專利名稱：：轉基因禽類中的蛋白質生產的制作方法
技術領域：
：本發明涉及轉基因禽類的傳代及重組蛋白質的生產。更特別地，本發明涉及增強的外源遺傳物質對禽類細胞的轉導，以便將所述遺傳物質摻入禽類基因組中，從而這種修飾被整合到種系中并引起所編碼的蛋白質在禽卵中的表達。生產大量藥物級蛋白質的能力在生物技術和制藥領域正變得越來越重要。近來這種產品尤其是單克隆抗體在市場上的成功給已經緊張的全球制造資源增加了巨大的負擔。對于制造量增高的需求、相應的因制造量而產生的高額費用以及對生產空間的長期等待，加上在細胞系中生產蛋白質的成本和相關問題已經促使各個公司尋找傳統生產模式之外的模式(Andersson&Myhanan，2001)。生產重組蛋白質的傳統方法包括在細菌或哺乳動物細胞中進行生產。另一種生產策略是使用轉基因動物和植物來生產蛋白質。最初的經過遺傳修飾的(轉基因)動物是經遺傳工程通過將感興趣的蛋白質的基因轉移至靶動物中產生的。目前的轉基因技術可以追溯到1968和1981年之間進行的一系列關鍵實驗，包括通過胚干細胞的胚泡注射使嵌合小鼠傳代(Gardner，1968)、通過精子將外源DNA輸送至兔卵母細胞(Brackettetal，1971)、通過將病毒DNA注射進植入前的胚泡中來生產轉基因小鼠(Jaenisch&Mintz，1974)，及通過原核注射(pronuclearinjection)使小鼠中轉基因在種系中傳遞(Gordon&Ruddle，1981)。對于早期的轉基因歷史，注意力集中在改良動物的遺傳組成并因此提高毛、肉或蛋的產量(Curtis&Barnes，1989；Etches&Gibbins，1993)。然而，近年來感興趣的是利用用于醫學應用如器官移植、人類疾病模型或者被指定用于人類的蛋白質的生產的轉基因系統。許多基于生物制藥的蛋白質已經在轉基因小鼠、兔、豬、綿羊、山羊和牛的乳汁中以適當水平被生產，但這種系統傳代時間往往很長，一些較大的哺乳動物從轉基因建立者發育到可產乳汁的階段需要許多年。關于乳汁的生化復雜性及人和哺乳動物之間的進化保守的額外困難，可在產生該藥物的哺乳動物中產生對藥物的不良反應(Harveyetal，2002)。目前對于將雞卵用作藥物學上的重要蛋白質尤其是重組人抗體的潛在生產載體越來越感興趣。每年醫學界需要大量的治療性抗體，數量可以是幾千克/年或幾噸/年，因此解決這種缺乏的生產方法學將具有巨大優勢。一旦將其最優化選定，基于雞卵的生產方法與哺乳動物細胞培養或使用轉基因哺乳動物系統相比具有一些優勢。首先，雞具有較短的傳代時間(24周)，這將使得轉基因禽群得以迅速建立。下表表示的是不同類型的轉基因系統之間的比較。其次，轉基因動物生產設備的投資費用遠比細胞培養中的費用低。與細胞培養所需設備相比，額外的處理設備最少(BioPharm，2001)。由于這些較低的投資費用，每個治療單位的生產成本將低于細胞培養的生產成本。另外，轉基因系統在純化批次大小和頻率方面提供了顯著更大的靈活性，這種靈活性可以通過對批次大小進行最優化，而使得純化中的投資和操作成本被進一步降低。第三方面的優勢是當這種技術已發展可進行商業實施的程度時，顯然增加了市場導入速度。轉基因哺乳動物每升乳汁中可產生幾克的蛋白質產物，使得可以進行大規模的商業生產(Weck，1999)。哺乳動物在按比例擴大生產所花費的時間方面不具有顯著優勢，因為牛和山羊的妊娠周期分別是9個月和5個月(Dove，2000)，并且會花費長達5年的時間來產生商業上可用的群體。然而，一旦該群體建立，來自乳汁的產物的產量將很高。各種轉基因動物生產系統之間的對比(Dove，2000)。禽類的短傳代時間也使得可以快速擴大群體。雞的孵育時間僅為21天，并且其在孵出6個月內達到成熟。事實上，一旦已經建立了群體的建立者動物，則可以在18個月內建立一個群體(Dove，2000)。擴大生產能力的過程與綿羊、山羊或牛的群體相比應更簡便和更快速。另一個優勢是依賴于卵是天然的無菌容器的這個事實。細胞培養生產方法的一個固有問題是有被微生物污染的危險，因為使用的富有營養的培養基往往促進了微生物的生長。轉基因生產提供了一種低危險性的替代方法，因為蛋白質的生產發生在動物自身內部，其自身機體將會抗擊大多數感染。雞卵提供了一種危險性更低的替代方法卵被密封在卵殼和膜內并由此在很大程度上與環境隔離開。人和禽類之間的進化距離意味著這兩者之間共有的疾病很少。另一個潛在的優勢是在雞的蛋白質發生翻譯后修飾。現在已經認識到一項生產方法在所生產的蛋白質上重現天然糖分布的能力如何是一項生產工藝是否成功的關鍵因素(Parekhetal，1989；Routieretal，1997；Morrow，2001；Rajuetal，2000，2001)。細胞培養過程中所使用的主要細胞類型是倉鼠或小鼠衍生型，因此在蛋白質上不產生與人細胞相同的糖模式(Scrip，2001年6月8日)。哺乳動物及特別是植物轉基因系統在表達的蛋白質上產生不同類型的翻譯后修飾。糖分布對人免疫系統對蛋白質起反應的方式極為重要。Rajuetal，(2000)發現糖基化的雞蛋白質的糖分布與糖基化的人蛋白質間的相似性比其與非人哺乳動物蛋白質間的相似性更高，這在開發治療產品中應是一個顯著優勢。因此可以看出禽卵，特別是雞卵，作為基于哺乳動物或植物的生產手段及其它轉基因生產系統提供了超過細胞培養的一些主要優勢。將轉基因哺乳動物生產中使用的方法直接應用于禽類的遺傳操縱還不可能，因為產卵母雞的生殖系統具有特殊的特征。在天然或人工授精后，母雞將產能育卵大約10天。它們每天排卵一次，并且幾乎立即授精，此時卵子在輸卵管的上部。該卵在輸卵管中度過接下來的20-24小時，在此蛋白落下位于卵黃周圍，plumping液被加入蛋白中，最后卵殼膜和卵殼自身落下。在此期間，細胞迅速分裂，由此到產到產卵時，胚胎包含一個胚盤，一盤大約60,000個相對未分化的細胞位于卵黃上。卵形成的復雜性使得雞胚發育的最早階段相對難以接近。用于接近較早期胚的方法通常包括處死供體母雞以獲得胚胎或者直接注射進輸卵管中。生產轉基因哺乳動物的方法幾乎只集中于對受精卵的顯微注射，從而將前核在體外用DNA進行顯微注射，并將被操縱的卵轉移至代母充分發育，這個方法在母雞中不可行。已經開發了產生轉基因禽類的4種通用方法。開發了一種使用DNA顯微注射入胚盤的細胞質中來生產轉基因雞的方法。將雞受精卵在第一次卯裂分裂之前從產卵母雞的輸卵管中取出，移至替代卵殼中，操縱并培養直至孵化(Perry，1988；RoslinUS5,011,780和EP0295964)。Loveetal，(1994)分析了在培養中存活至少12天的胚胎，并顯示出大約一半的胚胎含有質粒DNA，其中6％處于與1個拷貝/細胞的水平。有7只雞，占注射的卵總數的5.5％，存活直至性成熟。其中一只經鑒別是潛在的嵌合型轉基因禽類的小公雞，將轉基因傳遞至其3.4％的子代。對這些禽類進行繁殖，表現出了轉基因的穩定傳遞。如在通過原核注射產生的轉基因小鼠中，質粒DNA的整合顯然是一個隨機事件。然而，直接將DNA顯微注射入卵中導致轉基因整合效率低下(Sang&Perry，1989)。估計僅1％的經顯微注射的卵生成轉基因胚胎，其中10％存活至孵化。這個方法的效率可以通過提高所培養的胚胎的存活率及被注入的DNA的染色體整合頻率而改良。第二種方法包括在體外轉染原始生殖細胞并移植入被合適地制備好的受體中。原始生殖細胞的成功轉移已被獲得，致使從被轉移的生殖細胞中產生能育的配子。作為轉移之前向原始生殖細胞進行基因轉移的結果，轉基因子代至今還未被描述。第三種方法包括使用衍生自致癌逆轉錄病毒的基因轉移載體。早期載體是能復制的(Salter，1993)，但已經揭示了復制缺陷型載體(見例如US5,162,215和WO97/47739)。這些系統使用A型網狀內皮組織增殖病毒(REV-A)或禽類自血病病毒(ALV)。這些載體在轉基因禽類建立者的生產中效率較低，并且來自這些建立者的載體的遺傳效率也很低下(Harveyetal，2002)。這些載體也可能由于它們所攜帶的轉基因的表達沉默而受影響，如同報道所指出的那樣蛋白質表達水平低(Harveyetal，2002)。第四種方法包括在體外培養雞胚胎細胞，隨后通過將這些培養細胞導入受體胚胎中產生嵌合禽類(Painetal，1996)。胚胎細胞可以在嵌合體產生之前在體外進行遺傳修飾，由此生成嵌合轉基因禽類。沒有關于從經遺傳修飾的細胞進行種系傳遞的報道。盡管對衍生自如前述的ALV和REV這樣的病毒的逆轉錄病毒載體已經進行了許多研究，但這種載體的局限性阻礙了其更廣泛的應用。許多病毒載體的研究和進展都是基于它們在基因治療應用中的用途，并由此表明基于慢病毒的載體能感染未分裂的細胞，這在臨床基因治療應用中具有明顯的優勢。慢病毒是逆轉錄病毒的一個亞組，包括多種靈長類動物病毒例如人免疫缺陷病毒HIV-1和HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，及非靈長類動物病毒(例如羊進行性間質肺炎病毒(MW)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)、山羊關節炎腦炎病毒(CAEV)及牛免疫缺陷病毒(BIV))。這些病毒在基因治療進展中特別引入注目，因為慢病毒不僅具有不可逆整合進宿主細胞DNA中的一般逆轉錄病毒特性，而且如前述也具有感染未增殖細胞的能力。其它類型逆轉錄病毒對細胞增殖狀態的依賴性略微限制了其用作基因轉移載體。慢病毒感染的生物學可參見Coffinetal，(1997)和Sanjayetal，(1996)所述。在病毒載體的設計中要考慮的一個重要事項是其穩定地整合進細胞基因組中的能力。先前的研究已經表明用作基因轉移載體的致癌逆轉錄病毒載體由于在發育期間的基因沉默作用所致而對整合的成功略有限制。Jahneretal，(1982)指出了基于莫洛尼鼠類白血病毒(MoMLV)的載體不適于例如生產轉基因動物，這是由于在發育階段期間病毒的沉默導致轉基因的極低表達。因此，必需的是用于生產轉基因禽類的任何病毒載體都不呈現基因沉默。Pfeiferetal，(2002)和Loisetal，(2002)對小鼠進行的研究顯示基于HIV-1的慢病毒載體在發育期間不被沉默。對慢病毒載體的大量試驗性研究集中在HIV-1系統，主要是由于HIV因其在人體中的病原性而是被最充分表征的慢病毒這一事實。這種載體往往被設計成無復制能力，通過除去調節和附屬基因而使其不能復制。最先進的這些載體已經被最小化至這樣的程度，即幾乎所有的調節基因和幾乎所有的附屬基因均被除去。慢病毒屬具有許多相似的特征，如相似的基因組組構、相似的復制周期和感染成熟巨噬細胞的能力(Clements&Payne，1994)。一個這樣的慢病毒是馬傳染性貧血病毒(EIAV)。與慢病毒屬其它病毒相比，EIAV具有相對簡單的基因組除了逆轉錄病毒gag、pol和env基因之外，基因組僅由三個調節/附屬基因組成(tat、rev和S2)。安全而有效的慢病毒載體系統的開發將依賴于載體自身的設計。重要的是使載體的病毒成分最小化，而仍保留其轉導載體功能。一個衍生自EIAV的載體系統已經顯示出以相似效率將分化和未分化的細胞轉導至基于HIV的載體(Mitrophanousetal，1999)。可以對致癌逆轉錄病毒和慢病毒載體系統加以修飾以擴大可轉導的細胞類型和物種。這是通過用其它的病毒包膜蛋白取代該病毒的包膜糖蛋白而達到的。這些包括應用兼嗜性MLV包膜糖蛋白(Pageetal，1990)、桿狀病毒GP64包膜糖蛋白(Kumaretal，2003)、腺病毒AD5纖維蛋白(VonSeggemetal，2000)、狂犬病G-包膜糖蛋白(Mazarakisetal，2001)或者水泡性口炎病毒G-蛋白(VSV-G)(Yeeetal，1994)。VSV-G假模標本的應用也導致病毒顆粒的更高的穩定性并使得病毒在較高效價產生。本發明的一個目的是提供一種用以將轉基因構建體轉移至禽類胚胎細胞的有效方法，以產生在其組織尤其但非只在輸卵管內的細胞內表達該基因的轉基因禽類，以使得被翻譯的蛋白質摻入產生的卵中。本發明的另一個目的是提供一種載體和一種方法，用于將基因轉移至禽類胚胎細胞中以產生轉基因禽類，該轉基因禽類已經將轉基因穩定地摻入其部分或全部生殖細胞中，導致轉基因傳遞至轉基因禽類的部分子代中。這種種系傳遞導致建立者禽類的部分子代顯示被改變了的基因型。本發明的再一個目的是提供一種對禽類進行遺傳修飾的有效方法，使得能以高頻率并生產可靠表達轉基因的種系轉基因禽類。本發明提供了一種生產轉基因禽類的方法，該方法包括使用慢病毒載體系統將外源遺傳物質輸送至禽類胚胎細胞或睪丸細胞的步驟。慢病毒載體系統包括一個慢病毒轉基因構建體，其呈能被輸送至禽類胚胎細胞或睪丸細胞的基因組并與之整合的形式。優選地，在發育早期階段，如當僅有少數細胞分裂時的早期分裂階段輸送并整合慢病毒載體系統。在一個實施方案中，慢病毒轉基因構建體被注射入開口的卵的內容物的胚盤下腔中，然后使其發育。可以使用替代卵殼的Perry培養系統。或者可以使用Bosselmann等或Speksnijder和Ivarie所用的卵開窗術。在這些方法中，新產的卵中的胚胎可以通過在卵殼中切開一個窗口而接近，并將慢病毒載體系統注射入胚胎的胚盤下腔中。然后將該卵密封并孵育。在另一個實施方案中，將該構建體直接注射入卵的胚盤下腔中。典型地，所述遺傳物質編碼一種蛋白質。所述遺傳物質可以編碼具有各種用途的大量蛋白質中的任何一種，所述用途包括人體和/或獸醫目的的治療性和診斷性應用，還可包括編碼抗體、抗體片段、抗體衍生物、單鏈抗體片段、融合蛋白、肽、細胞因子、趨化因子、激素、生長因子或任何重組蛋白的序列。本發明因此提供了一種轉基因禽類。優選地，通過本發明的方法產生的轉基因禽類具有被摻入到至少一部分生殖細胞中的遺傳物質，由此遺傳物質將被傳遞至轉基因禽類的至少一部分子代中。本發明還提供了慢病毒載體系統在轉基因禽類的生產中的應用。已經令人驚奇地觀察到應用本發明所述的慢病毒轉基因構建體可以以出人意料的高效轉導禽類胚胎的生殖細胞。所得禽類隨后將整合的載體傳遞至大部分子代中，且載體所攜帶的轉基因可以在相對高的水平被表達。本發明因此進一步提供了轉基因禽類。根據本發明還提供了一種在禽類中生產異源蛋白質的方法，該方法包括將慢病毒載體構建體內編碼蛋白質的遺傳物質輸送至禽類胚胎細胞的步驟，以產生在其組織內表達該遺傳物質的轉基因禽類。優選地，所述轉基因禽類在輸卵管內表達該基因，以使得所翻譯的蛋白質摻入卵中。然后該蛋白質可以通過已知方法從卵中分離。本發明提供了慢病毒構建體在轉基因禽類生產中的應用。本發明還提供了慢病毒載體構建體在轉基因禽類中生產蛋白質的應用。優選地，該慢病毒載體構建體被用于在特定的組織中，優選在卵清或卵黃中表達異源蛋白質。這個應用中使用的慢病毒可以是任何慢病毒載體，但優選選自由以下所組成的組EIAV、HIV、SIV、BIV和FIV。特別優選的載體是EIAV。任何可商購的慢病毒載體均可適于用作輸送外源遺傳物質的構建體的基礎。優選地，所述構建體包括用于后續的蛋白質生產的合適的增強子啟動子元件。一種特異性啟動子可以與一種慢病毒載體構建體一起使用，導致DNA編碼序列的組織特異性表達。這樣的啟動子可以包括如CMV、pCAGGS或者基于通常在禽卵中表達的蛋白質的任何啟動子，所述蛋白質如卵清蛋白、溶菌酶、卵清蛋白樣基因、卵類粘蛋白、卵抑制素(ovostatin)、核黃素結合蛋白或抗生物素蛋白。優選地，使用可商購的包裝系統包裝載體構建體顆粒，以產生具有包膜、典型地具有VSV-G包膜的載體。典型地，所述載體可基于得自ATCC登記號為VR-778的EIAV或者其它可商購的載體。用于本發明的方法中的基于慢病毒的商用載體能感染廣泛的物種而不產生任何活病毒也不引起細胞或組織毒性。本發明的方法可用于產生任何轉基因禽類，包括但不限于雞、火雞、鴨、鵪鶉、鵝、鴕鳥、野雞、孔雀、珍珠雞、鴿子、天鵝、矮腳雞和企鵝。這些基于慢病毒的載體也具有巨大的轉基因能力，可以攜帶較大的蛋白質編碼構建體，如抗體編碼構建體。一種優選的慢病毒載體系統是OxfordBioMedica的LentiVector系統。本發明還進一步提供了一種測定蛋白質在體內表達的可能性的方法，該方法包括在體外測定所述蛋白質在禽類輸卵管細胞中表達的步驟。因此，本發明提供了禽類細胞在體外確定體內表達的可能性的用途。本發明通過參考以下非限制性實施例及附圖舉例說明。圖1是本研究中所使用的EIAV載體的示意圖。圖2圖解的是來自各個禽類的基因組DNA的Southern轉移分析以鑒別前病毒插入。圖3圖解的是在pONY8.0cZ和pONY8.0GG1轉基因禽類中報道基因的表達。圖4圖解的是在pONY8.4GCZG1轉基因禽類中報道基因的表達。圖5圖解的是在G2轉基因禽類中報道基因的表達。圖6圖解的是pONY8.4GCZG1禽類的Western分析。圖7圖解的是在pONY8.0cZG2禽類中報道基因的表達。圖8圖解的是在轉基因禽類的輸卵管中lacZ的表達。實施例1獲得新產的能孵育的母雞卵，其含有處于發育階段X-XIII的發育中的雞胚胎(Eyal-Giladi&Kochav，1976)。將卵打開，將內容物移至一個盤中，并將2-3μL的慢病毒載體病毒顆粒的懸浮液注射入胚盤下腔，注射處為在發育中胚的下方但在黃色卵黃的上方。所使用的載體衍生自馬感染性貧血病毒(EIAV)并攜帶有一個處于CMV(巨細胞病毒)增強子/啟動子控制下的報道基因β-半乳糖苷酶(lacZ)。用于產生載體病毒顆粒的包裝系統導致產生具有VSV-G包膜的載體。估計病毒轉導顆粒的濃度在5×107-1×109/ml之間。通過使用第二和第三相的Perry培養系統(Perry，1988)培養使胚胎發育。取出12個胚胎并分析孵育2天后及3天后的12個胚胎中lacZ的表達情況。將胚胎及其周圍的膜與卵黃切離，固定并染色以檢測lacZ報道基因的表達。所有胚胎均顯示出lacZ在胚及其周圍的膜的一些細胞中表達。表達在接近胚胎的發育中的胚外膜中最高，并被限于分析的胚胎中的少數細胞。這些結果表明所有胚胎均已經通過注射的慢病毒載體而被成功地轉導。實施例2在另一個實驗中，將40個所產卵的每一個均用2-3μL的EIAV載體的懸浮液以5×108/ml的效價注射入胚盤下腔中。孵化出13只雞(33％)，對其進行篩選以鑒別攜帶慢病毒載體序列的轉基因子代。在孵化后從各個雞中回收殘存的胚外膜的樣品，提取基因組DNA并使用特異于慢病毒載體序列的引物通過PCR分析該DNA。這一篩選鑒別到11只轉基因雞(85％)。載體序列在胚外膜中被檢測，拷貝數為0.4％-31％之間，這表明所述雞整合了載體的嵌合體。這個結果是在胚胎由至少60,000個細胞組成的階段用載體注射胚胎進行預測的。不太可能的是胚胎中的所有細胞都將被病毒載體轉導，由此產生對于載體整合為嵌合型的雞。這11只雞被飼喂至性成熟，發現有7只是雄性的。當公雞達到16-20周齡時從中獲得精液樣品。將取自這些樣品的DNA通過PCR進行篩選，發現7只公雞在其精液中具有慢病毒載體序列，估計水平為0.1％-80％之間。大多數樣品含有水平高于10％的載體序列。這提示這些公雞的至少10％的子代將是轉基因的。從一只公雞中收集精液，編號為LEN5-20，估計其在來自血液樣品的DNA中病毒載體的拷貝數為6％。來自精液樣品估計拷貝數為80％。精液用于對原種母雞授精，收集受精卵并對其進行孵育。孵育3天后獲得9個胚胎，通過PCR進行篩選以鑒別轉基因胚胎并加以染色以分析lacZ報道基因的表達。9個胚胎中有3個是轉基因的，所有這3個胚胎均表達lacZ，但是是在少數細胞中以極低的水平表達。孵育10天后獲得12個胚胎并如上述進行篩選。其中6個胚胎經鑒別是轉基因的，并且在其中4個胚胎中檢測到lacZ表達。在1個胚胎中的一些組織中高水平表達，而在其它3個胚胎中表達水平較低。這些結果表明公雞LEN5-20的43％的子代是轉基因的。慢病毒載體攜帶的報道基因構建體的表達在各個轉基因雞間不同。很可能各個雞具有在不同的染色體位點整合的載體基因組拷貝，這可以影響轉基因的表達。一些雞也可能攜帶一個以上拷貝的轉基因。在此概述的結果表明一種特異的EIAV衍生的慢病毒載體，具有VSV包膜蛋白的假模標本，可以非常高效地轉導雞胚胎的生殖細胞。然后，所得禽類將整合的載體傳遞至其大部分子代。載體攜帶的轉基因可以被表達以提供相對高水平的功能性蛋白質。載體攜帶的轉基因可以被設計為在特定組織中高水平表達外源蛋白質。利用經修改的上述實施例中的所述方法，慢病毒載體可以被導入不同發育階段的雞中。可以在新產卵內的胚盤胚上方注射病毒懸浮液。通過利用Perry(1988)的培養方法培養或者從輸卵管中獲得卵然后將其通過卵子轉移方法轉移至一個受體母雞中，病毒懸浮液可以被注射進新授精的卵內或者在早期分裂階段直至X階段被注射(Eyal-Giladi&Kochav，1976)。病毒懸浮液可以通過在卵殼上切開一個窗口在新產卵內胚盤胚的上方或下方注射。所述窗口可以被再密封并將該卵孵育至孵化(Bosselmanetal，1989)。病毒懸浮液可以注射進公雞的睪丸中，篩選精液以檢測精原細胞的轉導及隨后的轉基因精子的發育。實施例3材料和方法EIAV載體及病毒原種的制備載體pONY8.0cZ和pONY8.0G先前已有描述(Pfeiferetal，2002)。載體pONY8.4GCZ具有許多修飾，包括gag衍生區域中所有ATG序列均改變為ATTG，使得eGFP在5′LTR的下游表達。3′U3區域已經被修飾為包括莫洛尼白血病毒U3區域。載體原液通過用2μg載體質粒、2μg的gag/pol質粒(pONY3.1)和1μg的VSV-G質粒(pRV67)經FuGENE6(Roche，Lewes，U.K.)轉染鋪板于10cm平皿上的HEK293T細胞而產生(Loisetal，2002)。轉染36-48小時后，過濾(0.22μm)上清并在-70℃貯存。濃縮的載體制品通過最初在4℃以6,000×g低速離心16小時，隨后在4℃以50,500×g超速離心90分鐘而制成。將病毒重懸于配制緩沖液(Loisetal，2002)中2-4小時，分成等份并在-80℃貯存。轉基因禽類的產生和分析將大約1-2μl的病毒懸浮液顯微注射入新產卵的胚盤胚之下的胚盤下腔中。使用來自體內(exvivo)培養系統的替代卵殼(Challita&Kohn，1994)的II和III相將胚孵育至孵化。使用Puregene基因組DNA純化試劑盒(Flowgen，Asbyde1aZouche，U.K.)，從發育12天或在之后的培養中死亡的胚胎的CAM中提取DNA。基因組DNA樣品得自孵化雞的CAM，血液樣品得自較大年齡的禽類，精液得自成熟公雞。對50ng的DNA樣品進行PCR分析以確定前病毒序列的存在。為估計拷貝數，如前所述對50ng雞基因組DNA等分進行平行對照PCR反應，以相當于單拷貝基因(1×)、10倍稀釋(0.1×)和100倍稀釋(0.01×)的量加入載體質粒DNA(Perry，1988)。所用的引物是5′CGAGATCCTACAGTTGGCGCCCGAACAG3′5′ACCAGTAGTTAATTTCTGAGACCCTTGTA-3′。各個G1禽類中前病毒插入的數目通過Southern轉移進行分析。用XbaI或BamHI消化從全血中提取的基因組DNA。消化的DNA在0.6％(w/v)瓊脂糖凝膠上進行分離，然后轉移至尼龍膜上(Hybond-N，AmershamPharmaciaBiotech，AmershamU.K.)。在65℃將膜與32P標記的報道基因lacZ或eGFP的探針雜交。通過放射自顯影術檢測雜交。所有實驗、動物飼養及護養程序均在U.K.HomeOffice許可下進行。表達分析分離成熟組織并在溶于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的4％多聚甲醛、0.25％戊二醛中固定30分鐘。將組織低溫包埋并切成14μm切片。β-半乳糖苷酶活性通過在37℃在5mM高鐵氰化鉀、5mM亞鐵氰化鉀、2mMMgCl2、0.5mg/mlX-gal中保溫90分鐘(切片)或4小時(胚胎)進行檢測。孵出的小雞的GFP顯影使用Fujifilm數碼相機(Nikon60mm透鏡)捕獲，通過GFsP-S透鏡系統拍攝(BLS，Ltd，CzechRepublic)。將選擇的組織速凍并通過在含有蛋白酶抑制劑(completemini，Roche，Lewes，U.K.)的PBS中均質化以提取總蛋白質。蛋白質濃度通過Bradford分析確定。將50μg(圖4)或100μg(圖3)的蛋白質提取物在12％的聚丙烯酰胺凝膠(Invitrogen，Paisley，U.K.)上分離并轉移至PDVF膜。將膜與1∶5000稀釋的小鼠抗β-半乳糖苷酶抗體(Promega，Southampton，U.K.)和1∶2000稀釋的驢抗小鼠IgG-HRP抗體(SantaCruzBiotech)一起保溫，并使用ECLwestern印跡檢測系統(AmershamBiosciences，Amersham，U.K.)進行觀測。使用β-galElisa試劑盒(Roche，Lewes，U.K.)進行ELISA。結果詳細圖解圖1本研究中使用EIAV載體的示意圖。亮灰色框代表EIAV包裝信號，pONY8.4GCZ中斜線框表示MLVU3區域。標示了用于Southen印跡分析的限制性位點(XbaI[X]、BstEII[B])。報道基因lacZ被用作探針(圖2)。圖2來自各個禽的基因組DNA的Southern轉移分析，以鑒別前病毒插入。基因組DNA樣品用XbaI(a、c、d)或BstEII(b)消化并與lacZ探針雜交。(a、b)編號1-4的G0代禽的14個G1代后代的分析(表1)表明在G1代禽中有多個前病毒插入。(c)編號2-2/19的G1代禽(泳道1)及其14個G2代后代(泳道2-15)和(d)G1代禽2-2/6(泳道1)及其9個G2代后代(泳道2-10)的分析表明了種系傳遞后前病毒插入的穩定性。圖3pONY8.0cZ和pONY8.0GG1代轉基因禽類中報道基因表達。a對來自均含有單一的獨立的pONY8.0cZ插入的5個成熟G1代禽中提取的肝、心臟、骨骼肌、腦、輸卵管、皮膚、脾、腸、腎、胰腺和骨髓蛋白質進行Western印跡分析。每個泳道加樣100μg蛋白質并如實驗方案中所述檢測β-半乳糖苷酶。b將來自G12-2/19的皮膚、胰腺、和腸的切片染色以檢測β-半乳糖苷酶活性，并與非轉基因的對照組禽進行對比(箭頭表示皮膚的表皮、腸絨毛)。標尺＝0.5mm。c觀測來自單拷貝轉基因或野生型禽的胸肌、胰腺和皮膚切片的GFP熒光的情況(箭頭表示皮膚表皮)。標尺＝0.5mm。圖4報道基因在pONY8.4GCZG1代轉基因禽類中的表達。a將來自單拷貝的G1代禽的組織切片染色以分析β-半乳糖苷酶活性(箭頭表示腸道平滑肌)。標尺＝0.5mm。A組輸卵管切片的較高放大倍率。箭頭表示橫切面切割的管狀腺內的細胞。標尺＝0.05mm。b對pONY8.0cZ和pONY8.4GCZ品系所確定的β-半乳糖苷酶水平。數據點是從三個獨立的實驗中產生的。圖5報道基因在G2代轉基因禽類中的表達。a對從G1代公雞2-2/19和2-2/6及每個禽的兩個G2代后代的腸、皮膚、肝和胰腺中提取的蛋白質進行Western分析。b上面的一組禽ID4-1的5個G1代后代。左側的4只禽是pONY8.0G轉基因禽并表達GFP。右側的一只禽是非轉基因的。下面的一組禽ID4-1/66的5個G2代后代。位于中間的禽是非轉基因的。圖6pONY8.4GCZG1代禽的Western分析。對從均含有單一的獨立的pONY8.4GCZ插入的4個成熟G1代禽中提取的肝、心臟、骨骼肌、腦、輸卵管、皮膚、脾、腸、腎、胰腺和骨髓蛋白質進行Western印跡分析。每個泳道加樣100μg蛋白質，并如實驗方案中所述的那樣檢測β-半乳糖苷酶蛋白質。圖7報道基因在pONY8.0cZG2代轉基因禽中的表達。將來自2-2/19的G2代后代的皮膚、胰腺和腸的切片(箭頭表示上皮，箭頭記號表示羽囊)進行染色以分析β-半乳糖苷酶活性，并與非轉基因對照組禽的切片進行對比。標尺＝0.5mm。G0代轉基因禽的產生使用三種不同的自身失活的EIAV載體(圖1)，用皰疹性口腔炎病毒糖蛋白(VSV-G)制備假模標本。這些載體先前用于在一些體外和體內的一些動物模型系統中轉導多種組織(Pfeiferetal，2002；Rholletal，2002；Corcoranetal，2002；Azzouzetal，2002)。pONY8.4載體是從pONY8.0中通過取代5′LTR中的莫洛尼鼠類白血病毒(MoMLV)序列及缺失大部分病毒env基因進行修飾的。將載體制劑濃縮以提供大約107-1010轉導單位/毫升(T.U./ml)的效價。將1-2ml的濃縮載體注射入新產卵的發育中的胚盤下方的胚盤下腔中，然后培養至孵化。從孵出的G0代雞的尿囊絨膜(CAM)中提取基因組DNA，并通過PCR進行分析以檢測EIAV包裝位點序列。關于存在的基因組DNA的量估計了載體的大約拷貝數，范圍從1個拷貝/個基因組至0.01個拷貝/個基因組(見實驗方案)。所有的雞均飼養至性成熟，并將雄性精液樣品的基因組DNA通過PCR進行相似的篩選。進行了4個實驗。將病毒pONY8.0cZ在實驗3.1中以5×107T.U./ml的效價及在實驗3.2中以5×108T.U./ml效價進行注射。在實驗3.3中，病毒pONY8.4GCZ以7.2×108T.U./ml的濃度進行注射，在實驗3.4中pONY8.0G以9.9×109T.U./ml使用。在這4個實驗中共注射了73個卵，從中孵出20只雞(27％)。對每個實驗孵出的雄性雞和雌性雞進行PCR篩選的結果示于表1。20個G0代禽中有14個含有載體序列，該序列的水平估計為0.5-0.01個拷貝/個基因組。當以相似濃度注射時，載體pONY8.0cZ轉導雞胚胎比載體pONY8.4GCZ更有效，可能是由于病毒cPPT序列的存在，該序列參與病毒DNA基因組的核輸入(Loisetal，2002)。結果還表明轉基因禽可以使用低至5×107T.U./ml的效價產生，但如果使用較高的效價則轉導頻率增加。從G0代雄性中的種系傳遞當這12個G0代雄性禽在16-20周齡達到性成熟時，從中收集精液樣品。對從這些樣品中提取的基因組DNA進行PCR篩選的結果如表1所示。這些結果表明載體序列存在于所有公雞的種系中，甚至當在孵化中進行篩選時已被記錄為是無轉基因的那些公雞。這個結果可以通過將這12只公雞中的10只與原種母雞雜交，并篩選其G1代后代來鑒別轉基因禽而得到證實。所有10只公雞均產生轉基因后代，頻率范圍是4％-45％。種系傳遞的頻率與從精液DNA的PCR分析中推測的結果非常接近，但在每種情況中，均高于從在孵化時所取的CAM樣品中DNA的分析結果。從一些公雞取血液樣品，PCR分析結果與CAMDNA分析的結果嚴密地匹配(數據未顯示)。結果提示種系轉導頻率比體組織的轉導頻率高大約10倍。G1代轉基因禽及傳遞至G2代的分析當胚胎處于由估計60,000個細胞組成時的發育階段，將建立者轉基因禽進行轉導，其中大約50個被認為產生了原始生殖細胞(Bienemannetal，2003；Ginsburg&Eyal-Giladi，1987)。我們推測G1代禽得自各個原始生殖細胞的單獨轉導活動，并且不同的禽具有獨立的前病毒插入，代表單生殖細胞前體的轉導。也可能的是各個細胞具有一個以上的前病毒插入。選擇用pONY8.0cZ轉導的4個G0公雞(實驗3.1和3.2)進一步分析其轉基因后代(表2)。來自各個G1代禽的基因組DNA通過Southern印跡分析。將樣品用XbaI和BstEII單獨消化，XbaI和BstEII是在整合的EIAV前病毒內探針區域外進行切割的限制酶(圖1)，并與探針雜交以鑒別代表在整合位點，前病毒插入與基因組DNA之間連接的限制性片段。這使得可以估計每個G1代禽中前病毒插入數及每個分析的G0代后代中存在的不同插入的數。這個分析的一個實例如圖2a、b所示，結果概括于表2。大多數G1代禽攜帶單一的前病毒插入，但有一些含有多個拷貝，在一個禽中最多檢測到4個拷貝。每個G0代禽的一些后代攜帶相同的前病毒插入，這表明它們衍生自相同的生殖細胞前體。將禽2-2的3個雄性G1代后代(2-2/6、16和19)與原種母雞雜交以分析至G2世代的傳遞頻率。公雞2-2/6和2-2/19具有單一的前病毒插入，轉基因與非轉基因后代比率為14/30(47％)和21/50(42％)，這與預期的孟德爾比率無顯著差異。公雞2-2/16具有兩個前病毒插入，79％(27/34)的G2代后代是轉基因的，反映出兩個插入的獨立傳遞。Southern轉移分析被用于對禽2-2/6和2-2/19及其分別9和14個G2代后代中存在的前病毒插入(圖2c、d)進行比較。在親代和子代中觀測到相同的限制性片段，表明前病毒一旦整合進基因組則是穩定的。G1和G2代轉基因禽中的轉基因表達載體pONY8.0cZ和pONY8.4GCZ攜帶有處于人巨細胞病毒(CMV)立即早期增強子/啟動子(CMVp)控制下的報道基因lacZ，pONY8.0G攜帶也處于CMVp控制下的報道基因eGFP。通過將組織切片染色以檢測β-半乳糖苷酶活性和通過對分離自成熟禽的所選擇的組織提取的蛋白質進行western分析以鑒別β-半乳糖苷酶蛋白而對lacZ的表達進行分析。eGFP的表達使用UV照明分析。從均含有不同的單前病毒插入的7個pONY8.0cZG1代禽的各種組織中提取蛋白質。在每個轉基因禽中的一些組織中檢測到期望的110kDa的蛋白質。在胰腺中表達始終較高，在其它組織包括肝、腸和骨骼肌中的存在的蛋白質水平較低。對這些禽中的5個進行分析，結果示于圖3a。當較長時間曝光western印跡時，在決大多數組織中檢測到β-半乳糖苷酶(數據未顯示)。表達模式在各個禽之間一致，但蛋白質總量不同。將來自成熟pONY8.0cZG1代禽的組織切片染色(圖3b)。在整個胰腺外分泌部及在其它組織如皮膚表皮和小腸絨毛中都觀測到強染色。對來自pONY8.0G禽的組織切片中GFP表達分析檢測到其在胰腺、皮膚和胸肌中的表達(圖3c)，在腸中弱表達(數據未顯示)。這些結果表明用具有相同的EIAV載體但攜帶不同的報道基因的所產生的轉基因禽有相似的表達模式。對攜帶pONY8.4GCZ的不同單前病毒插入的6個G1代禽的組織進行Western分析，檢測到lacZ在4個禽中表達，表達模式與在pONY8.0cZ轉基因禽中所見模式相似(圖6)。然而，組織切片染色揭示了一種比在pONY8.0cZ轉基因禽中觀測到的更廣泛的表達模式。β-半乳糖苷酶活性在腸道平滑肌、表皮下血管及在輸卵管的管狀腺細胞中額外地被檢測到(圖4a)。使用ELISA分析量化攜帶pONY8.0和pONY8.4載體的轉基因禽之間β-半乳糖苷酶的表達水平的差異(圖4b)。在所有分析的組織中，β-半乳糖苷酶在pONY8.4GCZ禽中的水平均高于在pONY8.0cZ禽中的水平。胰提取物中的水平高出大約6倍，在編號3-5/337的禽中的表達水平為30pg/μg組織，或者總蛋白質的3％。為確定轉基因表達在種系傳遞后是否保留，檢測了攜帶載體pONY8.0cZ和pONY8.0G的G2禽中的表達。對來自均具有單前病毒插入的兩個G1代公雞2-2/6和2-2/19及來自每個公雞的兩個G2代后代的組織提取物進行Western分析(圖5a)。在親代和兩個子代中β-半乳糖苷酶蛋白水平非常相似，并且表達模式(主要在胰腺中)也非常相似。對來自一個代G2禽的組織切片進行染色表明表達模式與在親代中觀測到的相似(圖7)。GFP熒光易于在活的攜帶pONY8.0G的G1代雞中檢測到，并且這些禽之一的G2代后代顯示出相似的表達水平(圖5b)。圖8表示攜帶具有報道基因lacZ的載體pONY8.4GCZ的轉基因母雞輸卵管的一系列切片。切片中藍色染色表示lacZ的表達。討論我們已經論證了所測試的慢病毒載體系統是生產種系轉基因禽的一種非常有效的方法。在本發明描述的實驗中，在新產卵內囊胚層階段胚胎的下方直接注射病毒載體顆粒的濃縮懸浮液后，產生了12只公雞。我們從10只建立者公雞開始進行繁育，均產生轉基因子代，頻率為4-45％。甚至在繁殖上所獲得的最低頻率的種系傳遞也用于實際中以從一個建立者公雞中鑒別一些G1代轉基因禽，以建立攜帶不同前病毒插入的獨立品系。這個囊胚層下注射的方法與先前使用的將逆轉錄病毒導入雞中的方法非常相似(Salter&Crittenden，1989；Bosselmanetal，1989；Harveyetal，2002)。高成功率也許是由于許多因素所致，包括慢病毒載體轉導非分化的細胞的能力、先前用于將逆轉錄病毒載體導入鵪鶉中的VSV-G假模標本的應用(Karagencetal，1996)、以及使用了與先前的轉基因研究相比更高的效價。孵化的卵中的雞胚胎是由單層細胞組成的盤，位于卵黃的表面上，細胞開始經過胚胎移動以在胚盤下方形成下胚層(Mizuaraietal，2001)。原始生殖細胞也從胚盤經過胚盤下腔遷移至下方的下胚層上。可能在注射病毒之后緊接的發育階段，原始生殖細胞經過病毒顆粒懸浮液進行遷移，因此與CAM或血液細胞相比具有更高的生殖細胞轉導頻率。我們已經說明了大多數代G1轉基因禽含有一單前病毒插入，但一些禽含有多個插入。這些結果表明易于使用這個載體系統來生產具有單載體-轉基因插入的轉基因禽，并且易于從相同的G0代禽中培育在不同的染色體基因組具有前病毒插入的一些品系。由特定的載體導入的但在雞基因組內的不同位點被整合的轉基因的表達水平很可能不同。從G1至G2的傳遞分析表明使用所述慢病毒載體對于建立攜帶穩定轉基因插入的品系是簡便的。報道基因lacZ的表達在建立者(G0)、G1和代G2禽中被檢測。LacZ的表達由人CMVp(第-726至+78位核苷酸)指導，CMVp通常被描述成是在許多細胞類型中無所不在地起作用的增強子/啟動子。通常是這樣的情況，即如果其在細胞培養轉染實驗中使用，但來自CMVp的轉基因小鼠中的表達在組織之間有差異。特別地，已經報道了CMVp轉基因顯示出主要在轉基因小鼠的胰腺外分泌部中表達(Eyal-Giladi&Kochav，1976)。我們已經表明了lacZ和GFP在胚胎和禽中的表達模式均在胰腺中是主要的，盡管其在大多數組織中表達水平不同。來自第三世代EIAV載體pONY8.4的表達顯著高于來自pONY8.0載體的表達，可能是由于前者中由于env區域中不穩定的元件的去除提高了mRNA穩定性所致。轉基因表達在少數pONY8.4GCZ轉基因禽中未檢測到，可能是由于載體中包含可誘導沉默的MoMLV序列所致(Zhanetal，2000)。在G1代禽中見到的表達模式在種系傳遞至G2后仍保留。這些結果表明來自用慢病毒載體導入的轉基因的轉基因特異性表達在種系傳遞后仍保留，這已經在小鼠和大鼠中被描述(Naldinietal，1996)。可以摻入慢病毒載體中的轉基因的大小受限制，因此一些組織特異性調節序列對于在這些載體中使用而言則太大。所述限制還未闡明，但很可能是直至8kb，因為9kb的EIAV載體已經被成功地制備到(Loisetal，2002)。lacZ在輸卵管中的表達(圖8)表明在攜帶編碼一種蛋白質的整合型慢病毒載體系統的轉基因禽中，合成卵清蛋白的細胞可以表達外源蛋白。本發明所述研究是評價慢病毒載體應用于生產轉基因禽的可能性。我們已經指出我們可以獲得一種非常高頻率的種系轉基因禽，從一個世代穩定地傳遞至下一世代，并可以獲得在種系傳遞后仍被保留的轉基因表達模式。這些結果表明慢病毒載體的應用將克服迄今為止在開發有效的生產轉基因禽的方法中所遇到的許多問題。這種方法在轉基因生產中的應用將使得許多轉基因構建體被測試以確定在合適的組織中以所需要的水平表達的那些構建體。近來，ALV載體已被用于生產轉基因品系，其中證實了生物活性蛋白質在卵清中的低量表達和積聚(Rappetal，2003)。盡管產生的蛋白質的量(每個卵產生幾微克蛋白質)不是在便于商業生產的水平，但對從卵清中純化的蛋白質分析支持了轉基因母雞可用作生物反應器的目的。慢病毒載體的應用可以克服與使用致癌逆轉錄病毒載體進行轉基因摻入和表達相關的問題。該生產轉基因禽的有效方法的開發是特別及時的，因為今年將完成雞基因組序列，并且雞作為分析脊椎動物基因功能的模型的價值正在增加(Mozdziaketal，2003)。實驗4用InvitrogenViraPowerTM系統進行實驗。將雞源化的R24微型抗體(minibody)編碼序列被插入pLenti6/V5質粒中，位于組成型CMV啟動子的緊鄰下游。然后將ViraPowerTM293FT細胞用pLenti6/V5/R24表達構建體和優化的ViraPowerTM包裝混合物共轉染。最后收集包裝的含有病毒的組織培養上清。InvitrogenViraPowerTM系統的一種預期用途是作為高效轉染試劑。epLenti6/V5質粒上殺稻瘟素抗性基因的存在賦予其優先選擇被轉導的群體的能力。這意味著相對低效價的病毒產量是足夠的。然而，對于下述實驗研究，需要更加被濃縮的病毒產量。評價了病毒濃縮的兩種方法。首先，通過CentrikonPlus20自旋柱使用旋轉濃縮。其次，使用標準超速離心方案。被濃縮的包裝的病毒載體的RNA基因組的結構通過Northern印跡和逆轉錄酶-聚合酶鏈反應(RT-PCR)雙重分析。使用一些反向引物，寡dT，隨機六聚體及一個特異于3′LTR的引物進行逆轉錄，以保證病毒基因組的代表性樣品被轉換為cDNA。使用優化為擴增特異性序列的單個PCR反應證實了cDNA樣品中cR24編碼序列的完整性。被包裝的pLenti6/V5/R24病毒載體也正被用于在體外轉導293T細胞。在加入了聚季銨鹽(Polybrene)的標準組織培養基中制備多重pLenti6/V5/R24病毒稀釋液。然后將病毒/培養基/聚季銨鹽混合物加入細胞中。3小時后，補充組織培養基直至再72小時后收獲培養基。然后通過ELISA量化分泌的cR24微型抗體的水平。在收獲培養基之前7-10天，也用殺稻瘟素選擇被轉導的細胞。在此，也通過ELISA量化被分泌的cR24微型抗體的水平。另外，被包裝的pLenti6/V5/R24病毒載體也正被用于在體內轉導雞胚胎，這是通過將該載體注射入處于發育中的胚胎下方但在黃色卵黃上方的胚盤下腔中進行。參考文獻Andersson，R.&Mynahan，R.May2001‘TheProteinProductionChallenge′InVivoTheBusinessandMedicineReport15(5)WindhoverInformationInc.Azzouz，M.etal2002‘Multicistroniclentiviralvector-mediatedstriatalgenetransferofaromaticL-aminoaciddecarboxylase，tyrosine，hydrolaseandGTPcyclohydrolaseIinducessustainedtransgeneexpression，dopamineproductionandfunctionalimprovementinaratmodelofParkinson′sdisease′J.Neurosci.2210302-10312.Bienemann，A.S.etal2003′Long-termreplacementofamutatednon-functionalCNSgenereversalofhypothalamicdiabetesinsipidususinganEIAV-basedlentiviralvectorexpressingargininevasopressin′Mol.Ther.7588-596.BiopharmCostofGoodsAnalysisAComparisonbetweenTransgenicandCellCultureManufacture.November2001.Bosselmann，R.A.，Hsu，R.Y.，Boggs，T.，Hu，S.，Bruszewski，J.，Ou，S.，Kozar，L.，Martin，F.Green，C，andJacobsen，F.1989‘Germlinetransmissionofexogenousgenesinthechicken′Science243(4890)p533-535.Brackett，B.G.，Baranska，W.，Sawicki，W.，Koprowski，H.1971‘Uptakeofheterologousgenomebymammalianspermatozoaanditstransfertoovathroughfertilization′.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.68(2)353-7.Challita，P.M.&Kohn，D.B.1994‘Lackofexpressionfromaretroviralvectoraftertransductionofmurinehaematopoieticstemcellsisassociatedwithmethylationinvivo’Proc.Natl.Acad.Sci.USA.912567-2571.Clements，J.E.andPayne，S.L.1994‘Molecularbasisofthepathobiologyoflentiviruses’VirusResearch32(2)p97-109.Coffin，J.M.，Hughes，S.M.andVarmus，H.E.1997‘Retroviruses’ColdSpringHarborLaboratoryPress.Corcoranetal2002‘Retinoicacidreceptor2andneuriteoutgrowthintheadultmousespinalcordinvitro′J.CellSci.1153779-3786.Curtis，H.&Barnes，N.S.1989′Biology′5thEditionWorthPublishers，Inc.Dove，A.2000‘Milkingthegenomeforprofit′NatureBiotechnology18p1045-1050.Etches，R.J.&Gibbins，A.M.(Eds)2000‘ManipulationoftheAvianGenome′CRCPress.Eyal-Giladi，H.andKochav，S.1976‘Fromcleavagetoprimitivestreakformation.′DevelopmentalBiology49(2)p321-337.Gardner，R.L.1968‘Mousechimerasobtainedbytheinjectionofcellsintotheblastocyst′.Nature220(167)p596-7.Ginsburg，M.&Eyal-Giladi，H.1987‘PrimordialgermcellsoftheyoungchickblastodermoriginatefromthecentralzoneoftheA.pellucidairrespectiveoftheembryo-formingprocess’Development101209-211.Gordon，J.W&Ruddle，F.H.1981‘Integrationandstablegermlinetransmissionofgenesinjectedintomousepronuclei′.Science214(4526)p1244-6.Harvey，A.J.，Speksnijder，G.，Baugh，L.R.，Morr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