專利名稱：一種微生物殺菌劑及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物殺菌劑及其制備方法和應用，屬微生物農藥技術領域。
背景技術：
中國是農業大國，病蟲草害的防治是農業生產中的重要環節。目前對農植物病害防治仍主要依靠化學殺菌劑。但隨著科學技術發展，研究發現化學農藥在防治病害的同時，對環境的污染越來越嚴重。同時化學農藥往往毒性高，殺傷天敵，破壞生物多樣性，為更嚴重的病蟲害猖獗發生提供了條件，造成病蟲害防治上的惡性循環。連續用藥造成的農藥殘留對人體產生危害以及病原菌抗藥性正引起人們極大的關注。據聯合國糧農組織統計，100余種病原菌對1至數種化學農藥產生了抗藥性，而且分析預測今后將以每5年約10％的數量遞增。農藥還是癌癥等許多疑難疾病的誘因之一，美國環境保護署對本國注冊的360種化學農藥進行評審，發現其中70多種有致癌作用，每年引起2萬例癌癥。農植物病蟲害的化學防治與保護生態環境，保障人民健康形成的矛盾越來越引起關注。微生物農藥對人畜安全，易于分解，與環境相容，被譽為“無公害”農藥。此外，微生物農藥還具有研究周期短、投入低、易于工業化和商品化開發的優勢。自上個世紀90年代以來，微生物農藥每年以20％的速度遞增，已經成為農業生物技術產業中的研究開發熱點之一。
鐮刀菌和立枯絲核菌是兩種重要的，廣普性植物病原菌。前者幾乎危害所有植物，引起各類植物的葉、莖、根部枯萎病。后者引起煙草、小麥、水稻、馬鈴薯、蔬菜、果樹等植物立枯絲核病。凡是感染了上述兩種病原菌的植物，不但產量銳減，質量也明顯下降。鐮刀菌、立枯絲核菌產生的枯萎病和立枯絲核病已經成為農業生產中重要限制因素，研究開發微生物殺菌劑已經成為農業可持續發展中的重要課題。
發明內容
本發明的目的是通過對篩選到的一株具有毒殺植物病原菌的側孢短芽孢桿菌研究，開發微生物殺菌劑。
本發明篩選到一株對鐮刀菌、立枯絲核菌具有很好毒殺功能的側孢短芽孢桿菌Brevibacilius laterosporus G4，G4菌株已保藏在中國典型培養物保藏中心；地址中國.武漢.武漢大學；保藏日期2003年5月26日；保藏登記入冊的編號CCTCC NOM203045。
本發明Brevibacillus laterosporus G4菌株形態特征為長桿狀，個體較大，兩端鈍圓，多以凝集形式存在。在YPD平板培上菌落呈圓形、隆起、邊緣較整齊，表面無光澤、粗糙、類似細小粉末狀，菌苔白色。在YPD培養基上培養36小時以上可見極少數的內生孢子形成或釋放到胞外的芽孢，在NA或LB培養基培養12-16小時，便可見大量脫落的芽孢，芽孢為橢圓形呈獨木舟狀體。
本發明是這樣實現的制備微生物殺菌劑，進行殺菌劑室內藥效試驗，確定其對鐮刀菌和立枯絲核菌兩種植物病原菌的殺菌作用。
制備微生物殺菌劑(以下為重量百分比)1、試管種培養將G4的菌體接種到試管固體培養基斜面上，培養基配方為牛肉膏3克；蛋白胨8克；氯化鈉4克；瓊脂18克；水1000ml，pH7.5。于32-38℃下培養1-2天，獲得試管種。
2、制備微生物殺菌劑采用500ml三角瓶搖瓶培養。方法是先配制液體培養基，液體培養基配方為0.2-0.4％牛肉膏；10-20％大豆餅粉；0.5-2％魚粉；氯化鈉0.3-0.5％；pH7-8，余下為水。在每個三角瓶中裝入300ml液體培養基，120℃滅菌30分鐘，冷卻后接入1cm2大的試管種，于37℃下，120rpm/min搖床培養2天，當活菌數增殖到最高峰，達到1010/ml時，即成為可供使用的微生物殺菌劑。
微生物殺菌劑室內藥效試驗1、制備試驗用藥劑按前述試管種培養方法培養試管種，按前述制備微生物殺菌劑方法制備試驗用藥劑。
2、制備對照用藥劑對照1按前述制備殺菌劑方法制備好微生物殺菌劑后，用細菌過濾器過濾掉菌體，以不含菌體的發酵液為對照。
對照2前述2制備殺菌劑方法制備對照用藥劑，但液體培養基中不接入G4菌株，用未接種的發酵液為對照。
對照3以清水作為對照。
2、制備試驗用病原菌將鐮刀病菌和立枯絲核病菌分別接種到試管固體培養基斜面上，培養基的配方為常用的PDA培養基，方法是取馬鈴薯200克去皮后切成小塊，加水1500ml煮沸20分鐘，過濾后得到1000ml濾液，然后加入葡萄糖20克，瓊脂18克，pH自然。于25℃下培養2-3天，等菌絲長滿并產孢后，用無菌水洗下待用。
3、試驗方法制備混菌平板將直徑9ml的培養皿滅菌后，倒入20m145℃的PDA培養基和0.1ml病原菌液體，充分混勻后制成鐮刀病菌、立枯絲核病菌混菌平板。
藥效試驗采用常規的牛津杯抑菌實驗法，即在每個混菌平板上放置牛津杯，在牛津杯內加入0.1ml的試驗用藥劑和對照用藥劑，于25℃下培養72小時，測量抑菌圈直徑(扣除牛津杯直徑)，重復三個樣品。
4、試驗結果表1微生物殺菌劑對鐮刀病菌室內藥效
表2微生物殺菌劑對立枯絲核病菌室內藥效
結果表明，本發明微生物殺菌劑對鐮刀菌、立枯絲核菌兩種植物病原菌有較好的殺菌作用，平均抑菌圈直徑分別達到2.1和3.73cm，對立枯絲核病菌效果優于對鐮刀病菌效果。但其平均抑菌圈都在2cm以上，顯示了較好的應用前景。
對照1的毫無抑菌作用，表明殺菌作用是由活菌體產生的，不是常規的菌體代謝產物，在產業化生產中重點考慮增加活菌體含量。
具體實施例方式以下是本發明的實施例，但本發明的內容并不局限于此。
實施例一
將Brevibacillus laterosporus G4菌體接種到試管瓊脂培養基斜面上，培養基配方為牛肉膏3克；蛋白胨8克；氯化鈉4克；瓊脂18克；水1000ml，pH7.5；于32℃下培養2天，獲得試管種；用500ml三角瓶擴大培養，液體培養基配方為0.3％牛肉膏；15％大豆餅粉；1％魚粉；氯化鈉0.4％；pH7.5；余下為水。在每個三角瓶中裝入300ml液體培養基，120℃滅菌30分鐘，冷卻后接入1平方ml大小的試管種，于37℃下，120rpm/min培養2天，當活菌數增殖到最高峰，達到1010/ml時，即成為可供使用的微生物殺菌劑。
實施例二基本同實施例一，不同之處是液體培養基配方為0.2％牛肉膏、10％大豆餅粉、0.5％魚粉、氯化鈉0.3％、pH7、余下為水；試管種培養于溫度為35℃、培養時間為1.5天。
實施例三基本同實施例一，不同之處是液體培養基配方為0.4％牛肉膏、20％大豆餅粉、2％魚粉、氯化鈉0.5％、pH8、余下為水；試管種培養于溫度為38℃、培養時間為1天。
權利要求
1.一種微生物殺菌劑，其特征在于該菌劑的生產菌株為側孢短芽孢桿菌Brevibacillus laterosporus G4，G4菌株已于2003年5月26日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號CCTCC NOM203045。
2.權利要求1所述微生物殺菌劑的制備方法，其特征在于(1)試管種培養為將Brevibacillus laterosporus G4的菌體接種到試管固體培養基斜面上，培養基配方為牛肉膏3克、蛋白胨8克、氯化鈉4克、瓊脂18克、水1000ml、pH7.5；于32-38℃下培養1-2天，獲得試管種；(2)制備微生物殺菌劑采用三角瓶搖瓶培養，即先配制液體培養基，液體培養基配方為0.2-0.4％牛肉膏；10-20％大豆餅粉；0.5-2％魚粉；氯化鈉0.3-0.5％；pH7-8，余下為水；在每個三角瓶中裝入300ml液體培養基，120℃滅菌30分鐘，冷卻后接入1平方ml大小的試管種，于37℃下，120rpm/min搖床培養48小時，當活菌數增直到最高峰，達到1010/ml時，即成為可供使用的微生物殺菌劑。
3.權利要求1所述的微生物殺菌劑，其特征在于該殺菌劑對對鐮刀菌和立枯絲核菌兩種植物病原菌具有殺菌作用，可用于植物病害生物防治。
全文摘要
本發明涉及一種微生物殺菌劑及其制備方法和應用，屬微生物農藥技術領域。本發明的生產菌株為Brevibacillus laterosporus G4，該菌株已于2003年5月26日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號CCTCC NOM203045。本發明的微生物殺菌劑采用常規搖瓶發酵方法制備，其固體培養基配方為牛肉膏3克；蛋白胨8克；氯化鈉4克；瓊脂18克；水1000ml，pH7.5。液體發酵培養基配方為0.2－0.4％牛肉膏；10－20％大豆餅粉；0.5－2％魚粉；氯化鈉0.3－0.5％；pH7－8，余下為水。當活菌數增殖達到1010/ml時，即成為可供使用的微生物殺菌劑。本發明的殺菌劑對鐮刀菌和立枯絲核菌兩種植物病原菌具有較好的殺菌作用，可用于植物病害生物防治，具有較好應用前景。
文檔編號A01N63/02GK1640266SQ20041004079
公開日2005年7月20日 申請日期2004年9月30日 優先權日2004年9月30日
發明者張楹, 周薇 申請人:云南大學