專利名稱：一種動物的冷凍精液及其制作方法
技術領域：
本發明涉及精液冷凍技術，廣泛適用于動物精液冷凍。
背景技術：
生物技術飛速發展的今天，優秀種公畜的精液可以通過人工輸精大力推廣，但是由于受地域限制，低溫保存下，鮮精存活并且有受精能力的時間不超過48小時。精液冷凍后則可以保存數十年，解凍后仍然具有受精能力。長期以來，動物精液冷凍多采用甘油作為防凍劑，而甘油對精子的毒副作用較大，影響受胎效果。動物凍精解凍后存活時間比鮮精短10小時以上，這也是凍精受胎率低的重要因素。在凍精稀釋液保存方面，一般是現配制現使用，最多不能超過3天，因此，經常配制稀釋液成為生產凍精的主要工作，某些對受胎效果有益的物質在輸精時添加比較麻煩，工作量大。
發明內容
本發明的目的在于提供一種動物的冷凍精液及其制作方法，該冷凍精液具有較高的受胎率，可以簡化輸精操作，并且制作方法更為簡化。
本發明提供了一種動物的冷凍精液，含有動物精子、糖源、微量元素、抗生素，其特征在于另外含有乙二醇、睪丸酮。
本發明動物的冷凍精液中，還可以含有卵黃、VB12。
本發明動物的冷凍精液中，所用動物精子特別指山羊精子。
本發明特別提供了一種上述動物冷凍精液的制作方法，其特征在于過程如下
稀釋液配制基礎液取乳糖5.1g，葡萄糖3.5g，兩水檸檬酸鈉1.4g，tris 0.12g，EDTA0.03g，然后加雙蒸餾水100ml，溶液煮沸消毒，降溫至37℃；I液取基礎液80ml，加入新鮮卵黃20ml，青霉素10萬iu，鏈霉素0.1g；II液取I液22ml，加入乙二醇4.2ml，睪丸酮5～10mg，葡萄糖130mg，1ml∶0.5mg的VB1212～24ml；I液和II液分別用精密濾紙過濾，取其濾過液；精液處理采出的精液，首先用2.9％的檸檬酸鈉溶液等溫稀釋，然后離心10分鐘，轉速為1000～1500轉/分，轉速逐漸上升。然后棄去上清液，按1∶2加入等溫的I液。
精液加入I液后，以0.2～0.3℃/分鐘降溫至0～4℃，降溫時間為1.5～2.0小時，然后加入等溫的II液對倍稀釋，再平衡0.5～1小時，在該溫度下分裝無菌塑料細管內。
冷凍將0～4℃溫區中的試管移入-100℃±5℃的液氮網面上，冷凍2～3分鐘，至細管表面全部呈現白色后浸入液氮保存。
本發明動物冷凍精液的制作方法中，所述稀釋液可以按以下方式保存將配制好的I液和II液，分裝于玻璃試管或其它玻璃容器中，然后在-1～20℃下凍結；每次處理精液時，取出一定量的I液和II液在37℃以下溫度回溫溶化，即可使用。但溶化后的稀釋液，不能第二次再凍結。
本發明首定量地使用乙二醇作為抗凍劑，并且在抗凍作用方面，以乙二醇為主，其它抗凍劑為輔，代替傳統的使用甘油作防凍劑，使凍精活力提高0.15以上本發明首次在稀釋液中添加丙酸睪丸酮這一雄性激素，作為稀釋液的成分之一，使解凍后的精子存活時間延長8小時以上。這對提高凍精的受胎率具有重大意義。
本發明在稀釋液的保存方面，首次以冷凍狀態保存含有卵黃的稀釋液。在以往的稀釋液中，含有卵黃成分的稀釋液，往往怕凍結而影響冷凍效果。
本發明的發明人經驗后證實，卵黃稀釋液經一次凍結保存，并不影響精液冷凍效果。這就為保存稀釋液帶來了有利的因素稀釋液在0～4℃溫區保存條件下。經2～3天后也會變質而無法使用；然而如果在0℃以下保存取得成功，則可做到稀釋液大量配制，分裝后長期保存。這無疑為生產凍精創造了便利條件。值得一提的是，冷凍狀態解凍后，便不能回復到冷凍狀態。
本發明在稀釋液中，首次加入VB12由這一成分，即將VB12由原來的解凍液中轉移到稀釋液中。在以往的報導在，經常見到以VB12具有提高受胎率的作用，本發明在生產凍精時一次添加VB12，則省去了在千家萬戶輸精時添加VB12的煩瑣操作。
總之，采用本發明技術，凍精解凍后精子的活力由原來的平均0.35，提高到0.50以上；頂體完整率由原來的45％提高到65％以上，凍精解凍后具有授精能力的時間由以前的10～12小時提高到18～20小時。以遼寧絨山羊為實驗對象，綜合配方解凍后效果，使情期母羊受胎率由原來的45％提高到現在的80％，從而可以使遼寧絨山羊優秀種公羊冷凍精液可以大力推廣。
具體實施例方式實施例1稀釋液配制基礎液基礎液取乳糖5.1g，葡萄糖3.5g，兩水檸檬酸鈉1.4g，tris0.12g，EDTA0.03g，然后加雙蒸餾水100ml，溶液煮沸消毒，降溫至37℃；I液取基礎液80ml，加入新鮮卵黃20ml，青霉素10萬iu，鏈霉素0.1g；II液取I液22ml，加入乙二醇4.2ml，睪丸酮5mg，葡萄糖130mg，VB12(1ml∶0.5mg)12ml。
I液和II液分別用精密濾紙過濾，取其濾過液。
稀釋液的保存將配制好的I液和II液，分裝于玻璃試管或其它玻璃容器中，然后在-10℃下凍結。每次處理精液時，取出一定量的I液和II液在37℃以下溫度回溫溶化，即可使用。但溶化后的稀釋液，不能第二次再凍結。
精液處理采用的精液，首先用2.9％的檸檬酸鈉溶液稀釋(等溫稀釋)，然后離心10分鐘，轉速為1000～1500轉/分，轉速逐步漸上升。然后棄去上清液，按1∶2加入等溫的I液。
精液加入I液后，以0.2～0.3℃/分鐘降溫至2±1℃，降溫時間為1.5小時，然后加入等溫的II液(對倍稀釋)，再平衡0.5小時，在該溫度下分裝無菌塑料細管內。
冷凍將試管移入-100±5℃的液氮網面上，冷凍2分鐘，至細管表面全部呈現白色后浸入液氮保存。
解凍將細管迅速放入38～40℃的溫不中，至細管表面剛呈現透明時立即取出，在25℃下進行輸精。
凍精解凍后精子的活力達到0.50；頂體完整率達到65％，凍精解凍后具有授精能力的時間達到18小時。以遼寧絨山羊為實驗對象，綜合配方解凍后效果，使情期母羊受胎率達到80％。
實施例2稀釋液配制基礎液取乳糖5.1g，葡萄糖3.5g，兩水檸檬酸鈉1.4g，tris 0.12g，EDTA0.03g，然后加雙蒸餾水100ml，溶液煮沸消毒，降溫至37℃。
I液取基礎液80ml，加入新鮮卵黃20ml，青霉素10萬iu，鏈霉素0.1g。
II液取I液22ml，加入乙二醇4.2ml，睪丸酮10mg，葡萄糖130mg，VB12(1ml:0.5mg)24ml。
I液和II液分別用精密濾紙過濾，取其濾過液。
稀釋液的保存將配制好的I液和II液，分裝于玻璃試管或其它玻璃容器中，然后在-10℃下凍結。每次處理精液時，取出一定量的I液和II液在37℃以下溫度回溫溶化，即可使用。但溶化后的稀釋液，不能第二次再凍結。
精液處理采用的精液，首先用2.9％的檸檬酸鈉溶液稀釋(等溫稀釋)，然后離心10分鐘，轉速為1000～1500轉/分，轉速逐步漸上升。然后棄去上清液，按1∶2加入等溫的I液。
精液加入I液后，以0.2～0.3℃/分鐘降溫至1±1℃，降溫時間為2小時，然后加入等溫的II液(對倍稀釋)，再平衡1小時，在該溫度下分裝無菌塑料細管內。
冷凍將試管移入-100℃±5℃的液氮網面上，冷凍3分種，至細管表面全部呈現白色后浸入液氮保存。
解凍將細管迅速放入38～40℃的溫水中，至細管表面剛呈現透明時立即取出，在25℃下進行輸精。
凍精解凍后精子的活力達到0.55；頂體整率達到68％，凍精解凍后具有授精能力的時間達到20小時。以遼寧絨山羊為實驗對象，綜合配方解凍后效果，使情期母羊受胎率達到82％。
權利要求
1.一種動物的冷凍精液，含有動物精子、糖源、微量元素、抗生素，其特征在于另外含有乙二醇、睪丸酮。
2.按照權利要求1所述動物的冷凍精液，其特征在于所述冷凍保存的動物精液中含有卵黃。
3.按照權利要求2所述動物的冷凍精液，其特征在于所述冷凍保存的動物精液中含有VB12。
4.按照權利要求3所述動物的冷凍精液，其特征在于所述動物精子為山羊精子。
5.一種權利要求1所述動物冷凍精液的制作方法，其特征在于過程如下稀釋液配制基礎液取乳糖5.1g，葡萄糖3.5g，兩水檸檬酸鈉1.4g，tris 0.12g，EDTA0.03g，然后加雙蒸餾水100ml，溶液煮沸消毒，降溫至37℃；I液取基礎液80ml，加入新鮮卵黃20ml，青霉素10萬iu，鏈霉素0.1g；II液取I液22ml，加入乙二醇4.2ml，睪丸酮5～10mg，葡萄糖130mg，1ml0.5mg的VB1212～24ml；I液和II液分別用精密濾紙過濾，取其濾過液；精液處理采用的精液，首先用2.9％的檸檬酸鈉溶液等溫稀釋，然后離心10分鐘轉速為1000～1500轉/分，轉速逐步漸上升。然后棄去上清液，按1∶2加入等溫的I液；精液加入I液后，以0.2～0.3℃/分鐘降溫至0～4℃，降溫時間為1.5～2.0小時，然后加入等溫的II液對倍稀釋，再平衡0.5～1小時，在該溫度下分裝無菌塑料細管內；冷凍將0～4℃溫區中的試管移入-100℃±5℃的液氮網面上，冷凍2～3分鐘，至細管表面全部呈現白色后浸入液氮保存。
6.按照權利要求5所述動物冷凍精液的制作方法，其特征在于所述稀釋液按以下方式保存將配制好的I液和II液，分裝于玻璃試管或其它玻璃容器，然后在-1～-20℃下凍結；每次處理精液時，取出一定量的I液和II在37℃以下溫度回溫溶化，即可使用。
全文摘要
一種動物的冷凍精液，含有動物精子、糖源、微量元素、抗生素，其特征在于另外含有乙二醇、睪丸酮、卵黃、V
文檔編號A61D19/00GK1657020SQ20041002117
公開日2005年8月24日 申請日期2004年2月20日 優先權日2004年2月20日
發明者張世偉, 宋先忱, 朱延旭, 劉興偉, 郭春潤 申請人:遼寧省遼寧絨山羊原種場