專利名稱：抗逆小麥新類型培育方法
技術領域：
本發明涉及一種用基因轉化方法進行抗逆小麥新類型培育的方法。
背景技術：
環境脅迫，如干旱、鹽漬、低溫等是世界上植物生產的重要限制因素。近年來，我國小麥因逆境造成的年均受災面積高達20％～25％。干旱、鹽漬、低溫等逆境因子已成為大幅度提高我國小麥單產及總產水平的主要限制因素之一。
用常規育種方法選育抗鹽、耐旱小麥，由于遺傳資源的匱乏而很難選到所需要的類型；而把鹽生植物的耐鹽性傳遞給小麥的遠緣雜交的方法，又受到遠緣雜交不親和性的限制。
利用植物基因工程技術，克隆、鑒定目的基因，將目的基因轉化到目標植物中并獲得轉基因植株，是培育抗逆小麥的新途徑。但是，小麥的抗鹽、耐旱等抗逆性是由多基因控制的數量性狀，其生理、生化過程是基因相互作用、共同調節的結果。單個抗性基因轉入小麥很難使小麥的抗逆性得到大的改善。
已有人發現，DREB轉錄因子和DRE元件在干旱、高鹽及低溫脅迫信號傳遞中起重要作用，一個DREB轉錄因子可以調控多個與植物干旱、高鹽及低溫耐性有關的功能基因的表達。(劉強，趙南明等.DREB轉錄因子在提高植物抗逆中的作用，科學通報，2000，45(1)11～16；Liu Q，Kasuga M，et al.Two transcription factors，DREB1 and DREB2，with anEREBP/AP2 DNA-binding domain separate two cellular signal transduction pathways indrought-and low-temperature-responsive gene expression in Arabidopsis.Plant Cell，1998，101391～1406)。如有人利用DREB1A基因轉化擬南芥，發現在轉基因擬南芥植物中，DREB1A在正常條件下或在脅迫條件下的超表達，促使多個與脅迫相關基因在正常條件下也能表達，或在脅迫條件下表達進一步增強，從而使植株對干旱、高鹽及低溫的耐性得到全面的顯著增強。(Kasuga M，Liu Q，et al.Improving plant drought，salt，and freezing toleranceby gene transfer of a single stress-inducible transcription factor.Nature Biotechnology，1999，17287～292)。但是利用DREB1A基因導入小麥培育抗逆小麥新類型的工作尚未見報道。
發明內容
本發明的目的是將抗逆轉錄因子DREB1A基因導入小麥，從獲得的轉基因植株中篩選出抗逆性綜合改良的轉基因小麥。
本發明通過基因槍法將克隆自擬南芥的DREB抗逆轉錄因子轉入小麥，經過芽期抗逆性鑒定，篩選出2個兼抗株系TG02-002-1、TG02-001-7，兩個株系都兼具抗鹽和耐旱特性。
具體實施例方式以下實施例中使用下述材料與方法1.試驗用小麥H6756和藁城8901小麥(Triticum aestivum L.)2.質粒中國農業科學院作物育種栽培研究所構建的pAHC25/DREB1A質粒。
3.培養基愈傷組織的誘導培養基為MS+2mg/l 2.4-D高滲培養基為MS+0.2mol/L山梨醇+0.2mol/L甘露醇誘導篩選培養基MS+0.2mg/L 2，4-D+5mg/L Basta分化篩選培養基MS+5mg/L Basta芽苗伸長培養基MS+0.2mg/lNAA+1.5mg/lBA生根培養基1/2MS+0.2mg/L IAA4.PCR反應條件PCR反應體系為10μL，反應條件為94℃預變性5min；94℃變性50s，41℃復性40s，72℃延伸1min，循環35次；72℃延伸5min，4℃保存。
5.350mMolNaCl溶液配制在1/1000天平上稱取NaCl10.227g，放置500ml容量瓶內，加蒸餾水攪拌定容至500ml。
6.相對鹽害率計算 注CK1、CK2和CK3分別為對照的三個重復發芽種子數T1、T2和T3分別為鹽脅迫處理的三個重復發芽種子數7.30％PEG溶液配置稱取30gPEG(聚乙二醇6000)，放置100ml容量瓶內，加蒸餾水攪拌定容至100ml。
8.干旱傷害率干旱傷害率＝(正常發芽種子數-高滲發芽種子數)/正常發芽種子數×100％
實施例1小麥基因槍轉化一.方法1.接種將H6756和藁城8901小麥護穎分化期至雌雄蕊原基分化期的幼穗作為外植體接種于誘導培養基上；2.基因槍轉化接種一周左右在愈傷組織生長旺盛期，用基因槍轟擊幼穗愈傷組織，將克隆自擬南芥的DREB抗逆轉錄因子導入小麥，基因槍轉化方法參照基因槍操作手冊進行；3.恢復培養將愈傷組織轉至誘導培養基上恢復培養；4.愈傷組織抗性篩選將上述愈傷組織轉至誘導篩選和分化篩選培養基上進行Basta抗性篩選；5.芽苗分化將經篩選的愈傷組織轉至芽苗伸長培養基上；6.壯根、移栽再生綠苗轉至生根培養基上壯苗，然后將含有健壯根系的綠苗經0～4℃春化處理，煉苗移栽。
7.轉化株葉片篩選移栽幼苗長至15cm高時，用棉簽沾取100mg/L的Basta溶液涂抹轉化株的葉片，10天后觀察葉片壞死情況。
8.轉化植株的PCR檢測剪取具有除草劑抗性的轉化株的葉片，采用CTAB法提取總DNA[4]。
引物序列上游引物5′-TTTAGTTACCTTATCCAGT-3′；下游引物5′-TGACTCTTTGCTCAC ATT-3′，由博雅公司合成。
二.小麥基因轉化結果1.愈傷組織的抗性篩選用基因槍共轟擊H6756幼穗誘導的胚性愈傷組織932塊，藁城8901幼穗誘導的胚性愈傷組織49塊。轟擊后的愈傷組織恢復培養后轉到誘導篩選培養基上進行第一次誘導篩選，多數愈傷組織能夠正常生長，只有少數愈傷組織變褐死亡。將生長正常的幼穗愈傷組織再轉到誘導篩選培養基上進行第二次篩選，大部分愈傷組織褐化死亡。選擇生長正常的抗性愈傷組織轉至分化篩選培養基上再次篩選后，經過芽苗伸長培養和壯根培養，共獲得了218株轉化植株，其中H6756獲得205株，藁城8901獲得13株。以最初轟擊愈傷組織塊數為基數計算，轉化植株的頻率分別為22.0％和26.5％。
2.轉化株的抗性篩選移栽苗長至15cm高時，用棉簽沾取100mg/L的Basta溶液涂抹轉化株的葉片，H6756的轉化植株中有89株表現抗性，藁城8901在有5株抗性株，頻率分別為9.6％和10.2％。
3.轉基因植株的分子檢測對篩選獲得的94株除草劑抗性植株，分別提取葉片DNA進行PCR檢測。結果H6756有50株擴增出預期的1.0kb左右的特異性條帶，藁城8901有4株擴增出預期的1.0kb左右的特異性條帶，與質粒擴增的條帶大小相同，而非轉化株對照植株中未擴增出相應的條帶。H6756陽性株率為5.36％；藁城8901陽性株率為8.16％，初步表明外源DREB1A基因已存在于轉基因小麥中。
實施例2轉基因小麥株系芽期耐鹽性鑒定一.鑒定方法及判斷標準1.樣品準備每個株系取600粒種子在空氣干燥箱內35℃恒溫加熱干燥3d，冷卻至室溫待測。
2.脅迫培養在長11cm×寬11cm×高3cm培養皿中放置無菌濾紙，將300粒種子設為3次重復，每個重復100粒，腹溝向下，粒與粒之間保持一定距離，均勻放置在培養皿內，在培養皿上帖上標簽，并分別標記為T1、T2和T3。每個培養皿內加入350mMolNaCl溶液10ml，在生化培養箱內20℃恒溫10d。
3.對照培養在長11cm×寬11cm×高3cm培養皿中放置無菌濾紙，將300粒種子設為3次重復，每個重復100粒，腹溝向下，粒與粒之間保持一定距離，均勻放置在培養皿內，在培養皿上帖上標簽，并分別標記為CK1、CK2和CK3，每個培養皿內加入蒸餾水，在生化培養箱內20℃恒溫5d。
4.觀察記載以芽期為鑒定時期，胚芽生長超過種子長度的1/3或胚根超過種子長度的1/2為發芽。培養5d調查對照的發芽情況，統計CK1、CK2和CK3的發芽種子數。培養10d調查處理的發芽情況，統計T1、T2和T3的發芽種子數。
表1 芽期耐鹽性鑒定分級標準
二.實驗結果實施例1中提供的轉基因小麥不同株系芽期鹽脅迫篩選結果如下54個轉基因株系在350mMolNaCl溶液中發芽，篩選出26個耐鹽級別為一級的品系，其中TG02-016-1、TG02-002-1、TG02-001-7、TG02-009-1、TG02-031-4株系耐鹽性表現突出，芽期相對鹽害率小于10％，分別為8.50％、4.86％、4.93％、9.31％和9.72％，特別是TG02-001-2、TG02-001-7株系，耐鹽性很強，相對鹽害率均小于5％，分別為4.86％和4.93％，結果見下表。
表2 5個高耐鹽株系的相對鹽害率
注表中數據為三個重復的平均值結論TG02-016-1、TG02-002-1、TG02-001-7、TG02-009-1、TG02-031-4株系耐鹽性表現突出，特別是TG02-002-1、TG02-001-7株系，耐鹽性很強，相對鹽害率均小于5％。
實施例3小麥芽期抗旱性鑒定一.方法1.樣品準備每個株系取600粒種子在空氣干燥箱內35℃恒溫加熱干燥3d，冷卻至室溫待測。
2.脅迫培養在長11cm×寬11cm×高3cm培養皿中放置無菌濾紙，將300粒種子設為3次重復，每個重復100粒，腹溝向下，粒與粒之間保持一定距離，均勻放置在培養皿內，每個培養皿內加入30％PEG溶液10ml，在生化培養箱內20℃恒溫8d。
3.對照培養在長11cm×寬11cm×高3cm培養皿中放置無菌濾紙，將300粒種子設為3次重復，每個重復100粒，腹溝向下，粒與粒之間保持一定距離，均勻放置在培養皿內，每個培養皿內加入蒸餾水，在生化培養箱內20℃恒溫8d。
4.觀察記載以芽期為鑒定時期，胚芽生長超過種子長度的1/3或胚根超過種子長度的1/2為發芽。培養8d統計對照和處理的發芽情況，測定發芽率及干旱傷害率。
表3 芽期耐旱性鑒定分級標準
二.結果轉基因小麥不同株系芽期PEG脅迫篩選結果如下54個轉基因株系在PEG溶液脅迫下受影響程度不同，其中有17個株系耐旱級別為1級，表現為高抗。特別是TG02-002-1、TG02-001-7、TG02-051-3和TG02-019-5株系發芽率降低程度較小，干旱傷害較輕，干旱傷害率均小于15％，分別是14.75％、14.65％、14.41％和13.33％，結果見下表。
表4 PEG脅迫對轉基因株系芽期的影響
注表中數據為三個重復的平均值結論TG02-002-1、TG02-001-7、TG02-051-3和TG02-019-5株系抗旱性強。
綜合以上芽期抗鹽和耐旱鑒定的結果，篩選出TG02-001-2和TG02-001-7兼抗株系。這兩個株系既有很強的抗鹽性，相對鹽害率均小于5％，分別為4.86％和4.93％；同時干旱傷害又較輕，干旱傷害率均小于15％，分別是14.75％、14.65％是一種新類型的抗逆小麥。
權利要求
1.一種抗逆小麥的培育方法，其特征是將抗逆轉錄因子DREB轉錄因子導入小麥，從獲得的轉基因植株中篩選出抗逆性綜合改良的轉基因小麥。
2.權利要求1所述的抗逆小麥的培育方法，所述抗逆轉錄因子DREB轉錄因子是DREB1A基因。
3.權利要求1所述的抗逆小麥的培育方法，所述抗逆轉錄因子DREB轉錄因子克隆自擬南芥類植物。
4.權利要求1或3所述的抗逆小麥的培育方法，所述抗逆轉錄因子DREB轉錄因子導入方法是通過基因槍法。
5.權利要求1或3所述的抗逆小麥的培育方法，所述從獲得的轉基因植株中篩選出抗逆性綜合改良的轉基因小麥是2個兼抗株系TG02-002-1和TG02-001-7。
6.權利要求1所述的抗逆小麥的培育方法，所述抗逆性是抗鹽和耐旱性質。
全文摘要
本發明涉及一種抗逆小麥的培育方法。將抗逆轉錄因子DREB1A基因導入小麥，從獲得的轉基因植株中篩選出具有抗鹽、耐旱特性的轉基因小麥。
文檔編號A01H1/00GK1618273SQ20031011534
公開日2005年5月25日 申請日期2003年11月20日 優先權日2003年11月20日
發明者劉錄祥, 趙林姝, 梁欣欣, 鄭企成, 王晶, 趙世榮, 郭會君, 陳文華 申請人:中國農業科學院作物育種栽培研究所