專利名稱：具有多倍體減數分裂穩定性基因的多倍體水稻選育及鑒測方法
技術領域：
本發明涉及一種具有多倍體減數分裂穩定性(Polyploid MeiosisStability，PMeS)基因的多倍體水稻選育及鑒測方法，屬于多倍體水稻育種的
背景技術：
自然界高等植物70％左右都是多倍體，主要糧棉油作物如小麥、棉花、油菜等也都是多倍體，它們經歷了二倍體向多倍體進化的過程，而且隨著倍性的增加，它們的產量都成倍增長。
但是自從1933年日本學者Nakamori發現多倍體水稻以來(Nakamori，E.Onthe occurrence of the tetraploid plant of rice Oryza sativa L.，Proc，Imp.Acad.9，340-341，1933)，世界上有許多科學家從事水稻多倍體研究，雖然已經發現多倍體水稻具有莖桿粗壯、籽粒變大的優點，然而多倍體水稻育種進展緩慢。其主要原因是多倍體水稻的結實率低，一般都低于50％，達不到應用于生產的水平(宋文昌，張玉華，水稻四倍化及其對農藝性狀和營養成分的影響，作物學報，18(2)137-144，1992)。中國專利(ZL00114471.5)發明人蔡得田、袁隆平、盧興桂從進化育種學的角度出發，提出利用遠緣雜交和多倍體雙重優勢選育超級稻，它包括三個階段即亞種間、種間和基因組間雜種優勢利用，三種技術即拉大親緣關系距離、利用廣親和基因和Ph基因(Pairinghomoeologous，部分同源染色體配對)。提出了多倍體育種的新思路和技術，擴大了多倍體育種的應用范圍，但與多倍體水稻高結實率相關的基因和品系尚未選育出來，多倍體水稻的結實率仍然不理想。
發明內容
本發明的目的是選育出多倍體減數分裂穩定性(PMeS)基因的多倍體水稻，用以解決多倍體水稻結實率低的問題，并使其形成的PMeS品系應用于多倍體水稻育種。
本發明的技術方案為a.選擇親本，b.雜交或復合雜交，c.挑選雜種連續回交，d.染色體加倍，e.多倍體鑒定，f.結實性選擇，g.減數分裂行為觀察，h.自交穩定成品系，i.高結實性雜交測定。
本發明的具體過程為
a.選擇親本選擇親本包括亞洲栽培稻的秈稻、粳稻品種，具備株型緊湊，穗大粒多，著粒密的特征，或帶有廣親和基因和特殊性狀的秈稻或粳稻品種。具體是選育Sg99012(PMeS-1)時的親本為卷葉稻(秈型)，高粱稻(粳型)，GC574(粳型)；選育HN2026(PMeS-2)時的親本為HT99104(光殼稻/粳稻F8的粳型品系)，蜀恢362。
b.雜交或復合雜交在Sg99012選育中，以卷葉稻×高粱稻得到F1-a，卷葉稻×GC574得到F1-b，然后將F1-a和F1-b進行復合雜交。可以秈稻為母本，以粳稻為父本，或者以粳稻為母本，以秈稻為父本配制成不同的秈粳亞種間雜種，然后，將兩個不同的雜種F1進行復合雜交；在HN2026選育中，以HT99104×蜀恢362得到F1雜種。
c.挑選雜種連續回交從雜交或復合雜交后代中挑選株型緊湊，穗大粒多，著粒密，具有30％以上結實率的水稻植株為親本，以農藝性狀良好的粳稻(向粳型方向培育品種)或秈稻(向秈型方向培育品種)為回交親本進行3～5代回交，獲得許多性狀基本傾向回交親本的粳型或秈型回交后代。
d.染色體加倍用秋水仙素處理上一步得到的分蘗期的水稻苗；也可以用秋水仙素處理水稻幼穗組織培養形成的愈傷組織。
e.多倍體鑒定從外部形態上觀察鑒定，即多倍體表現出莖桿粗壯，葉片厚實，谷粒變大(比二倍體大1/3至一倍)，大多數谷粒有芒。檢查它們的根尖染色體數目為2n＝4x＝48。
f.結實性選擇按育種學的考種方法對多倍體水稻植株進行考種，選擇等于和高于65％的多倍體水稻植株。
g.減數分裂行為觀察對其細胞遺傳學特征減數分裂行為觀察。在減數分裂時期，對確定為多倍體，且結實率≥65％的多倍體水稻植株的花粉母細胞減數分裂行為進行觀察，將那些減數分裂正常即前期I以二價體配對為主，有3～6個四價體，而沒有或低于1.0％的單價體或高價體，中期I無落后染色體，后期I無染色體橋、無落后染色體，末期I無微核出現，減數分裂II正常，進而形成正常四分體，經0.1％I-KI染色，正常可染花粉≥95％的多倍體水稻單株挑選出來。
h.自交穩定成品系將g過程中挑選的多倍體水稻單株自交，使其穩定成株系，由株系繁殖成表現整齊一致的PMeS品系。
i.高結實性雜交測定以h過程中的PMeS穩定品系與多倍體秈稻、粳稻品種雜交，得到F1雜種，即得到具有多倍體減數分裂穩定性(PMeS)基因的多倍體雜交水稻。考察F1的結實率，一般結實率≥70％以上。
本發明確定多倍體減數分裂穩定性(PMeS)基因的多倍體水稻品系、品種及雜種的鑒測指標為a.本身是亞洲栽培稻(Oryza sativa)中的秈稻或粳稻的多倍體品系。
b.具有≥65％的結實率。
c.減數分裂行為正常。在前期I，染色體配對以二價體占優勢，有3-6個四價體，但沒有或僅有低于1.0％的單價體或高價體(四價體以上的配對染色體)；在中期I，后期I和末期I以及減數分裂II中沒有或低于0.5％落后染色體或微核出現。
d.花粉形態和生理活性正常，經0.1％I-KI染色，正常可染花粉≥95％。
e.以PMeS多倍體水稻與其它多倍體水稻品種的多倍體后代結實率在70％以上，與A基因組野生稻雜種的多倍體后代結實率在65％以上。
本發明所產生的PMeS多倍體水稻具有以下積極效果1、選育出一種本身具有較高結實率(≥65％)的多倍體水稻；2、利用PMeS多倍體水稻與其它多倍體水稻品種的多倍體后代結實率在70％以上，與A基因組野生稻物種雜交的后代結實率在65％以上，解決了長期未能解決的多倍體水稻結實率低的問題，使利用遠緣雜交和多倍體雙重優勢選育超級稻成為可能；3、利用PMeS多倍體水稻與多倍體水稻不育系或多倍體水稻恢復系雜交，可以選育出具有PMeS品系高結實率特點的多倍體不育系和恢復系，為實現多倍體水稻雜種優勢利用提供了條件。這樣使水稻育種發生由二倍體水平向多倍體水平，品種間雜交向亞種間、種間甚至基因組間雜交的重大轉變，可以充分利用遠緣雜交和多倍體雙重優勢，有利于選育出大幅度增產(30％以上)的多倍體水稻品種或雜種。
具體實施例方式
下面以實施例對本發明進一步說明。
實施例1PMeS-1(Sg99012)的選育
a.選擇親本以卷葉稻(秈型)，高粱稻(粳型)，GC574(粳型)為親本，各選10株。
b.雜交和復合雜交卷葉稻×高粱稻得到F1-a，卷葉稻×GC574得到F1-b，然后將F1-a和F1-b進行復合雜交。選出50粒雜種。
c.挑選雜種連續回交挑選出傾粳型，株型緊湊，劍葉挺，穗子大，著粒密的雜種單株10株，作為母本用GC574回交得到BC1F1(47株)，從中挑選傾粳型，株型緊湊，劍葉挺，穗子大，著粒較密的雜種株(30株)與GC574回交得到BC2F1(15株)，連續回交3～4次得到BC4F1(選出20株)。
d.染色體加倍用秋水仙素處理上一步得到的分蘗期的水稻苗。取帶1-2個分蘗的BC4F1雜種秧苗(20株)，用刀片在基部橫切一刀，深達基部的一半，然后將秧苗浸泡在0.2～0.3％秋水仙素水溶液中，在1500～2000LX光照、20～25℃條件下處理48～56h，待秧苗根尖出現腫大形狀時，將秧苗取出，置于流水中沖洗4小時以上，然后將秧苗移栽在泥土缽中，于1500～2000LX光照、20℃條件下緩苗10～15天，待秧苗的葉腋中新生出分蘗，挑選那些呈現出葉片增厚、葉色變濃特征的秧苗，讓其自然生長10～15天后，將它們轉入到室外栽培，這些秧苗可能發育成多倍體水稻。
e.多倍體鑒定從外部形態上觀察鑒定，即多倍體表現出莖桿粗壯，葉片厚實，谷粒變大(比二倍體大1/3至一倍)，大多數谷粒有芒。檢查它們的根尖染色體數目為2n＝4x＝48。
f.結實性選擇按育種學的考種方法對多倍體水稻植株進行考種，選擇等于和高于65％的多倍體水稻植株。
g.對其細胞遺傳學特征減數分裂行為觀察在減數分裂時期，對確定為多倍體，且結實率≥65％的多倍體水稻植株的花粉母細胞減數分裂行為進行觀察，將那些減數分裂正常即前期I以二價體配對為主，有3～6個四價體，而沒有或低于1.0％的單價體或高價體，中期I無落后染色體，后期I無染色體橋、無落后染色體，末期I無微核出現，減數分裂Ⅱ正常，進而形成正常四分體，經0.1％I-KI染色，正常可染花粉≥95％的多倍體水稻單株挑選出來(7株)。
h.自交穩定成品系將g過程中挑選的多倍體水稻單株自交，使其穩定成株系，由株系繁殖成表現整齊一致的PMeS品系，定名為Sg99012。
i.高結實性雜交測定用PMeS穩定品系Sg99012與多倍體Dure(秈)、PA64s(秈)品種雜交，得到F1雜種PSR120(Dure/sg99012)、PSR012(PA64s/Sg99012)，考察F1的結實率分別為73.87％、78.82％，株系單株產量都超過100克。
實施例2PMeS-2(HN2026)的選育a.選擇親本以HT99104(粳型)，蜀恢362(秈型)為親本，各選10株。
b.雜交或復合雜交HT99104×蜀恢362，獲得12株F1。
c.挑選雜種連續回交基本與實施例1同，僅以HT99104為回交親本不同，回交四次后得到BC4F1雜種15株。
d.染色體加倍采用的是幼穗愈傷組織，在添加有500mg/l秋水仙素的N6液體培養基中誘導加倍，而后分化成多倍體水稻苗。
e、f、g過程與實施例1基本相同。
h.自交穩定成品系將g過程中挑選的多倍體水稻單株自交，使其穩定成株系，由株系繁殖成表現整齊一致的PMeS品系，定名為HN2026。
i.高結實性雜交測定用PMeS穩定品系HN2026與多倍體HT99128(秈)、PA64s(秈)、HT99133(秈)品種雜交，得到F1雜種PSR026(PA64s/HN2026)、PSR073(HT99128/HN2026)、PSR183(HT99133/HN2026)，考察F1的結實率分別為79.88％、77.78％、87.75％，株系單株產量都超過100克。
權利要求
1.一種具有多倍體減數分裂穩定性基因的多倍體水稻選育方法，其特征在于過程為a、選擇親本，b、雜交或復合雜交，c、挑選雜種連續回交，d、染色體加倍，e、多倍體鑒定，f、結實性選擇，g、減數分裂行為觀察，h、自交穩定成品系，i、高結實性雜交測定。
2.按權利要求1所述的具有多倍體減數分裂穩定性基因的多倍體水稻選育方法，其特征在于具體過程為a.選擇親本選擇親本包括亞洲栽培稻的秈稻、粳稻品種，具備株型緊湊，穗大粒多，著粒密的特征，或帶有廣親和基因和特殊性狀的秈稻或粳稻品種，具體為卷葉稻(秈型)，高粱稻(粳型)，GC574(粳型)；HT99104，蜀恢362；b.雜交或復合雜交在Sg99012選育中，以卷葉稻×高粱稻得到F1-a，卷葉稻×GC574得到F1-b，然后將F1-a和F1-b進行復合雜交，可以秈稻為母本，以粳稻為父本，或者以粳稻為母本，以秈稻為父本配制成不同的秈粳亞種間雜種，然后，將兩個不同的雜種F1進行復合雜交；或者在HN2026選育中，以HT99104×蜀恢362得到F1雜種；c.挑選雜種連續回交從復合雜交后代中挑選株型緊湊，穗大粒多，著粒密，具有30％以上結實率的水稻植株為親本，以農藝性狀良好的粳稻(向粳型方向培育品種)或秈稻(向秈型方向培育品種)為回交親本進行3～5代回交，獲得許多性狀基本傾向回交親本的粳型或秈型回交后代；d.染色體加倍用秋水仙素處理上一步得到的分蘗期的水稻苗；也可以用秋水仙素處理水稻幼穗組織培養形成的愈傷組織；e.多倍體鑒定從外部形態上觀察鑒定，即多倍體表現出莖桿粗壯，葉片厚實，谷粒變大(比二倍體大1/3至一倍)，大多數谷粒有芒。檢查它們的根尖染色體數目為2n＝4x＝48；f.結實性選擇按育種學的考種方法對多倍體水稻植株進行考種，選擇等于和高于65％的多倍體水稻植株；g.減數分裂行為觀察在減數分裂時期，對確定為多倍體，且結實率≥65％的多倍體水稻植株的花粉母細胞減數分裂行為進行觀察，將那些減數分裂正常即前期I以二價體配對為主，有3～6個四價體，而沒有或低于1.0％的單價體或高價體，中期I無落后染色體，后期I無染色體橋、無落后染色體，末期I無微核出現，減數分裂II正常；經0.1％I-KI染色，正常可染花粉≥95％，進而形成正常四分體的多倍體水稻單株挑選出來；h.自交穩定成品系將g過程中挑選的多倍體水稻單株自交，使其穩定成株系，由株系繁殖成表現整齊一致的PMeS品系；i.高結實性雜交測定以h過程中的PMeS穩定品系與多倍體秈稻、粳稻品種雜交，得到F1雜種，即得到具有多倍體減數分裂穩定性(PMeS)基因的多倍體雜交水稻。考察F1的結實率，一般結實率≥70％以上。
3.按權利要求1、2所述的具有多倍體減數分裂穩定性基因的多倍體水稻鑒測方法，其特征在于鑒測指標為a.本身是亞洲栽培稻(Oryza sativa)中的秈稻或粳稻的多倍體品系；b.具有≥65％的結實率；c.減數分裂行為正常。在前期I，染色體配對以二價體占優勢，有3～6個四價體，但沒有或僅有低于1.0％的單價體或高價體(四價體以上的配對染色體)；在中期I，后期I和末期I以及減數分裂II中沒有或低于0.5％落后染色體或微核出現；d.花粉形態和生理活性正常，經0.1％I-KI染色，正常可染花粉≥95％；e.以PMeS多倍體水稻與其它多倍體水稻品種雜種的多倍體后代結實率在70％以上，與A基因組野生稻雜種的多倍體后代結實率在65％以上。
全文摘要
本發明提出一種解決多倍體水稻結實率低問題的具有多倍體減數分裂穩定性(Polyploid Meiosis Stability，PMeS)基因的多倍體水稻選育及鑒測方法。其選育過程為a.選擇親本；b.雜交或復合雜交；c.挑選雜種連續回交；d.染色體加倍；e.多倍體鑒定；f.結實性選擇；g.減數分裂行為觀察；h.自交穩定成品系；i.高結實性雜交測定。鑒測指標為a.亞洲栽培稻中的秈稻或粳稻的多倍體品系；b.具有≥65％的結實率；c.減數分裂行為正常。d.花粉形態和生理活性正常，經0.1％I－KI染色，正常可染花粉≥95％；e.以PMeS多倍體水稻與其它多倍體水稻品種雜交的后代結實率在70％以上，與A基因組野生稻雜種的多倍體后代結實率在65％以上。本發明解決了多倍體水稻結實率低的問題，可應用于多倍體水稻育種。
文檔編號A01H1/02GK1586134SQ20041006078
公開日2005年3月2日 申請日期2004年8月31日 優先權日2004年8月31日
發明者蔡得田, 陳冬玲, 陳建國, 戴兵成 申請人:湖北大學