專利名稱：牦牛凍精制作方法
技術領域：
本發明涉及動物的凍精制作方法，特別是涉及牦牛凍精的制作方法。
背景技術：
牦牛是我國優秀的牛類品種，而九龍牦牛又是我國最優秀的肉用型牦牛品種，它以體形碩大、產肉性能良好，遺傳性能穩定而馳名中外。但九龍牦牛在混群放牧中容易產生近親繁殖，使其優良基因流失，另外活牛引種成本高，野性帶來的管理困難和利用年限短。近三十年來用冷凍精液進行人工授精已成為家畜繁殖和品種保護的一門先進技術，而牦牛精液的冷凍保存始終是一個空白。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種牦牛凍精制作方法。
本發明的牦牛凍精制作方法的步驟如下1)配制稀釋液；2)稀釋；3)平衡；4)滴凍。
本發明的有益效果是采用本發明制作出來的牦牛冷凍精液，解凍后活率均在0.3-0.5之間，用此精液進行人工授精配懷率高，能有效提高牦牛特別是九龍牦牛質量，擴大九龍牦牛優秀個體數量，加快選育進程，防止九龍牦牛和其它地區牦牛的雜交，并克服活畜引種造成的生態和飼養管理方面的困難。
具體實施例方式
采精制凍用公牛要求特級或一級以上種公牛，按常規方法采集種公牛的精液，并對精液進行常規檢查。包括(一)一般直觀檢查1、色澤正常的精液為乳白色或略帶黃色，凡是淡黃色、褐色或黃綠色均不能使用。
2、氣味正常的精液無味或略呈青草腥味。
3、外形良好的精液用肉眼觀察時，可看到精液有“云霧”或“旋風”式的活動狀
(二)精子活力測定1、取精液滴于載坡片上，加上蓋坡片，置于顯微鏡下在37-38℃檢查精子運動狀況，并估計前進運動的精子占整個視野內精子的百分數。如全部精子呈直線運動為1級，如其中90％的精子呈直線運動，則評為0.9級，依此類推，如牦牛精子密度較大，可稀釋后評定。
2、計算精子活率1)計算一定方格內死精子和非前進運動的精子數。
將蓋玻片推蓋在計數板上，使其互相粘連呈密合狀態，先用低倍鏡找到計算室(方格)，用紅血球稀釋管吸取公牛精液到刻度0.5處，擦去管端附著的精液，而后吸至膨大部，再吸入0.9％NaCL溶液到刻度101處(即將原精液稀釋成200倍)，以拇指和中指緊按兩端，充分擺動混勻。棄掉稀釋管內最初兩滴，然后將管中已稀釋好的精液滴1滴在蓋玻與計算板之間的空隙邊緣，使液體彌散至計算室中，放大200-400倍進行觀察，計算一定方格內死亡、顫動、作圓圈運動的精子數，即死精子和非前進運動的精子數。
2)計算相同方格內精子總數將上述蓋玻片和計數板放于恒溫干燥箱內于100℃加熱2分鐘，使精子全部死亡，計算精子總數。
3)計算精子活率精子活率＝(總精子數-死精子和非前進運動精子數)/總精子數(三)精子密度檢查1、目測取原精液用點滴壓片法檢測精子密度，可粗略分為密、中、稀三級。如在多個視野中看不到精子，可評為“無”或“0”。
2、計算將蓋玻片推蓋在計算室上，使其互相粘連呈密合，先用低倍鏡找到計算室后，以血球稀釋管準確吸取公牛精液至刻度0.5處，用紗布擦去管端附著的精液，然后將此精液吸至膨大部，再吸入3％NaCL溶液至刻度11處，充分搖動，混合均勻，棄掉管內最初幾滴，然后滴1滴稀釋的精液在計算器蓋玻片邊緣，待其自行進入計算室內(滴加精液不能過多或過少，不能使計算室內產生氣泡)，放大200-400倍計數。計算5個中方格內的精子數，四角各查一個，中間再查一個，而后推算1毫升原精內的精子數。
計算公式1毫升精液中精子數＝(X/80)×400×10×1000×稀釋倍數＝X×500000×稀釋倍數其中X為五個中方格(80個小方格)的精子數。400為一個大方格，即1平方毫米內有400個小方格。10為蓋玻片與計數的實際高度(1/10毫米)。1000為一立方毫米。稀釋倍數200倍(以取精液0.5處至101處為稀釋200倍)。100倍(以取精液1.0處至101處為稀釋100倍)。
(四)精子畸形率的測定1、方法以玻璃棒沾1滴精液于潔凈載玻片的一端，另一載玻片以30°角從載玻片的另一端拖向精液，使其邊緣與精液充分接觸后向反方向推去，制成均勻的精液抹片。抹片不宜太厚，精液可預先在載坡片上滴上生理鹽水稀釋。當抹片自然干燥后，以0.5％龍膽紫酒精溶液滴數滴染色3分鐘，也可用紅(藍)墨水染色。再用蒸餾水緩慢沖去染料，待干燥后即可鏡檢。
2、畸形率的計算將抹片置于高倍鏡下(400-600倍)檢查500個精子以上，計算其中畸形精子所占比例。其中畸形精子是指核厚帽、赤道板、頂體損害等不正常精子。
計算公式畸形率＝畸形精子數/精子總數×100％在35-38℃條件下鏡檢精子活力達0.7以上、每毫升精液精子數達8億以上和畸形率為15％以下者可用于冷凍保存。畸形率過高會影響受胎率。
牦牛的凍精制作方法1、配制稀釋液1)稀釋液的幾種配方A、10％或12％蔗糖液75毫升，卵黃20毫升，甘油5毫升。
B、11％或12％乳糖液75毫升，卵黃20毫升，甘油5毫升。
C、2.9％檸檬酸鈉液75毫升，卵黃20毫升，甘油5毫升。
D、7.5％或8.0％葡萄糖液75毫升，卵黃20毫升，甘油5毫升。
以上幾種配方均可加入青毒素1000單位/毫升或(和)鏈毒素1000微克/毫升，加入后效果會更好。
2)配制方法A、準確稱取所需鹽類物質(蔗糖、乳糖、檸檬酸鈉或葡萄糖)。
B、將稱取好的鹽類物質放入量杯中，加入蒸餾水，攪拌促溶形成需要濃度的鹽溶液。
C、將鹽溶液用濾紙或棉球過濾，盛于玻璃瓶中，塞上瓶塞，在瓶塞中央插入一根注射針頭，在瓶外對準液面做一標記，然后進行高壓或蒸煮消毒30分鐘，同時消毒適量蒸餾水備用。
D、將消毒好的溶液和蒸餾水取出，觀察瓶外面的標記，如液面低于標記，將消毒好的蒸餾水加至標記處。
E、消毒好的鹽溶液冷卻至25-30℃時，加入卵黃，并用消毒過的玻棒充分攪拌均勻，然后加入青霉素或(和)鏈霉素和甘油，并充分攪拌。置于2-5℃的條件下保存備用。
其中卵黃的抽取方法是選新鮮雞蛋，用65-75℃的酒精消毒蛋殼，然后打一小孔，排出蛋清，將蛋破殼后把卵黃盛于消毒過的平皿中，最后用消過毒的注射器插入卵黃中心，吸取需要量的卵黃，注入鹽溶液中，并反復抽吸溶液以使粘糊在注射器內的卵黃全部注入鹽溶液中。
2、稀釋稀釋過程應在25-30℃條件下進行，精液和稀釋液必須基本恒溫，然后將稀釋液沿瓶壁緩慢加入，再用經消毒并用稀釋液沖洗后的玻棒輕輕攪拌。稀釋倍數可以是2倍也可以是3倍，以使解凍后前進運動的精子數在1500萬個以上為宜。
3、平衡將稀釋好的精液塞上瓶塞，用少量棉花或3-4層紗布包裹，放入冰箱或廣口瓶內，在0-5℃條件下放置1-5小時，如精液稀釋后過多，可分裝于5-10毫升小瓶內進行平衡。
4、滴凍1)準備所用的玻璃器材均需消毒，凡接觸精液的器具，必須用稀釋液沖洗2-3次，然后置于高溫烘箱中烘干備用。室內其它器具需經紫外線照射消毒5分鐘以上。工作人員應穿好工作服、戴上工作帽、手套、口罩和眼鏡并在紫外線下消毒15分鐘。
2)制作A、將溶氮注入滴凍專用液氮罐中，放入泡沫浮架和銅篩，使其距液氮液面在1.5-2.0厘米為宜。
B、用鑷子按壓銅篩浸入液氮中L-2分鐘。
C、用吸管吸取平衡后的精液均勻地滴在銅網上，每處滴一滴(基本上是每毫升稀釋后的精液滴10滴，制成0.1毫升/滴的顆粒精液)。滴滿之后，靜置3-5分鐘，用鑷子撿起顆粒凍精，然后置于浸過液氮的紗布內，封好結口，迅速放入集精小提桶中浸入液氮罐中保存，或直接放入小提桶中保存。
在使用上述凍精時，如采用濕解凍法解凍顆粒凍精則應配制解凍液。解凍液可采用上述稀釋液的配方及配制方法。其解凍步驟如下1)取已配制好的解凍液1毫升，置于消毒過并用解凍液沖洗2-3次的小瓶中或小試管中。
2)將試管放入40-42℃的溫水中加溫，使解凍溫度為38-40℃。
3)用鑷子取一粒凍精，迅速放入解凍液中，并輕輕晃動，使其迅速解凍。
上述方法可用于輸精時的解凍和解凍檢查。
實施例1在九龍縣洪壩鄉牧場選擇了3頭種公牛，并對其進行了父母系和后裔調查，體尺、外貌測定，詳見表1。
表1采精用九龍牦牛體尺、體重測定表
單位cm、kg
技術人員經過30多天努力達到了采精目的，精液各項技術指標均達到要求，解凍后活力均在0.3-0.5之間，詳見表2。其中畸形率測定用0.5％剛果紅酒精溶液對精液抹片染色計算。
表2九龍牦牛采精記錄表
將上面采集到的精液按照本發明的方法制作成了冷凍精液顆粒，祥見表3，其中稀釋液采用葡萄糖-卵黃液。
表3九龍牦牛冷凍精液(顆粒)品質檢查
結果表明各項技術指標均達到要求，解凍后活率均在0.3-0.5之間。
實施例2在九龍縣湯古鄉牧場選取3頭種公牛，采精15次，成功10次，符合制作凍精要求的8次，共制作顆粒凍精689粒，詳見表4。其中畸形率的測定用0.5％龍膽紫酒精溶液對精液抹片染色計算。編號1的牦牛年齡為3.5歲，編號2的年齡為8歲，編號3的年齡為5歲。
表4九龍牦牛采精記錄表
用上面采集到的精液按照本發明的共制作顆粒凍精689粒，但由于公路塌方，未能及時補充液氮，損失凍精300余粒，獲得凍精292粒。詳見表5。其中稀釋液采用蔗糖一卵黃液。
表5九龍牦牛冷凍精液(顆粒)品質檢查
實施例3選取康定縣榆林鄉雅嘉梗牧場的3頭種公牛，共采精25頭次，采精成功20次，符合制作凍精要求的17次，共制作顆粒凍精1027粒，其中42粒不符合配種要求，獲得符合配種要求的凍精985粒。
權利要求
1.牦牛凍精制作方法，其特征在于其制作步驟包括1)配制稀釋液；2)稀釋；3)平衡；4)滴凍。
2.按照權利要求1所述的牦牛凍精制作方法，其特征在于所述步驟1)包括1)稱取鹽類物質放入容器中，加入蒸餾水溶解；2)將鹽溶液過濾，盛于玻璃瓶中，塞上瓶塞，在瓶外對準液面做一標記；3)進行高壓或蒸煮消毒30分鐘；4)如液面低于標記，將消毒好的蒸餾水加至標記處；5)冷卻至25-30℃時，加入卵黃和甘油，并攪拌置于2-5℃的條件下。
3.按照權利要求2所述的牦牛凍精制作方法，其特征在于所述鹽類物質為蔗糖、乳糖、檸檬酸鈉或葡萄糖。
4.按照權利要求2所述的牦牛凍精制作方法，其特征在于所述鹽溶液的濃度為12％蔗糖液、12％乳糖液、2.9％檸檬酸鈉液或8.0％葡萄糖液。
5.按照權利要求2所述的牦牛凍精制作方法，其特征在于所述步驟5)在加入甘油的同時也加入青霉素或鏈霉素中的一種或兩種。
6.按照權利要求1所述的牦牛凍精制作方法，其特征在于所述步驟2)為在25-30℃條件下，在精液中加入稀釋液并攪拌。
7.按照權利要求1所述的牦牛凍精制作方法，其特征在于所述步驟3)為將稀釋好的精液塞上瓶塞，用棉花或紗布包裹，放入冰箱或廣口瓶內，在0-5℃條件下放置1-5小時。
8.按照權利要求1所述的牦牛凍精制作方法，其特征在于所述步驟4)包括1)將溶氮注入液氮罐中，并放入泡沫浮架和銅篩；2)用鑷子按壓銅篩浸入液氮中1-2分鐘；3)用吸管吸取平衡后的精液均勻地滴在銅網上，靜置3-5分鐘；4)用鑷子撿起顆粒凍精，置于浸過液氮的紗布內，封好結口，放入集精小提桶中浸入液氮罐中保存，或直接放入小提桶中保存。
全文摘要
本發明提供了一種牦牛凍精制作方法。其步驟為1)配制稀釋液；2)稀釋；3)平衡；4)滴凍。采用本發明制作出來的牦牛冷凍精液，解凍后活率均在0.3－0.5之間，用此精液進行人工授精配懷率高，能有效提高牦牛特別是九龍牦牛質量，擴大九龍牦牛優秀個體數量，加快選育進程，防止九龍牦牛和其它地區牦牛的雜交，并克服活畜引種造成的生態和飼養管理方面的困難。
文檔編號A01K67/00GK1631124SQ200310104108
公開日2005年6月29日 申請日期2003年12月24日 優先權日2003年12月24日
發明者馬緒融, 張洪波, 張永成, 阿農呷, 馬樹榮, 王平, 陳建斌, 毛進斌 申請人:甘孜州家畜改良站