專利名稱：一種保存體外肝細胞系統的方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及生物材料保存技術，具體涉及一種體外哺乳動物肝細胞系統的保存方法。
背景技術：
在生物醫藥研究中，特別是體外藥物代謝和相互作用研究中，常需要體外肝細胞系統的參與，體外肝細胞系統的保存效果，是影響上述研究結果的關鍵因素之一。體外肝細胞系統在運輸過程中容易發生肝細胞死亡和貼壁肝細胞的脫落。目前常用的方法是應用UW保存液。根據中華器官移植學會主任委員夏穗生教授1994年10月在“中華器官移植雜志”上報導UW是迄今為止最成功的器官保存液，可明顯地延長器官冷凍保存時間，長達72小時之久。UW對于器官保存具劃時代的貢獻。然而，在細胞水平，特別對于貼壁肝細胞，以UW為主體的低溫保存，常引起細胞在運輸過程中的死亡和脫落。因此研制一種特異的肝細胞保存液對生物醫藥研究具有重大的意義。
發明內容
本發明的目的是提供一種方便、有效的生物材料保存技術，具體涉及一種保存體外哺乳動物肝細胞系統的方法。本方法能提高體外肝細胞系統的存活率和貼壁率，方便存儲、運輸和使用。
本發明方法采用生物材料保存液在常溫下保存體外肝細胞系統。
本發明所述的生物材料保存液可為體外哺乳動物肝細胞系統保存液，包括保存液A和保存液B。其中，保存液A的組分含量范圍如下，組分與濃度 含量(毫升)谷氨酸(glutamine)200mM 500-600亞麻酸/小牛血清白蛋白linoleic 250-300acid/BSA
上皮促生長因子(EGF)1μg/mL 8-11氫化可的松(Hydrocortisone)10mM 12-15腺苷(Adenosine)50mM 8-10硒(Selenium)10mM 1.5-2.5別嘌呤醇(Allopurinol)10mM8-10霍亂毒素(Cholera toxin)1mg/ml8-10肝細胞生長因子(LCGF)0.5mg/ml 6-8鐵蛋白(Transferrin)25mg/ml 8-10乙醇胺(Ethanolamine)100mM1.5-2.5催乳激素5mg/ml Prolactin 0.7-1異博定(Isoptin)200μg/ml 8-10保存液B的組分含量范圍是，組分與濃度含量(毫升)WEM細胞培養液Williams E medium780-820胰島素(insulin)10mg/ml3-5糖原(Glucagon)1mg/ml 40-50青霉素/鏈霉素 40-50(Penicillin/Streptomycin)，(青霉素50,000單位，鏈霉素50mg/mL)二性霉素(Fungizone)250μg/ml 50-75上述組分配制如下1)谷氨酸glutamine 200mM直接購自廠商(GIBCO 25030-0810)。
2)亞麻酸/小牛血清白蛋白Linoleic acid/BSA直接購自廠商(Sigma L-9530)。
3)上皮促生長因子EGF 1μg/ml溶解100μg(Sigma E-4127)于100mLWEM細胞培養液中。
4)氫化可的松Hydrocortisone 10mM溶解18.13mg(Sigma H-0888)于5mL 100％的乙醇中。
5)腺苷Adenosine 50mM溶解134mg(Sigma G9251)于100mL WEM細胞培養液中。
6)硒Selenium 10mM溶解67mg(Sigma S-5261)于39mL無菌水中。
7)別嘌呤醇Allopurinol 10mM溶解13.6mg(Sigma A-8003)于100mLWEM細胞培養液中。
8)霍亂毒素Cholera toxin 1mg/ml溶解100mg(Sigma C-3012)于100mLWEM細胞培養液中。
9)肝細胞生長因子LCGF 0.5mg/mL溶解(Sigma G-1887)25mg于50mLWEM細胞培養液中。
10)鐵蛋白Transferrin 25mg/mL溶解(Sigma T-8158)50mg于2mL WEM細胞培養液中。
11)乙醇胺Ethanolamine 100mM溶解0.30mL(Sigma E-0135)于50mL無菌水中。
12)催乳激素Prolactin 5mg/ml溶解1000個國際單位(Sigma L-6520)于6.25mL WEM細胞培養液中。
13)異博定Isoptin 200μg/mL加(Knoll AG D6700)0.2mL于100mLWEM細胞培養液中。
14)WEM細胞培養液Williams E medium直接購自廠商(WME，GIBCO12551-032)。
15)胰島素insulin 10mg/mL溶解100mg(Sigma I-5500)于10mL酸性水(pH2-3)中。
16)糖原(Glucagon)1mg/mL溶解5mg(Sigma G-3157)于5mL酸性水(pH2-3)中。
17)青霉素/鏈霉素Penicillin/Streptomycin直接購于廠商(GIBCO15140-122)。
18)二性霉素Fungizone 250μg/mL直接購于廠商(GIBCO 15290-018)按上述組分含量范圍分別配制保存液A和保存液B，使用時，將上述保存液A和保存液B按下列配比配制取保存液A20毫升，保存液B40毫升，加入940毫升WEM細胞培養液，調節酸鹼度(pH)為7.45±0.10，滲透壓(Permeate pressure)調節至310±10mOsm/L。制成本發明生物材料細胞保存液。保存細胞的使用濃度為1百萬貼壁肝細胞/毫升，使用溫度為15-25℃。
本發明經過體外藥物代謝和相互作用評價試驗的驗證，結果證實，肝細胞在經過了48小時的運輸后仍然保持其存活率和細胞貼壁能力。本發明方法易于掌握，配制和生產的細胞保存液，降低了成本，增加了保存效果，特別是改善、提高了受運輸條件影響的細胞存活率和貼壁率，方便存儲、運輸和使用，可滿足日益發展的體外藥物藥效篩選和藥物相互作用評價的需要。
具體實施例方式
實施例1按各組分濃度配制后，取谷氨酸200mM 500mL，亞麻酸/小牛血清白蛋白250mL，上皮促生長因子EGF 1μg/m 18mL，氫化可的松10mM 12mL，腺苷50mM 8mL，硒10mM 1.5mL，別嘌呤醇10mM 8mL，霍亂毒素1mg/m 18mL，肝細胞生長因子0.5mg/mL 6mL，鐵蛋白25mg/mL 8mL，乙醇胺100mM 1.5mL，催乳激素5mg/m 10.7mL，異博定200μg/mL 8mL，配制保存液A；取WEM細胞培養液780mL，胰島素10mg/mL 3mL，糖原1mg/mL 40mL，青霉素/鏈霉素(青霉素50,000單位，鏈霉素50mg/mL)40mL，二性霉素250μg/mL 50mL，配制保存液B；使用時，將上述保存液A和保存液B按下列配比配制取保存液A20毫升，保存液B40毫升，加入940毫升WEM細胞培養液，調節酸鹼度(pH)為7.55，滲透壓調節至320mOsm/L，保存細胞的使用濃度為1百萬貼壁肝細胞/毫升，使用溫度為25℃。
實施例2按各組分濃度配制后，取谷氨酸200mM 600mL，亞麻酸/小牛血清白蛋白300mL，上皮促生長因子EGF 1μg/ml 11mL，氫化可的松10mM 15mL，腺苷50mM 10mL，硒10mM 2.5mL，別嘌呤醇10mM 10mL，霍亂毒素1mg/ml 10mL，肝細胞生長因子0.5mg/mL 8mL，鐵蛋白25mg/mL 10mL，乙醇胺100mM 2.5mL，催乳激素5mg/ml 1mL，異博定200μg/mL 10mL，配制保存液A；取WEM細胞培養液820mL，胰島素10mg/mL 5mL，糖原1mg/mL 50mL，青霉素/鏈霉素(青霉素50,000單位，鏈霉素50mg/mL)50mL，二性霉素250μg/mL 75mL，配制保存液B；使用時，將上述保存液A和保存液B按下列配比配制取保存液A20毫升，保存液B40毫升，加入940毫升WEM細胞培養液，調節酸鹼度(pH)為7.55，滲透壓調節至300mOsm/L，保存細胞的使用濃度為1百萬貼壁肝細胞/毫升，使用溫度為15℃。
權利要求
1.一種保存體外肝細胞系統的方法，其特征是采用生物材料保存液在常溫下保存體外肝細胞系統。
2.按權利要求1所述的保存體外肝細胞系統的方法，其特征是所述的生物材料保存液為體外哺乳動物肝細胞系統保存液，包括保存液A和保存液B，其中，保存液A的組分含量范圍如下，組分與濃度 含量(毫升)谷氨酸200mM 500-600亞麻酸/小牛血清白蛋白250-300上皮促生長因子1μg/mL8-11氫化可的松10mM 12-15腺苷50mM 8-10硒10mM 1.5-2.5別嘌呤醇10mM 8-10霍亂毒素1mg/ml 8-10肝細胞生長因子0.5mg/ml 6-8鐵蛋白25mg/ml8-10乙醇胺100mM 1.5-2.5催乳激素5mg/ml 0.7-1異博定200μg/ml 8-10保存液B的組分含量范圍是，WEM細胞培養液780-820胰島素10mg/ml3-5糖原1mg/ml 40-50青霉素/鏈霉素， 40-50(青霉素50,000單位，鏈霉素50mg/mL)二性霉素250μg/ml50-75
3.按權利要求2所述的保存體外肝細胞系統的方法，其特征是所述組分如下配制，上皮促生長因子EGF 1μg/ml溶解100μg于100mL WEM細胞培養液中；氫化可的松10mM溶解18.13mg于5mL 100％的乙醇中；腺苷50mM溶解134mg于100mL WEM細胞培養液中；硒Selenium 10mM溶解67mg(Sigma S-5261)于39mL無菌水中；別嘌呤醇Allopurinol 10mM溶解13.6mg于100mL WEM細胞培養液中；霍亂毒素1mg/ml溶解100mg于100mL WEM細胞培養液中；肝細胞生長因子0.5mg/mL溶解25mg于50mL WEM細胞培養液中；鐵蛋白25mg/mL溶解50mg于2mL WEM細胞培養液中；乙醇胺100mM溶解0.30mL于50mL無菌水中；催乳激素5mg/ml溶解1000個國際單位于6.25mL WEM細胞培養液中；異博定200μg/mL加入0.2mL于100mL WEM細胞培養液中；胰島素10mg/mL溶解100mg于10mL酸性水中；糖原1mg/mL溶解5mg于5mL酸性水中。
4.按權利要求1和2所述的保存體外肝細胞系統的方法，其特征是所述保存液，其中保存液A和保存液B按下列配比配制取保存液A20毫升，保存液B40毫升，加入940毫升WEM細胞培養液，調節pH為7.45±0.10，滲透壓為310±10mOsm/L。
5.按權利要求1所述的保存體外肝細胞系統的方法，其特征是所述保存細胞的使用濃度為1百萬貼壁肝細胞/毫升，使用溫度為15-25℃。
6.按權利要求3所述的保存體外肝細胞系統的方法，其特征是所述酸性水為pH2-3。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，涉及生物材料保存技術，具體涉及一種體外哺乳動物肝細胞系統的保存方法。本發明體外哺乳動物肝細胞系統保存液，包括保存液A和保存液B，在常溫下保存體外肝細胞系統。本發明方法易于掌握，方便存儲、運輸和使用，經體外藥物代謝和相互作用評價試驗的驗證，所配制和生產的細胞保存液，降低了成本，增加了保存效果，特別是改善了受運輸條件影響的細胞存活率和貼壁率，可滿足日益發展的體外藥物藥效篩選和藥物相互作用評價的需要。
文檔編號A01N1/02GK1657609SQ20041001634
公開日2005年8月24日 申請日期2004年2月16日 優先權日2004年2月16日
發明者胡卓漢 申請人:瑞德肝臟疾病研究(上海)有限公司