專利名稱：一種繁育種公牛的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域和動物育種領域中一種繁育種公牛的方法。
背景技術：
自世界上第一頭體細胞克隆動物“多莉”誕生以來，家畜的體細胞克隆技術作為一項新的生物技術得到了迅速的發展，成為當今世界生物技術研究的熱門領域。人們利用不同的細胞系和不同的克隆方法先后得到了克隆牛，克隆羊，克隆豬，克隆鼠，克隆貓等多種家畜和動物的體細胞克隆個體，而其中又以體細胞克隆牛的技術最為完善。據報道，目前全世界有十幾個國家先后培育出了體細胞克隆家畜。體細胞克隆技術的建立有著重大的理論意義和巨大的應用前景。在理論上，它證明了一個高度分化了的體細胞在一定條件下仍能恢復其全能性。在應用上，利用體細胞克隆技術可以大量擴繁性狀優良的家畜，不但可以保持家畜的優良性狀，又可對家畜的性別進行選擇；利用體細胞克隆技術可以培育轉基因動物，從而大大提高轉基因動物的生產效率，降低生產成本，縮短培育時間；利用體細胞克隆技術可有效的挽救瀕危動物；體細胞克隆技術還為分子生物學、發育生物學、再生生物學等基礎理論研究提供獨特的研究平臺；此外，該技術還為醫學研究中治療性克隆開辟了一個全新的領域。
可通過采用優良高產奶牛的體細胞作為供體，通過無性繁殖的手段，快速擴繁高產奶牛的后代，使世界最優秀的高產奶牛的遺傳資源得到最有效率的利用。克隆技術正向產業化商業化方向發展，美國、加拿大、澳大利亞等畜牧業發達國家均已成立相關的生物技術公司，促進本國的奶牛育種和擴群的工作發展。
相對其它同類技術，體細胞核移植技術大面積擴繁優良家畜的優勢在于1)可控制所生產動物的性別，大幅度提高生產效率；2)所產動物在性狀上與母體完全一致，可最大限度的延續優良性狀，這是通過其他任何遺傳手段都無法達到的；3)可利用黃牛作代孕母牛生產奶牛，大量節約生產成本。通過克隆技術直接對高產奶牛進行快速擴群繁育。這樣可以迅速使奶牛的生產水平和牛奶品質上一個臺階。而目前條件下培育一頭優質種公牛是一個漫長而復雜的過程，首先從有性生殖所產生的大量后代中篩選一批公牛，再通過對其后代的各種生產性狀進行分析，才能得到一頭優質種公牛，這大約需要5年左右的時間，而一頭種公牛的最佳繁育期只有7年，所以公牛在得到后代測定結果后只有3年左右的繁育期，導致優質種公牛的價值極高。
發明創造內容本發明的目的是提供一種繁育種公牛的方法。
本發明所提供的繁育種公牛的方法，包括以下步驟1)用種公牛的體細胞建立供核體細胞系，并進行同期處理；2)將步驟1)中經過同期處理的供核體細胞移入去核的卵母細胞內進行融合，得到重組胚；3)將步驟2)中得到的重組胚在體外激活并培養2-7天，得到囊胚，將所述囊胚移入同期發情的受體牛子宮角內，得到體細胞克隆種公牛。
步驟1)中，所述供核體細胞系優選為皮膚成纖維細胞系。所述同期處理為將所述供核體細胞系血清饑餓2-4天。
步驟2)中，所述融合為電刺激融合，具體可在場強為2.0-2.5kV/cm，脈沖時間為10-40μs，脈沖次數為1-3次，脈沖間隔為1s的直流脈沖場中進行。
步驟3)中，所述體外激活可采用以下二種方法進行1)所述體外激活采用細胞松馳素和放線菌酮進行處理，所述處理方法為將所述重組胚在含0.25ug/ml細胞松馳素和10ug/ml放線菌酮的培養液中處理1小時，然后轉入到含10ug/ml放線菌酮的培養液中繼續處理4小時。
2)所述體外激活采用電刺激和細胞松馳素和放線菌酮進行聯合激活法，所述聯合激活的方法為先將所述重組胚在場強為2.0kV/cm的直流脈沖場中處理10-40μs，然后再將所述重組胚在含2.5ug/ml細胞松馳素和10ug/ml放線菌酮的培養液中處理1小時，然后轉入到含10ug/ml放線菌酮的培養液中繼續處理4小時。
所述細胞松馳素為細胞松馳素B或細胞松馳素D。
本發明繁育種公牛的方法，從優質高產的種公牛身體上采取體細胞，在體外培養并建立細胞系，經同期處理后，利用體細胞核移植技術(克隆技術)，將體細胞移植到去了核的卵母細胞內，并與該卵母細胞在體外用物理方法進行融合，融合后的重組胚，在體外由電刺激和化學物質細胞松弛素(CD)和放線菌酮(CHX)處理后，重組胚在體外被激活并在體外培養，待克隆胚發育到囊胚期移入同期發情的受體母牛子宮角內，移植后90天進行妊娠檢查，待胎兒發育完成后，通過自然分娩或實腹產手術，從而得到與細胞供體遺傳性狀完全一致的體細胞克隆種公牛。本發明由于采用皮膚成纖維細胞作為供核體細胞，因此使體細胞克隆的過程操作方便簡單，對供體不會產生損傷，采用電刺激和化學物質(細胞松馳素和放線菌酮)激活處理重組胚，使重組胚發育成囊胚的幾率得到較大提高。
本發明的繁育種公牛的方法由于繁殖過程為無性繁殖、其遺傳物質完全來自于同一個體，所以其繼承了被克隆供體公牛的優良遺傳性狀，不需要進行后代測定，大大縮短了培育時間，節省了成本，將帶來巨大的經濟效益。
具體實施例方式
實施例1、繁育種公牛1.供核體細胞系的建立取荷斯坦奶牛種公牛的耳部皮膚組織，耳部下緣背側去毛后以70％酒精清洗干凈，再用刀片從耳部下緣背側剔取面積為1cm2左右的皮膚，置于0℃的DMEM/F12中盡快運回實驗室，以PBS和70％酒精清洗數遍后剪碎成1mm3左右的小塊，DMEM/F12清洗2遍后分批植塊于含1mL DMEM/F12+10％FBS的25cm2的培養瓶中，待組織塊貼壁牢固后再補加DMEM/F12+10％FBS至6mL，于37℃、5％CO2培養箱培養6-7d，每2d換液1次，待細胞生長匯合后，以0.25％胰蛋白酶(trypsin)消化傳代2-3次，分批以DMEM/F12+20％FBS+10％DMSO凍存。這樣，經原代培養、傳代培養、冷凍等體外培養操作，建立了種公牛供核體體細胞系。
2.卵母細胞的成熟培養從屠宰廠收集成年牛的卵巢，置于30℃的生理鹽水在4h內送到實驗室，37℃的PBS液中清洗三遍后，以直徑為0.7mm針頭抽取直徑為2-8mm的卵泡，回收形態均勻、結構致密的卵丘-卵母細胞-復合體(COCs)，以成熟液(M199+10％FBS+0.01U/mLbFSH+0.01U/mL bLH+1μg/mL雌二醇)洗滌兩遍，然后將卵丘-卵母細胞-復合體以50-60枚/孔放入含成熟液的四孔板，在38.5℃、5％CO2培養箱中成熟培養18-20h后，將成熟的卵母細胞放入0.1％透明質酸酶的管內振蕩2-3min后，再用玻璃管輕輕吹打，使卵丘細胞與卵母細胞完全脫離，選擇形態完整，細胞質均勻并排出第一極體的卵母細胞為胞質受體。
3.核移植程序和克隆胚胎的體外培養將帶有第一極體的卵母細胞移入含M199+10％FBS+7.5μg/mL細胞松馳素B的操作液中，在200倍顯微鏡下用玻璃針于極體上方將透明帶切一小口，再用內徑為20μm的玻璃管將第一極體以及其下方的卵母細胞內的染色體一并吸除，再放入M199+20％FBS的溶液中洗三遍后，置于培養箱中備用。
將血清饑餓2-4天的供核體細胞系用0.25％胰蛋白酶(trypsin)消化2-4min，用20μm直徑玻璃管將直徑為10-12μm的供體細胞移入去了核的卵母細胞透明帶內，然后將其放入zimmerman融合液中或0.3M甘露醇(Mannitol)，0.15mmol/L Ca2+，0.15mmol/L Mg2+液中3-5min后放入融合槽內，轉動卵母細胞使供核體細胞與卵母細胞接觸面與電場垂直，同時在直流脈沖的場強為2.5kV/cm、脈沖時間為10μs、脈沖次數為2次、脈沖間隔為1s的條件下融合(融合儀為BTX公司的ECM-2001)后，迅速移入M199+10％FBS液中，放置0.5h，其融合率為50％-95％。挑選重組胚按照以下二種方法進行體外激活1)用細胞松馳素和放線菌酮進行處理，處理的方法為將重組胚在含0.25ug/ml細胞松馳素和10ug/ml放線菌酮的CRlaa+5％FBS液中處理1小時，然后轉入到含10ug/ml放線菌酮的CRlaa+5％FBS液中繼續處理4小時后再移入CRlaa+5％FBS液中，在38.5℃、5％CO2培養箱中培養，分別在2d和7d后觀察胚胎的發育狀況，結果表明2d的卵裂率40％-85％，繼續培養5天后的7天發育成克隆囊胚，克隆囊胚發育率為20％-60％。
2)用電刺激和細胞松馳素和放線菌酮進行聯合處理，處理的方法為將重組胚移入CRlaa+5％FBS液中，在場強為2.0kV/cm的直流脈沖場中處理10-40μs，然后再將該重組胚在含0.25ug/ml細胞松馳素和10ug/ml放線菌酮的CRlaa+5％FBS液中處理1小時，然后轉入到含10ug/ml放線菌酮的CRlaa+5％FBS液中繼續處理4小時。分別在2d和7d后觀察胚胎的發育狀況，結果表明2d的卵裂率45％-90％，繼續培養5天后的7天發育成克隆囊胚，克隆囊胚發育率為30％-65％。
4、胚胎移植與妊娠檢測將形態優良的第7d公牛克隆囊胚移入已同期的受體牛的子宮角內。在移植后的第30d對受體母牛進行B超檢測以確定受胎情況，并分別在移植后的第60d和第90d進行直腸檢測以確定妊娠率，結果表明受胎率60％，妊娠率為40％。
5、對妊娠母牛按常規飼養方法進行飼養，經過280天，妊娠母牛正常分娩，得到體細胞克隆種公牛。
權利要求
1.一種繁育種公牛的方法，包括以下步驟1)用種公牛的體細胞建立供核體細胞系，并進行同期處理；2)將步驟1)中經過同期處理的供核體細胞移入去核的卵母細胞內進行融合，得到重組胚；3)將步驟2)中得到的重組胚在體外激活并培養2-7天，得到囊胚，將所述囊胚移入同期發情的受體牛子宮角內，得到體細胞克隆種公牛。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述供核體細胞系為種公牛體皮膚成纖維細胞系。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述同期處理為將所述供核體細胞系血清饑餓2-4天。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)中，所述融合為電刺激融合。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述電刺激融合在場強為2.0-2.5kV/cm，脈沖時間為10-40μs，脈沖次數為1-3次，脈沖間隔為1s的直流脈沖場中進行。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟3)中，所述體外激活采用細胞松馳素和放線菌酮進行處理，所述處理方法為將所述重組胚在含0.25ug/ml細胞松馳素和10ug/ml放線菌酮的培養液中處理1小時，然后轉入到含10ug/ml放線菌酮的培養液中繼續處理4小時。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟3)中，所述體外激活采用電刺激和細胞松馳素和放線菌酮進行聯合激活，所述聯合激活的方法為先將所述重組胚在場強為2.0kV/cm的直流脈沖場中處理10-40μs，然后再將所述重組胚在含2.5ug/ml細胞松馳素和10ug/ml放線菌酮的培養液中處理1小時，然后轉入到含10ug/ml放線菌酮的培養液中繼續處理4小時。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于所述細胞松馳素為細胞松馳素B或細胞松馳素D。
全文摘要
本發明公開了一種繁育種公牛的方法，本發明所提供的繁育種公牛的方法，包括以下步驟1)用種公牛的體細胞建立供核體細胞系，并進行同期處理；2)將步驟1)中經過同期處理的供核體細胞移入去核的卵母細胞內進行融合，得到重組胚；3)將步驟2)中得到的重組胚在體外激活并培養2－7天，得到囊胚，將所述囊胚移入同期發情的受體牛子宮角內，得到體細胞克隆種公牛。本發明的繁育種公牛的方法由于繁殖各程為無性繁殖、其遺傳物質完全來自于同一個體，所以其繼承了被克隆供體公牛的優良遺傳性狀，不需要進行后代測定，大大縮短了培育時間，節省了成本，將帶來巨大的經濟效益。
文檔編號A01K67/02GK1715401SQ200410049790
公開日2006年1月4日 申請日期2004年6月29日 優先權日2004年6月29日
發明者戴蘊平, 李寧 申請人:戴蘊平, 李寧