專利名稱：含羞草的繁殖方法
技術領域：
本發明涉及一種植物組織培養方法，具體地講，是指一種采用組織培養技術對含羞草離體培養進行快速繁殖的方法。
背景技術：
植物組織培養是指用植物的任何器官、組織或細胞，在人工控制條件下進行無菌培養生長發育的過程。該技術取材少，培養植物材料成本低，生長周期短，管理方便。利用植物組織培養這種快速繁殖技術，能在短時間內繁衍出大量保持母本生物特性和遺傳性狀的植株。據了解，我國快速繁殖的植物已有近千種。通常使用的基本培養基有數種，如MS、B5、White、N6等。在組織培養中，植物外植體要在植物生長物質的作用下，經過誘導脫分化、恢復細胞分裂的能力、影響再分化、促進器官形成等過程。植物外植體繁殖系數的大小，直接影響著生產后代植株的數量和質量。
含羞草(Mimosa pudica L.)，別名知羞草、感應草，是豆科含羞草屬多年生草本或半灌木，常做1年生栽培。原產美洲熱帶地區，早年引入我國，云南省西雙版納、德宏等熱區均有逸生。各地作盆栽植物栽培，植物教學上常做實驗材料。含羞草全株有小毒，供藥用，有安神鎮靜、止血收斂之功效，鮮葉搗爛外敷可治帶狀皰癥。含羞草中含有一種植物氨基酸—含羞草堿(mimosine)，最近已被定性為一種可逆性細胞周期抑制物，可與脫氧胸苷三磷酸在DNA復制點直接競爭。
有關含羞草無性繁殖幼苗的組織培養方法在國內尚未有人報道，國際上僅有一例報道(Gharyal P K & Maheshwari S C，Plantlet formation intissue cultures of the sensitive plant Mimosa pudica L.International Journal ofPlant Physiology，1982，105(2)179-182)。其方法主要包括如下步驟(1)外植體消毒以種子為外植體，繁殖前先先進行消毒；(2)萌發無菌苗在B5培養基上萌發無菌苗；(3)誘導愈傷組織將無菌苗根、子葉、下胚軸、葉片、莖尖，分別放在附加有吲哚乙酸(簡稱IAA)、萘乙酸(簡稱NAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(簡稱2，4-D)，6-芐基氨基嘌呤(簡稱6-BA)的B5固體培養基中誘導愈傷組織；(4)誘導不定芽發生愈傷組織轉接到分化培養基B5+0.5mg/L 2，4-D+1mg/L 6-BA中誘導不定芽發生，其培養條件為溫度25±2℃；光照強度750Lux；(5)培養生根將高度為3-7厘米的不定芽分切成單株，在附加2mg/L IAA固體培養基上培養，培養條件同步驟(4)。但經試驗，該繁殖方法主要存在使用激素種類繁多，操作不方便，分化率低、生根率低等不足。
(三)發明的內容本發明的目的在于針對含羞草已有組織培養方法的不足，提供一種快速繁殖的新方法，它能夠明顯提高含羞草的無性繁殖系數，而且操作簡便。
已知在調節控制植物材料離體培養過程中，培養基的種類對植物的分化有著一定的影響，植物生長物質也起著重要的作用，其中影響最顯著的是生長素類和細胞分裂素類物質。為了實現本發明的目的，本發明在上述現有方法包括五步驟的基礎上進行如下改進在步驟(3)中，減少激素種類，提高培養基中生長素和細胞分裂素的濃度，以提高誘導愈傷組織發生速率；減少步驟(4)中培養基所用激素的種類，僅用細胞分裂素類，以提高誘導不定芽發生的能力；對步驟(5)的培養基進行改進。具體的講，本發明的具體操作如下(1)外植體消毒將含羞草種子置于65-75％乙醇中浸泡20-60s(表示“秒”，下同)，0.1％升汞中滅菌4-15min(表示“分鐘”，下同，)，再用無菌水沖洗3-6次；(2)萌發無菌苗消毒后的種子接種到1/2MS培養基上培養15-30天，萌發出無菌苗，培養條件為溫度25±2℃，光照強度1500Lux，光照時間12h·d-1(表示“小時/天”，下同)；(3)誘導愈傷組織將無菌苗置于配方為MS+2mg/L 2，4-D+0.2mg/L6-BA的培養基中誘導愈傷組織，培養時間為10-30天，培養條件同步驟(2)；(4)誘導不定芽發生將愈傷組織置于配方為MS或B5+1.0-2.0mg/L6-BA+0-0.5mg/L TDZ的培養基上培養30-60天獲得不定芽(高度一般為3-7厘米)，培養條件同步驟(2)；
(5)培養生根將步驟(4)所得到的不定芽分切成單株，在B5+2mg/LIAA的培養基、或者1/2MS+0.5-2mg/L IBA(吲哚丁酸)或NAA(萘乙酸)培養基上培養10-30天，培養條件同步驟(2)。
上述方法中，在步驟(4)芽分化過程中，激素6-BA的濃度最好是2.0mg/L。步驟(5)中培養基最好是采用1/2MS+0.5-2mg/L IBA或NAA配方，它可以避免B5+2mg/L IAA配方中激素分解和操作不便的缺點，即吲哚乙酸在有光的條件下容易分解，并且在操作中要采用過濾滅菌的方法，而采用萘乙酸或者吲哚丁酸后使操作更方便，生根率提高；其中NAA的濃度最好是1.0mg/L。
在本方法中，MS和B5培養基是最常用的培養基，一般從有關植物組織培養的書都可找到其配方。
本發明具有如下的優點和效果1.經實驗證明，與原有的方法比較，本發明方法步驟(3)愈傷組織的誘導率為100％；步驟(4)中，采用提高細胞分裂素濃度的方法，不定芽的誘導頻率及每塊外植體產生的芽數均高于原方法；在步驟(5)中，采用萘乙酸、吲哚丁酸替換原來的吲哚乙酸，不定根發生時間縮短，生根率增加，而且長勢良好，保證了試管苗不定根質量。
2.本發明方法與已有的常規方法相比，無需增加專有設備，操作簡便。
(四)具體的實施方式實施例1(1)外植體的消毒取羞草種子置于65％乙醇中浸泡20s，0.1％升汞中滅菌15min，再用無菌水沖洗3次；(2)無菌苗的萌發將已消毒的種子接種到1/2MS培養基上培養15天，獲取無菌苗，培養條件為溫度25±2℃，光照強度1500Lux，光照時間12h·d-1(表示“小時/天”，下同)；(3)愈傷組織的誘導取無菌苗下胚軸切段，轉接到附加有2mg/L2，4-D和0.2mg/L 6-BA的MS培養基上培養30天，誘導愈傷組織，愈傷組織誘導率100％；(4)芽的分化一個月后接種到附加有1mg/L 6-BA和0.5mg/L TDZ的MS培養基上，培養兩個月時，分化頻率為40％，平均每塊愈傷組織上小苗數為5-10個；(5)根的形成形成的的小苗，轉接入附加2.0mg/L IAA的B5培養基上，30天時，生根率為50％。
而采用原有方法培養的對照組，在添加多種激素的條件下，外植體愈傷組織誘導率達到100％，但此時有80％的愈傷組織產生根，不利于進一步的培養。其不定芽的發生率在其他外植體上最高為31％，在以下胚軸為外植體時僅為8％分化出芽，生長慢，明顯差于本發明方法。本方案采用較少種類的激素就可使愈傷組織誘導率達到100％，此時沒有根的形成，不定芽發生頻率也高于對照9％。
實施例2其它操作及對照組同實施例1，所不同的是步驟(1)中，取羞草種子置于75％乙醇中浸泡60s，0.1％升汞中滅菌4min，再用無菌水沖洗6次；步驟(2)中，培養時間為30天；步驟(3)中，培養時間為10天；步驟(4)中，培養基配方為MS+2mg/L 6-BA，培養時間為30天，不定芽分化率達到60％；步驟(5)中，培養基改為1/2MS+1.0mg/L NAA，20天時，生根率為64.2％，隨著培養時間的延長，生根率會更高。
而對照組的不定芽誘導率僅為8％，不定根發生率最高為50％，明顯差于本發明方法。
實施例3其它操作及對照組同實施例1，所不同的是步驟(1)中，取羞草種子置于70％乙醇中浸泡30s，0.1％升汞中滅菌8min，再用無菌水沖洗5次；步驟(4)中，含羞草愈傷組織轉接到附加有2mg/L 6-BA的B5培養基上，不定芽分化率達到70％；步驟(5)中，培養基為1/2MS+1mg/L NAA，培養時間為10天，生根率為64.2％。
而對照組步驟(4)采用附加激素2，4-D 0.5mg/L和2mg/L 6-BA的B5培養基，不定芽誘導率僅為8％，步驟(5)中采用B5+2mg/L IAA的培養基，不定根發生率僅為50％，生長慢，明顯差于本發明方法。
實施例4其它操作及對照組同實施例3，所不同的是步驟(4)中，培養基配方為B5+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L TDZ；步驟(5)中，培養基配方為1/2MS+0.5mg/LNAA，生根率為50％，與對照組基本持平。
實施例5其它操作及對照組同實施例3，步驟(5)中，培養基配方為1/2MS+2mg/L NAA，生根率為60％。而對照組不定根發生率僅為50％，生長慢，明顯差于本發明方法。
實施例6其它操作及對照組同實施例3，所不同的是步驟(5)中，培養基為附加有2mg/L IBA的1/2MS，生根率為50％，生長較慢。對照組不定根發生率也為50％，但是IAA見光容易分解，并且需要過濾滅菌，操作復雜。
實施例7其它操作及對照組同實施例3，所不同的是步驟(5)中，培養基為附加有0.5mg/L IBA的1/2MS上，生根率為60％。而對照組不定根發生率僅為50％，明顯差于本發明方法。
權利要求
1.一種含羞草的繁殖方法，其特征在于包括如下步驟(1)外植體消毒將含羞草種子置于65-75％乙醇中浸泡20-60s，0.1％升汞中滅菌4-15min，再用無菌水沖洗3-6次；(2)萌發無菌苗消毒后的種子接種到1/2MS培養基上培養15-30天，萌發出無菌苗，培養條件為溫度25±2℃，光照強度1500Lux，光照時間12h·d-1；(3)誘導愈傷組織將無菌苗置于配方為MS+2mg/L 2，4-D+0.2mg/L6-BA的培養基中誘導愈傷組織，培養時間為10-30天，培養條件同步驟(2)；(4)誘導不定芽發生將愈傷組織置于配方為MS或B5+1.0-2.0mg/L6-BA+0-0.5mg/L TDZ的培養基上培養30-60天獲得不定芽，培養條件同步驟(2)；(5)培養生根將步驟(4)所得到的不定芽分切成單株，在B5+2mg/LIAA的培養基、或者1/2MS+0.5-2mg/L IBA或NAA培養基上培養10-30天，培養條件同步驟(2)。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于在步驟(4)芽分化過程中，激素6-BA的濃度為2.0mg/L。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟(5)中培養基的配方為1/2MS+0.5-2mg/LIBA或NAA。
4.如權利要5所述的方法，其特征在于步驟(5)中，NAA的濃度為1.0mg/L。
全文摘要
含羞草的繁殖方法，它在現有技術五步驟——(1)外植體消毒、(2)萌發無菌苗、(3)誘導愈傷組織、(4)誘導不定芽發生和(5)培養生根的基礎上對步驟(3)～(5)進行改進步驟(3)采用MS+2mg/L2，4－D+0.2mg/L 6－BA培養基；步驟(4)采用MS或B5+1.0－2.0mg/L 6－BA+0－0.5mg/L TDZ培養基；步驟(5)采用B5+2 mg/L IAA的培養基、或者1/2MS+0.5－2mg/L IBA或NAA培養基。本方法能明顯提高含羞草的無性繁殖系數，且操作簡便。
文檔編號A01H4/00GK1600080SQ200410051960
公開日2005年3月30日 申請日期2004年10月27日 優先權日2004年10月27日
發明者陳剛, 李玲 申請人:華南師范大學