zhuǎn)代培養(yǎng)5-7天后愈傷開(kāi)始出現(xiàn)芽點(diǎn)突起，10-18天出現(xiàn)大量叢生芽，培養(yǎng)溫度為28℃，光照強(qiáng)度為2700/ux，光照時(shí)間為15小時(shí)/天，子葉誘導(dǎo)愈傷發(fā)生的出愈率為95％。
權(quán)利要求
1.一種雪蓮組織培養(yǎng)中快速誘導(dǎo)叢生芽的方法，其特征在于該方法包括在MS或BS培養(yǎng)基上進(jìn)行子葉培養(yǎng)，誘導(dǎo)形成愈傷組織；在MS或BS培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的轉(zhuǎn)代培養(yǎng)誘導(dǎo)形成叢生芽；具體操作按下列步驟進(jìn)行a、選取成熟的雪蓮種子，剝?nèi)シN子外殼，撕去種子內(nèi)膜，取出種仁，切除種芽，將子葉平鋪于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷發(fā)生，時(shí)間13-17天；b、將誘導(dǎo)形成的愈傷轉(zhuǎn)至叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢生芽發(fā)生，轉(zhuǎn)代周期為5-18天，培養(yǎng)溫度為20-28℃，光照強(qiáng)度為2200-2700/ux，光照時(shí)間為12-15小時(shí)/天；c、愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基和叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值為5.5-6。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雪蓮組織培養(yǎng)中快速誘導(dǎo)叢生芽的方法，其特征在于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS或BS培養(yǎng)基，同時(shí)附加6-BA0.0-4.0mg/L；NAA0.0-2.0mg/L；2.4-D0.0-1.0mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雪蓮組織培養(yǎng)中快速誘導(dǎo)叢生芽的方法，其特征在于叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS或BS培養(yǎng)基，同時(shí)附加6-BA0.0-4.0mg/L；NAA0.0-2.0mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雪蓮組織培養(yǎng)中快速誘導(dǎo)叢生芽的方法，其特征在于雪蓮種子的滅菌消毒條件為75％乙醇浸泡25-35秒，用滅菌水沖洗數(shù)次，用2‰的優(yōu)氯凈溶液浸泡25-35分鐘，滅菌水沖洗數(shù)次，再浸泡于滅菌水中2-4小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雪蓮組織培養(yǎng)中快速誘導(dǎo)叢生的方法，該方法包括在MS或BS培養(yǎng)基上進(jìn)行子葉培養(yǎng)，誘導(dǎo)形成愈傷組織；在MS或BS培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的轉(zhuǎn)代培養(yǎng)誘導(dǎo)形成叢生芽。以新疆雪蓮成熟種子為材料，由于雪蓮種子有外殼及內(nèi)膜的保護(hù)，有利于較為嚴(yán)格的滅菌消毒條件，同時(shí)愈傷誘導(dǎo)過(guò)程中污染率較低，避免了由于消毒損傷所造成的外植體褐變現(xiàn)象。采用雪蓮成熟種子直接誘導(dǎo)出芽，速度快，一般經(jīng)一個(gè)月的培養(yǎng)即可完成從外植體移植至叢生芽的誘導(dǎo)過(guò)程，叢生芽得率相對(duì)較高，成熟種子誘導(dǎo)愈傷發(fā)生得率在95％以上，愈傷誘導(dǎo)叢生芽的率近80％。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1600083SQ200410090239
公開(kāi)日2005年3月30日 申請(qǐng)日期2004年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月27日
發(fā)明者趙民安, 王曉軍, 劉敏, 趙海清, 韋彥余, 蘇惠民 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所