專利名稱：狐尾藻工程苗快繁方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種快速生產狐尾藻優質工程苗的方法。
背景技術：
狐尾藻(Myriophyllum spicatum Linn.)為小二仙草科狐尾藻屬一種水生草本植物，生長在池塘、湖沼或水稻田中。該植物對水體污染具有較高的耐受性，在富營養化水體生態修復工程中常被用作凈水工具種和植被恢復先鋒物種。該植物還被廣泛栽植于魚、蝦和蟹塘中，不僅可以為上述水產品提供餌料，也可以為之提供必要的避難和產卵場所。另外，在室內觀賞水族養殖過程中，該植物也是常用的造景材料。
目前市場上對狐尾藻種苗需求量很大。但有關狐尾藻的研究都集中在其自然種群的分布、其耐污性與凈水效果、以及其在魚蝦蟹養殖中的應用。在實踐過程中，狐尾藻種源都采集于自然環境。該植物莖柔軟而多分枝，打撈過程中根系多遭受嚴重破壞，且植株間大小不一，不利于其成功移植。另外，自然來源的狐尾藻帶有各種雜藻雜菌，不利于魚蝦蟹塘和室內觀賞水族缸中的安全使用。最后自然環境中狐尾藻種源有限，過量采集容易導致其原生生境的破壞。
迄今國內外未見有關狐尾藻無菌苗的培養及其大規模人工繁殖的研究與報道。
發明內容
本發明的目的是利用植物組織培養技術，獲得并在室內大規模繁殖狐尾藻工程苗，并盡量保持其無菌，以克服該物種野外收集有限且污染嚴重的弊端，適應我國淡水湖泊植被恢復、野外魚蝦蟹水產養殖以及室內觀賞水族布景的需要。本發明的技術方案是1.狐尾藻無菌芽的獲得從野外自然生境中采集狐尾藻植株，剪取幼嫩芽段，于肥皂水中浸泡2h以上，用自來水沖洗干凈。在超凈工作室中，用70％乙醇浸泡一定時間，再用適當濃度的NaClO漂白劑并一定比例的Tween-80浸泡一定時間，用無菌水徹底漂洗后接種于培養液①(見表1)中，并置于組織培養室中培養。室內平均光照強度2000lx，每日光照10h，溫度為25℃左右。期間注意觀察，隨時剔除仍然污染的材料，以免交叉感染。
2.狐尾藻叢芽的擴增由上述步驟獲得的無菌個體經過2周培養后，多數莖葉已明顯伸長，并有側芽長出。于超凈工作室中，將所有2cm以上的側芽切下，過長的莖段再以每2cm長度切小，將每段轉接到新的培養液①中。以后每隔2周將長大的材料按上述方法重復切割，以獲得足夠多的無菌芽。上述擴增培養過程仍在組培室中進行，光照和溫度不變。
3.狐尾藻生根與完整苗的誘導取上述步驟2獲得無菌側芽，同樣保持在2cm左右，轉接到培養液②(見表1)中，繼續在組培室中培養10d以上，誘導材料生根并形成完整幼苗。組培室中光照和溫度不變。
表1.狐尾藻培養液①、②配方為
*上述培養液按濃度配好后均用稀HCl或NaOH調整pH到5.7，分裝到100mL三角瓶中，用封口膜包扎后于121℃、0.1MPa左右濕熱滅菌18min。
4.狐尾藻工程苗的壯苗將上述培養液②中莖長6cm以上，并至少帶有2根2cm以上根的狐尾藻幼苗取出，移栽到底部鋪有滅過菌的沙石的大玻璃缸中。保持水深50cm以上，每周換水并添加一定量Hoagland營養液以促進其生長。當室外白晝氣溫20℃以上時，將玻璃缸置于室外，直接利用太陽光照；否則，將玻璃缸置于溫室中，晝夜溫度分別保持18℃和25℃以上，并在白天適當補充人工光照。上述培養保持到植株長至40cm以上。
5.狐尾藻工程苗的應用上述通過步驟3培養后收獲的莖長6cm以上、根系發達的健康狐尾藻小苗，直接應用于室內觀賞水族布景。具體操作方法為先用自來水將植株上殘留的培養液沖洗干凈，以防粘附培養液對觀賞水族的污染，然后根據布景的需要，插植于水族缸底沙中。上述通過步驟4培養后獲得的株高40cm以上、根系發達的健康狐尾藻植株，應用于魚蝦蟹塘的養殖以及大型湖泊水體生態修復工程中。具體操作方法為從大玻璃缸中挖取健康狐尾藻植株，注意保持其根系完整，采用黑暗和保濕方式迅速運抵目標地后，根椐魚蝦蟹苗投放量或水體富營養和植被退化程度決定狐尾藻栽種密度，并根據實際需要，采用單株或叢株移栽，以及單一物種移栽或與其它物種混合移栽。
本發明的效果在于1)獲得了狐尾藻無菌苗。野外采集的狐尾藻原材料本身污染嚴重，而該水草莖葉細嫩，又兼有吸收能力，使其滅菌過程具有相當難度。本技術先采用較溫和的肥皂水浸洗，初步降低污染后，再以乙醇、NaClO漂白劑以及Tween-80共同作用，徹底滅菌。通過該程序，在保證平均無菌率60％的基礎上，材料存活率可保證在50％以上。再利用合適的培養液和激素配比，分別誘導出叢芽和根，并最終獲得完整無菌苗。經過馴化培養的狐尾藻無菌芽，在培養液①中每2周的增殖率在1∶30以上(即每個單芽經2周培養后，至少可獲得30個以上叢芽)，同時在培養液②中，材料的生根率也在80％以上。
2)建立了狐尾藻工程苗快速繁殖途徑。本技術在獲得狐尾藻無菌芽的基礎上，直接利用其側芽進行分割繁殖，步驟簡單，操作方便。所用試劑均為常規化工產品，成本低廉，便于其大規模工廠化生產。期間未涉及愈傷組織的脫分化和分化過程，盡量避免了組織培養過程中遺傳變異的可能性，一旦獲得無菌種芽，即可進行長期擴增繁殖。
本項發明可不分季節，隨時為湖泊植被恢復、魚蝦蟹塘養殖以及室內水族觀賞布景提供足夠的狐尾藻優質工程苗。
具體實施例方式
實例1.于2003年10月從南京江浦縣采集狐尾藻種源，剪取2cm長的芽段5個，于肥皂水中浸泡4h后用自來水漂洗。進入超凈工作室中，用70％乙醇浸泡數秒，再用稀釋適當比例并含有一定量Tween-80的NaClO漂白劑浸泡數分鐘，用無菌水徹底漂洗后，將每個芽單獨接種于含培養液①并已滅菌的的封口三角瓶中，于組培室中培養。平均光照強度2000lx，每日光照10h，溫度25℃左右。此后經觀察，發現其中2瓶仍然污染，而另3瓶無菌并在幾天后開始明顯返綠。2周后于超凈工作室中將3瓶材料中的每個2cm以上的側芽切下并單獨接種于新的培養液①中，共得11瓶。繼續培養2周后再次切割，并以每5個芽為一瓶，接種到培養液②中，共為62瓶。20d后收獲莖長6cm以上，且至少帶2個2cm以上根的完整狐尾藻無菌苗272株。2004年1月將這些健康小苗用于觀賞水族布景。
實例2.于2003年11月從蘇州東太湖采得狐尾藻種源，剪取2cm長的芽段20個，于肥皂水中浸泡4h后用自來水漂洗。進入超凈工作室中，用70％乙醇浸泡數秒，再用稀釋適當比例并含有一定量Tween-80的NaClO漂白劑繼續消毒。用無菌水徹底漂洗后，將每個芽單獨接種于培養液①中，于組培室中培養。平均光照強度2000lx，每日光照10h，溫度25℃左右。2周內共剔除污染材料11份，另9份材料中有5份明顯增長。初次切割后共獲得48個側芽，繼續培養于培養液①中。此后每隔2周分割一次并轉接到新的培養液①中以誘導更多叢生芽。2個月后，將新生芽轉接到培養液②中以誘導生根。15d后將完整小苗取出，移栽到鋪有滅過菌的沙石的大玻璃缸中，并在溫室中培養。每周換水且補充Hoagland營養液以壯苗。該批材料將被應用于太湖富營養化水體生態修復工程中。
權利要求
1.一種狐尾藻無菌苗培養及其工程苗快速擴繁的方法，其特征為該方法由以下步驟組成1)經過一系列滅菌過程，獲得狐尾藻無菌芽；2)將原生無菌芽接種于以Ms為基本成分并附加有一定量激素的培養液①中以誘導叢生芽，并每隔2周將2cm以上長度的新芽切下并接種到新的培養液①中以不斷擴增直到獲得足夠多材料；3)將新芽同樣切割下來后轉接到以Ms為基本成分但激素類型和含量有所變化的培養液②中以誘導生根；4)將培養液②培養到莖長6cm以上，根系發達的幼苗轉到大玻璃缸中，補充Hoagland營養液繼續壯苗，直到植株長至40cm以上。
2.根據權利要求1所述狐尾藻工程苗在湖泊植被恢復工程中的應用。
3.根據權利要求1所述狐尾藻工程苗在魚蝦蟹養殖過程中的應用。
4.根據權利要求1所述狐尾藻工程苗在室內觀賞水族養殖過程中的應用。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域。運用狐尾藻組織培養技術，獲得并大規模擴繁其優質工程苗，以克服該物種在自然環境中種源有限且污染嚴重的問題。滿足目前湖泊生態修復工程中作為凈水工具種和植被恢復先鋒物種、魚蝦蟹塘養殖過程中作為餌料、避難和產卵場所，以及室內觀賞水族養殖過程中作為布景材料的迫切需要。
文檔編號A01H4/00GK1559184SQ200410014210
公開日2005年1月5日 申請日期2004年3月4日 優先權日2004年3月4日
發明者周長芳, 安樹青, 尹大強, 蔣金輝 申請人:南京大學