專利名稱：使用動物模型預(yù)測藥物不良反應(yīng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及制藥工業(yè)中的目標(biāo)確證的過程。
背景技術(shù)：
由于發(fā)現(xiàn)對人的毒效應(yīng)，制藥工業(yè)在臨床研發(fā)的早期階段會放棄許多化合物。因?yàn)樵趯θ藢?shí)驗(yàn)之前有數(shù)年的動物實(shí)驗(yàn)，這是昂貴的損失。為了減少花費(fèi)，理想的是較早地鑒別出有不良作用的化合物，并在進(jìn)一步的研究中排除它們。另外，如果能較早地鑒別出不良作用，則可以在較早的階段設(shè)計(jì)比較安全的化合物，從而顯著地加快開發(fā)出安全且有效的藥物所需的時(shí)間。識別潛在問題的一個早期階段是在選擇將被新藥物抑制或刺激的分子目標(biāo)期間。該過程稱作“目標(biāo)確證”。
目前的藥物開發(fā)途徑的一個問題是，實(shí)驗(yàn)動物被保持在均一的、仔細(xì)地控制的環(huán)境中。盡管這使得能收集到可再現(xiàn)的且科學(xué)上準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，但它不能精確地模擬人的情形，其中的人處于并發(fā)疾病、心理應(yīng)激、外傷損傷、營養(yǎng)問題和其它的常見生理紊亂中。
在這里，我們提出了一種方法，其中目標(biāo)確證可以使用限定的紊亂在動物中有效地測試，還提出了一種清楚地定義的、可測量的快速分析結(jié)果的方法。
引用的文獻(xiàn)1.Brayton，C.，M.Justice，和C.A.Montgomery.2001.Evaluating mutant miceAnatomic pathology.VeterinaryPathology 381-19.
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4.Griebel，G.，J.Simiand，R.Steinberg，M.Jung，D.Gully，P.Roger，M.Geslin，B.Scatton，J.P.Maffrand，和P.Soubrie.2002.4-(2-氯-4-甲氧基-5-甲基苯基)-N-[(1S)-2-環(huán)丙基-1-(3-氟-4-甲基苯基)乙基]5-甲基-N-(2-丙炔基)-1，3-噻唑-2-胺鹽酸鹽(SSR125543A)，一種有效的且選擇性的促腎上腺皮質(zhì)激素-釋放因子(1)受體拮抗劑.II.Characterization in rodent models ofstress-related disorders.Journal of Pharmacology andExperimental Therapeutics 301333-345.
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9.Wilmut，I.，A.E.Schnieke，J.Mcwhir，A.J.Kind，& K.H.S.Campbell，1997.Viable Offspring Derived From Fetal andAdult Mammalian Cells.Nature，385810-813.
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專利13.美國專利號5,523,222發(fā)明概述本發(fā)明在一方面包含一種通過評估動物模型的反應(yīng)來預(yù)測對針對目標(biāo)基因的藥物的不良反應(yīng)的方法，該方法包括(a)提供遺傳工程的非人哺乳動物，其中所述的哺乳動物表現(xiàn)出目標(biāo)基因的過量表達(dá)或表達(dá)不足；(b)使所述的哺乳動物發(fā)生預(yù)選定的紊亂，在哺乳動物中造成期望的生理應(yīng)激；和(c)此后通過測定哺乳動物的metabonomic profile評價(jià)所述遺傳工程的哺乳動物的反應(yīng)，其中所述的metabonomic profile表明對作用于目標(biāo)的藥物的不良反應(yīng)，與預(yù)選定紊亂有關(guān)。
本發(fā)明還包括一種測定對針對目標(biāo)基因的藥物的不良反應(yīng)的方法，包括(a)對比至少兩組的反應(yīng)，每組是基本上相同的非人的哺乳動物，其中的一組由表現(xiàn)出所述目標(biāo)基因的過量表達(dá)或表達(dá)不足的遺傳工程哺乳動物組成，而其中的另一組表現(xiàn)出所述目標(biāo)基因的基本正常的表達(dá)，也就是說，既非實(shí)質(zhì)上過量表達(dá)也非表達(dá)不足；(b)使所述的哺乳動物發(fā)生實(shí)質(zhì)上相同的預(yù)選定的紊亂，這在所述的哺乳動物中造成期望的生理應(yīng)激；(c)檢測所述的哺乳動物的metabonomic profile，和(d)此后對比所述profile，以評價(jià)與目標(biāo)基因的表達(dá)和預(yù)選定的紊亂相關(guān)的不良反應(yīng)。
除了前面的內(nèi)容以外，本發(fā)明還包括其它方面，即以任何方式比上面具體提到的變體范圍窄的本發(fā)明的所有實(shí)施方案。
發(fā)明詳述提供的前述內(nèi)容用于進(jìn)一步易化理解申請人的發(fā)明，但無意限制申請人的發(fā)明的范圍。
定義術(shù)語“遺傳工程的非人的哺乳動物”(為了方便，在下面有時(shí)稱作“工程動物”)是指除人以外的哺乳動物綱的所有成員，其基因組已經(jīng)通過人為干預(yù)進(jìn)行了改變，以改變特定的預(yù)定基因產(chǎn)物的表達(dá)水平或模式。在本發(fā)明中使用的遺傳工程的非人的哺乳動物包括但不限于農(nóng)場動物(豬、山羊、綿羊、牛、馬、兔子等)、嚙齒類動物(例如大鼠和小鼠)和馴養(yǎng)的寵物(例如貓和狗)。嚙齒類動物有時(shí)是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兂叽缧 ?br>
術(shù)語“遺傳工程的非人的哺乳動物”包括敲除的和轉(zhuǎn)基因的動物，它們改變了特定基因產(chǎn)物的表達(dá)水平。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知遺傳操作哺乳動物以改變基因表達(dá)的方法。還包括非人的哺乳動物，其中已經(jīng)改變了對特定的預(yù)定基因產(chǎn)物在時(shí)間上或空間上的控制，如下面進(jìn)一步描述的。
可以通過多種方式將核酸分子導(dǎo)入胚胎，生成工程動物。例如，可以通過微注射、磷酸鈣介導(dǎo)的沉淀、脂質(zhì)體融合、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染或通過其它方式轉(zhuǎn)化全能性的或多能性的干細(xì)胞。然后可以將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞導(dǎo)入胚胎，并摻入其中形成工程動物。在一種方法中，可以用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染發(fā)育的胚胎，并可以從感染的胚胎形成工程動物。而在另一種方法中，將本發(fā)明的DNA分子注射入胚胎，優(yōu)選地在單細(xì)胞階段，讓其發(fā)育成成熟的工程動物。但是，本發(fā)明不限于這些方法中的任一種，可以使用其它的制備工程動物的方法，例如L.M.Houdebine在Transgenic Animal Generation and use，HarwoodAcademic Press，1997中所述。還可以使用核轉(zhuǎn)移或使用胚胎的或成年的細(xì)胞系進(jìn)行克隆的方法生成工程動物，例如在Campbell等，Nature 38064-66(1996)和Wihnut等，Nature 385810-813(1997)中所述。還可以使用其它的利用DNA的細(xì)胞質(zhì)注射的技術(shù)，如美國專利號5,523,222所述。
術(shù)語對工程動物“測定metabonomic profile”是指測定從動物得到的生物液體中示蹤分子的圖譜，典型地使用高分辨1H核磁共振(NMR)或質(zhì)譜，結(jié)合圖譜識別技術(shù)。該技術(shù)已經(jīng)由Robertson等描述。該技術(shù)所應(yīng)用的生物液體包括但不限于尿、乳汁、血漿和血清。
我們在這里描述了一種方法，其中使工程動物處于一組紊亂中，并通過對尿、血清或血漿的metabonomic profiling分析，定量地評估它們對紊亂的反應(yīng)。
在目標(biāo)確證(藥物開發(fā)的一個早期階段)期間，用工程動物(經(jīng)常是嚙齒類動物)來模擬藥物的作用，并評價(jià)藥物安全性(Brayton，等；Sundberg，等；Ward，等)。例如，敲除的哺乳動物(即其中缺失特定基因的哺乳動物)可以用于預(yù)測能阻止特定基因產(chǎn)物(目標(biāo))的功能的抑制性藥物的作用。也就是說，其中缺失了感興趣的目標(biāo)基因的敲除的哺乳動物是預(yù)測給予藥物來抑制目標(biāo)分子的動物的效果(包括不良副作用)的模型。類似地，過量表達(dá)特定基因的轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動物可以用于預(yù)測激動劑藥物的作用，所述藥物能使特定基因產(chǎn)物的功能增加。另外，可以使制備的工程動物僅僅在特定時(shí)間(時(shí)間上控制)或者在特定器官或組織(空間上控制)表達(dá)不足或過量表達(dá)感興趣的基因(Tymms，等)。將工程動物用于該目的的優(yōu)點(diǎn)是，甚至在合成出有效的化合物或藥物之前就可以檢查和測試它們。
但是，重要的是，這種分析或“表型化”工程動物的常規(guī)方法是在除此以外健康的、未受應(yīng)激的動物中進(jìn)行。從這些實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果可能不能預(yù)測在人類中的安全性，人類經(jīng)常遭受多種疾病和各種應(yīng)激、營養(yǎng)問題和有害的生活方式選擇。
我們提出了兩種方案來從工程動物獲取關(guān)于藥物作用的更好的信息。
1.通過用各種活性劑或條件攻擊工程動物，或使其紊亂，而不是檢查僅僅處于非紊亂狀態(tài)的非人的哺乳動物。例如，低劑量的脂多糖(LPS)(革蘭氏陰性茵的外膜組分)刺激細(xì)菌感染的許多效應(yīng)，包括發(fā)熱和炎癥。通過動物行為攻擊可以引起許多對心理應(yīng)激的生理反應(yīng)，所述的攻擊包括暴露于閃爍的頻閃燈，通過在晚間開燈且在日間關(guān)燈造成亮/暗周期的顛倒，在塑料管中拘束20分鐘，暴露于貓或大鼠的氣味，足部休克10秒鐘(Griebel，等)。通過飼喂丁硫堇磺基肟(buthionine sulfoximine)(一種能抑制谷胱甘肽的化合物)，可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，這是同時(shí)進(jìn)行的藥物治療、某些營養(yǎng)不足或疾病的常見效應(yīng)(Robertson等)。使用對人不致病的且通常在小鼠中僅僅誘發(fā)最小病變的流感病毒的高度減毒株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性的感染，可以測試病毒感染(Warren，等)。
2.一些變化僅僅在對疾病有遺傳傾向性的個體中具有不良作用。例如，個體對氧化應(yīng)激、癲癇發(fā)作和細(xì)菌或病毒疾病的敏感性不同。通過將工程動物與對發(fā)生特定疾病敏感性提高的品系進(jìn)行繁殖，可以測試藥物對具有疾病傾向性的個體的作用。然后，后代會同時(shí)具有原始的遺傳修飾(例如，缺失特定的感興趣基因)和對特定疾病的提高敏感性。揭示這些雜交的非人的哺乳動物中的表型異常可以指示潛在的不良作用。
當(dāng)將一系列實(shí)驗(yàn)擴(kuò)展至對工程動物進(jìn)行時(shí)，非常理想的是加速評價(jià)測試的方式。評價(jià)反應(yīng)的一種快速且全面的方式是通過metabonomics分析。Metabonomics的優(yōu)點(diǎn)是，它能以非特異性的方式同時(shí)檢測生物液體中的一系列分子大小的所有內(nèi)源性化學(xué)物質(zhì)。結(jié)果是定量的，可以在動物中對比，并可以作為全面的圖譜(通過稱作“圖譜識別分析”的方法)而不是通過個別化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行檢查。通過將非人的哺乳動物置于代謝籠中收集尿，其中尿與糞便和灑落的食物分離，并轉(zhuǎn)移到冷卻的收集罐中。或者，可以用血清或血漿進(jìn)行metabonomics分析。使用1H-核磁共振(NMR)譜或質(zhì)譜測試體液。通過圖譜識別分析和基本組分分析，分析光譜(Robertson，等)。metabonomic分析的一個優(yōu)點(diǎn)是，它是沒有偏見的且寬泛的。也就是說，它可以檢測尿、血清或血漿中多種機(jī)體內(nèi)源性化學(xué)物質(zhì)的變化，即使這些化學(xué)物質(zhì)先前不被認(rèn)為是感興趣的。
可以預(yù)見，大多數(shù)工程動物品系的metabonomic圖譜會與野生型不同(Gavaghan，等)。在紊亂分析中，會評估紊亂后的metabonomic圖譜與基礎(chǔ)圖譜之間的區(qū)別?？梢澡b別工程動物品系，認(rèn)為具有下述對紊亂的metabonomic反應(yīng)的動物是異常的它(a)比相應(yīng)的野生型非人的哺乳動物的metabonomic反應(yīng)顯著增加或降低，或(b)與野生型非人的哺乳動物的metabonomic反應(yīng)是不同的方向(見
圖1)。該篩選實(shí)驗(yàn)的目的是，鑒別出對紊亂具有異常反應(yīng)的具有特定基因改變的工程動物。這可以較早地預(yù)測被設(shè)計(jì)用來抑制或刺激特定基因(即改變的基因)生成的靶蛋白的藥物可能在有些人中在通常遇到的生理紊亂情形下是不安全的。也就是說，工程動物會被用于模擬在個體中的效果，所述個體在處于應(yīng)激或紊亂狀態(tài)的同時(shí)接受藥物。
在得到篩選實(shí)驗(yàn)的結(jié)果后，還可以進(jìn)行更詳細(xì)的特定分析物或機(jī)理的實(shí)驗(yàn)，以更好地證實(shí)或理解該結(jié)果。
清楚的是，除了按照在前面的說明書和實(shí)施例中的具體描述以外，本發(fā)明還可以以其它方式實(shí)施。
參考上述教導(dǎo)，可以對本發(fā)明進(jìn)行許多修改和變化，因此它們也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在本文中引用的所有文獻(xiàn)的全部內(nèi)容都在這里引作參考。
權(quán)利要求
1.一種通過評估動物模型的反應(yīng)來預(yù)測對作用于目標(biāo)的藥物的不良反應(yīng)的方法，該方法包括(a)提供遺傳工程的非人哺乳動物，其中所述的哺乳動物表現(xiàn)出目標(biāo)基因的過量表達(dá)或表達(dá)不足；(b)使所述的哺乳動物發(fā)生預(yù)選定的紊亂，在哺乳動物中造成期望的生理應(yīng)激；和(c)此后通過測定哺乳動物的metabonomic profile來評價(jià)所述遺傳工程的哺乳動物的反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述遺傳工程的非人的哺乳動物是嚙齒類動物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的評價(jià)是通過對比遺傳工程的哺乳動物的metabonomic profile與經(jīng)受過相同預(yù)選定紊亂的實(shí)質(zhì)上相同的非工程哺乳動物的metabonomic profile來完成的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的metabonomic profile是使用尿測定的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的metabonomic profile是使用血清測定的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的metabonomic profile是使用血漿測定的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的metabonomic profile是使用乳汁測定的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的預(yù)選定紊亂是低劑量的脂多糖。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的預(yù)選定紊亂是暴露于閃爍的頻閃燈。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的預(yù)選定紊亂是亮暗周期的顛倒。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的預(yù)選定紊亂是拘束。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的預(yù)選定紊亂是氧化應(yīng)激。
13.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述的氧化應(yīng)激包括飼喂丁硫堇磺基肟。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的預(yù)選定紊亂是病毒感染。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的預(yù)選定紊亂是導(dǎo)入遺傳物質(zhì)，其導(dǎo)致發(fā)生特定疾病的敏感性提高。
全文摘要
本發(fā)明一般地涉及制藥工業(yè)中的目標(biāo)確證的過程。公開了一種用于確證分子目標(biāo)的方法。
文檔編號A01K67/027GK1754172SQ200380102043
公開日2006年3月29日 申請日期2003年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月29日
發(fā)明者G·H·坎托, M·杰普特 申請人:法瑪西雅厄普約翰有限責(zé)任公司