專利名稱:采用人工培養基開展叢枝菌根真菌純培養的分室培養裝置制造方法
【專利摘要】本實用新型涉及一種采用人工培養基開展叢枝菌根真菌純培養的分室培養裝置，該裝置包括帶有上蓋且呈圓形的培養皿。所述培養皿內通過平行的有機玻璃條Ⅰ、有機玻璃條Ⅱ將其分隔成菌絲室、菌根室、營養補充室；所述有機玻璃條Ⅰ、所述有機玻璃條Ⅱ上均粘貼有尼龍網；所述菌絲室、菌根室、營養補充室內均放置固體培養基；所述菌根室內的所述固體培養基上放置Ri？T-DNA轉化胡蘿卜根；所述營養補充室內的所述固體培養基上放置蘸有蔗糖溶液的棉花棒。本實用新型結構簡單、高效，可有效排除宿主植物根系及其它外源微生物對菌絲的干擾。
【專利說明】采用人工培養基開展叢枝菌根真菌純培養的分室培養裝置
【技術領域】
[0001]本實用新型涉及特殊土壤微生物的培養【技術領域】，尤其涉及采用人工培養基開展叢枝菌根真菌純培養的分室培養裝置。
【背景技術】
[0002]叢枝菌根(Arbuscular Mycorrhizae, AM)真菌是陸地生態系統中廣泛分布的一類與植物根系共生的有益微生物。地球上80%以上的陸生高等植物均能與其建立共生關系，形成特定的“菌根”結構。菌根共生體的形成能夠改善宿主植物的營養狀況，促進宿主植物提高對土壤中P、N、K、Zn、Mn、Fe、Cu、Ca等礦質元素的吸收，提高植物的生物量生產，增強宿主植物對非生物脅迫，如干旱、鹽潰、重金屬污染等的耐受能力。AM真菌是植物根際內分布最普遍、生物量最大、作用最顯著的有益真菌類群，對植物生長的促進作用已經得到充分的證明，在生態系統中具有重要的功能，但由于人類的干擾和環境的影響，這些潛在的巨大作用尚沒有充分發揮。
[0003]早在1842年，Nageli在觀察鳶尾時，就首次發現根細胞中具有明顯的泡囊和菌絲結構。其后，Holle (1875)和Mollberg (1884)在蕨類植物和百合科植物的根系中也相繼發現具有類似的泡囊和菌絲。法國微生物學家Dangeard (1896)詳細研究了楊樹根系中的AM真菌，并精確繪制了楊樹根系中AM菌根的泡囊和叢枝特征，以及菌絲中的油滴等形態結構，同時對AM真菌的種類進行了鑒定。但是，由于AM真菌的分離培養技術尚很欠缺，所以長期以來，一直難以對它們進行深入地研究。直到1955年，Gerdemann發明了濕篩-傾析法，人類才能夠從土壤中直接篩選出AM真菌的各種孢子，AM真菌的研究才取得較大的發展。
[0004]AM真菌是一類專性活體營養微生物，雖然可以進行無性繁殖或有性繁殖，但只能依賴與活體宿主植物共生完成其生活史，迄今為止尚不能對其進行人工離體純培養，因此，AM真菌的無菌培養已經成為當前菌根學領域研究的瓶頸，也是開展AM真菌分類鑒定、菌劑生產和應用推廣的一個重要限制因素。
[0005]在自然條件下，AM真菌與植物根系共生生長，相互纏繞在一起，很難區分植物根系和AM真菌菌絲體對礦質營養吸收作用的差異。1973年，Hattingh等首次建立了隔網分室培養系統，廣泛應用于菌根生理、生態功能等方面的研究。該方法為研究菌絲及其菌絲際的生理生化功能提供了一條有效的途徑。我國在AM真菌的培養和擴繁領域，先后有數個專利獲得授權，在專利號為CN1354252A的“以玻璃珠為培養基質的AM真菌的培養”中，主要涉及一種使用特定培養裝置及培養介質的AM真菌的分室培養方法,該方法表明對于產孢能力強的AM真菌地表球囊霉(67OfiMAs在真菌生長室中可以獲得多至20 mg干重的菌體，每盆獲得的孢子數以萬計。但是該培養系統成本高，操作復雜，僅可用于科學研究和小規模接種劑的生產使用，同時由于菌根和分支菌絲均為向地性生長，所以該裝置會限制菌根真菌和分支菌絲的生長，且該裝置為開放式培養系統，易受到其他微生物的污染。在專利號為ZL201420440445.7的“復合式叢枝菌根真菌分室培養裝置”中，主要涉及特殊微生物的培養【技術領域】，將AM真菌的傳統基質培養與無土培養完美結合，提供一種可用于研究AM真菌培養和生理機制的復合式叢枝菌根真菌分室培養裝置。但是該培養系統仍處于一個開放的操作環境，所采用的培養基質必然攜帶其他外源微生物，導致培養出來的AM真菌并非純凈的單一微生物。
[0006]綜上所述，以上專利所設計的培養裝置均存在一個共同的不足之處，即采用粗河沙、土壤、玻璃珠等基質作為主要培養介質，且均采用活體植物作為宿主材料，因此無法獲得純凈的、單一的AM真菌繁殖體(孢子、菌絲等)，進而限制了 AM真菌在分子生物學、遺傳學等領域的研究和發展，以及在實際應用中的擴繁和推廣。
實用新型內容
[0007]本實用新型所要解決的技術問題是提供一種結構簡單、高效的采用人工培養基開展叢枝菌根真菌純培養的分室培養裝置。
[0008]為解決上述問題，本實用新型所述的采用人工培養基開展叢枝菌根真菌純培養的分室培養裝置，其特征在于:該裝置包括帶有上蓋且呈圓形的培養皿；所述培養皿內通過平行的有機玻璃條1、有機玻璃條II將其分隔成菌絲室、菌根室、營養補充室；所述有機玻璃條1、所述有機玻璃條II上均粘貼有尼龍網；所述菌絲室、菌根室、營養補充室內均放置固體培養基；所述菌根室內的所述固體培養基上放置Ri T-DNA轉化胡蘿卜根；所述營養補充室內的所述固體培養基上放置蘸有蔗糖溶液的棉花棒。
[0009]所述培養皿的直徑為12cm。
[0010]所述有機玻璃條I的厚度為0.3cm、長度為12cm、高為0.5cm。
[0011]所述有機玻璃條II的厚度為0.3cm、長度為7cm、高為0.5cm。
[0012]所述尼龍網的孔徑為40 μ m0
[0013]本實用新型與現有技術相比具有以下優點:
[0014]1、由于本實用新型中培養皿內通過平行的有機玻璃條1、有機玻璃條II將其分隔成菌絲室、菌根室、營養補充室，因此，有效隔開了三室中的培養基，防止不同分室的培養基之間進行物質交換。
[0015]2、本實用新型有機玻璃條1、有機玻璃條II上均粘貼有尼龍網，因此，菌絲只有穿過有機玻璃條1、有機玻璃條II上部的40 μ m尼龍網才能進入菌絲室和營養補充室，但植物根系(直徑>50 μ m)不能穿過尼龍網，所以只有菌絲可以穿過尼龍網吸收營養物質(C源、P元素等)并在菌絲室中擴繁。
[0016]3、本實用新型中培養基分室培養系統中使用的宿主材料為Ri T-DNA轉化胡蘿卜根，是基于發根農桿菌ATCC11325的Ri質粒上的T-DNA轉移到胡蘿卜肉質根細胞中后，可以使胡蘿卜根產生正常植株所沒有的冠癭堿，在無激素培養基上形成多分支并旺盛生長的毛狀根，毛狀根具有主根不明顯，側根豐富，負向地性生長特征，其轉化根生長速度快，培養條件簡單，與AM真菌菌絲接種面大，可以大規模培養生產，是菌根研究的理想材料。
[0017]4、本實用新型中培養基分室培養系統中菌根共生培養一個月后，就可以形成大量的營養孢子和成熟孢子，進而完成自身的生活周期。同時，為進一步進行無菌的菌絲體培養提供了大量的接種源。
[0018]5、本實用新型中的營養補充室可以為菌根室中菌絲的生長補充足夠的碳源，而且本實用新型中設有蘸有蔗糖溶液的棉花棒，因此，易于添加和更換，同時可以提供均一的碳源物質，也可以避免外源污染。
[0019]6、本實用新型可以根據菌絲的負向地性人為的調節培養皿位置，誘導菌絲更高效地穿過尼龍網，進入菌絲室快速形成純凈的菌絲和孢子等繁殖體。
[0020]7、本實用新型排除了宿主植物根系及其它外源微生物對菌絲的干擾，在原位可以觀察菌絲的伸長、分枝及產孢過程，也可以觀察到菌絲室中大量的菌絲分枝布滿整個菌絲室，從而形成無菌的菌絲際環境，為進一步研究菌絲的生理生化特性、分子生物學和遺傳機制等提供了可能。
[0021]8、本實用新型將特定培養基和隔網系統相結合，在菌絲室獲得純凈的密集的菌絲面，可以用于研究菌絲的分泌物、菌絲對難溶性磷的利用、菌絲對礦質營養的運輸速度及不同礦質元素對其生長的影響。
[0022]9、本實用新型所使用的材料價格便宜，構造簡單，容器為常規實驗儀器，易于獲得，且可以多次使用，達到節約環保的目的。同時實驗藥品均為常規實驗藥品，可以從市場直接購買。
[0023]10、本實用新型占地空間小，便于大批量培養，也方便統一管理。
【附圖說明】
[0024]下面結合附圖對本實用新型的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0025]圖1為本實用新型的立體結構示意圖。
[0026]圖2為本實用新型的平面結構示意圖。
[0027]圖3為本實用新型的截面結構示意圖。
[0028]圖中:1 一菌絲2—尼龍網3—有機玻璃條I 4一Ri T-DNA轉化胡蘿卜根5—培養皿6—有機玻璃條II 7—棉花棒8—孢子9一固體培養基10—菌絲室11 一菌根室12—營養補充室。
【具體實施方式】
[0029]如圖1~3所示，采用人工培養基開展叢枝菌根真菌純培養的分室培養裝置，該裝置包括帶有上蓋且呈圓形的培養皿5。培養皿5內通過平行的有機玻璃條I 3、有機玻璃條II 6將其分隔成菌絲室10、菌根室11、營養補充室12 ;有機玻璃條I 3、有機玻璃條II 6上均粘貼有尼龍網2 ;菌絲室10、菌根室11、營養補充室12內均放置固體培養基9 ;菌根室11內的固體培養基9上放置Ri T-DNA轉化胡蘿卜根4 ;營養補充室12內的固體培養基9上放置蘸有蔗糖溶液的棉花棒7。
[0030]其中:培養皿5的直徑為12cm。
[0031]有機玻璃條I 3的厚度為0.3cm、長度為12cm、高為0.5cm。
[0032]有機玻璃條II 6的厚度為0.3cm、長度為7cm、高為0.5cm。
[0033]尼龍網2的孔徑為40 μ m。
[0034]應用實例:
[0035]I)基本材料準備
[0036]A)宿主植物為Ri T-DNA轉化胡蘿卜根。其中發根農桿菌采用冠纓堿性菌株ATCC11325，購買自北京市北納創聯生物技術研究院(北京市朝陽區北三環東路，郵編:102228,電話:010-58851390, E-mail:1nfoObnb1.com,網址:http://www.bnb1.com);胡蘿卜肉質根選用‘七寸紅’品種，購買自甘肅省武威市千鄉農業發展有限公司。
[0037]Ri T-DNA轉化胡蘿卜根的獲得方法:將_80°C保存的發根農桿菌ATCCl 1325用平板劃線法在LB固體培養基上劃線，置于28°C的恒溫箱黑暗倒置培養，使其活化；挑取培養2d的單菌落，接種到不加瓊脂的LB液體培養基中，于28°C條件下在搖床上震蕩培養。將田間種植3個月后的胡蘿卜新鮮肉質根洗凈后，先在75%的乙醇中表面消毒lmin，后浸在0.l%HgCl2中消毒15min,最后用無菌水沖洗3次,晾干,橫切成厚約5mm的薄片,浸入培養14h后的菌液中15min，無菌濾紙鋪墊在外植體與發根農桿菌共培養的培養基表面，胡蘿卜根切片置于共培養培養基的濾紙上，25°C培養，培養至第5天，發根農桿菌菌落長滿濾紙后，采用M液體培養基(不加瓊脂)清洗胡蘿卜根切片3~5次，無菌濾紙吸干胡蘿卜根切片表面的液體，移至除菌培養基，反復培養，除去多余的農桿菌，待胡蘿卜根切片及培養基表面沒有發根農桿菌菌落時，將胡蘿卜根切片轉移至M固體培養基中繼代培養，即得到無菌的轉化毛狀根。
[0038]B)培養基配方如下:
[0039]LB 培養基配方(IL) =NaCl lOOOmg，胰蛋白胨 lOOOmg，酵母膏 500mg，瓊脂 1500mg，pH=7.4 ；
[0040]M 固體培養基配方為(1L) =MgSO4.7H20 731mg, KNO3 80mg, KCl 65mg, KH2PO4 4.8mg,Ca (NO3) 2.4H20 288mg, NaFeEDTA 8mg, KI 0.75mg, MnCl2.4H20 6mg, ZnSO4.7H20 2.65mg, H3BO31.5mg, CuSO4.5H20 0.13mg, Na2MoO4.H2O 0.0024mg,甘氨酸 3mg,鹽酸硫胺素 0.lmg,鹽酸批咯醇0.lmg，煙酸0.5mg,肌醇50mg,鹿糖lOOOmg,瓊脂10000 mg, pH 5.5 ;注:以上M固體培養基的配方中添加蔗糖，即為正常培養基。
[0041]M液體培養基:配方中不添加瓊脂，其余元素成分和用量與M固體培養基相同；
[0042]含鹿糖M固體培養基為正常培養基,配方同上；
[0043]不含蔗糖M固體培養基配方中不添加蔗糖，其余元素、成分和用量與M固體培養基相同；
[0044]外植體與發根農桿菌共培養的培養基配方為(IL) =KNO3 190mg, NH4NO3 165mg，KH2PO4 170mg，MgSO4.7H20 37mg, CaCl2.2H20 44mg (以上為大量元素)，Na2-EDTA 3725mg,FeSO4.7H20 2785mg，MnSO4.4H20 2230mg，ZnSO4.7H20 860mg，CoCl2.6H20 2.5mg，H3BO3620mg，KI 83mg，NaMoO4.2H20 25mg，CuSO4.5H20 2.5mg，肌醇 100mg，維生素 B1 10mg，維生素B6Img,煙酸lmg,乙酰丁香酮0.02mg ；
[0045]除菌培養基:即除去胡蘿卜根切片表面多余的發根農桿菌，其配方為外植體與發根農桿菌共培養培養基大量元素的5倍，不添加乙酰丁香酮，其余元素成分和用量不變，另添加抗生素羧芐青霉素鈉250mg，頭孢霉素250mg。
[0046]C)直徑為 12cm,高為 2.5cm 的培養皿；0.3cm 厚、12cm 長、0.5cm 高和 0.3cm 厚、7cm長、0.5cm高的有機玻璃條；40 μ m尼龍網；
[0047]將購買的通過濕篩-傾析法獲得的孢子進行表面消毒，即浸泡在2%的氯胺T和200mg/L鏈霉素溶液中15min，然后用無菌水沖洗3次;M固體培養基預先裝入錐形瓶1/3，在121°C下高壓蒸汽滅菌15 min ;培養容器、有機玻璃條、尼龍網、打孔器均需在121°C下高壓蒸汽滅菌15 min。
[0048])培養系統的建立
[0049]分別將含蔗糖M的固體培養基、不含蔗糖的培養基裝入菌根室11、菌絲室10和營養補充室12。將Ri T-DNA轉化胡蘿卜根4預先培養在M固體培養基9中，然后將表面滅菌后發芽的地表球囊霉單個孢子接種到菌根室11中Ri T-DNA轉化胡蘿卜根4器官旁進行分室培養,讓AM真菌菌絲侵染根形成共生體系并產生孢子。
[0050]A)培養基質:M固體培養基(含蔗糖和不含蔗糖)9 ；
[0051]B)培養裝置:本實用新型(見圖1)。
[0052]C) AM真菌菌種:地表球囊霉(Glomus versiforme),本實施例中采用的AM真菌接種劑購買自北京市農科院植物營養與資源研究所菌根學研究課題組(北京市海淀區板井曙光花園中路9號，郵編:100097，電話:010-51503324，聯系人:王幼珊、張淑彬，E-mail:am5150il26.com)。
[0053]將購買的菌根接種劑通過濕篩-傾析法獲得單一孢子，操作如下:稱取10g樣品，清水浸泡20~30min,使土壤分散；將50 μ m、100 μ m、250 μ m、750 μ m孔徑的土壤篩按孔徑大小依次疊加，最小孔徑篩在最底層，并使篩面適當傾斜；玻璃棒攪拌上述土壤浸泡液，停放3min，后將上層的土壤懸濁液緩緩倒入疊加的篩網中；清水反復沖洗，分別將各篩面上的篩出物輕輕洗入潔凈的單獨培養皿內；鏡檢，用毛細管分別將相同形態特征的孢子，逐個挑選于單獨培養皿中。挑選出的孢子表面均需消毒，即浸泡在2%的氯胺T和200mg/L鏈霉素溶液中15min，然后用無菌水沖洗3次；M培養基預先裝入錐形瓶的1/3，在121°C條件下高壓蒸汽滅菌15min ;培養容器、有機玻璃條、尼龍網均需在121°C條件下高壓蒸汽滅菌15min。
[0054])培養過程
[0055]預先將滅菌后的培養裝置、打孔器放置在超凈工作臺(SW-CJ-1BU，蘇州凈化設備有限公司)上，打開殺菌開關，用紫外線滅菌燈殺菌消毒30min-60min，后關閉殺菌開關，啟動風機，用蘸有75%酒精的棉花擦洗臺面及手，揮發干后點燃酒精燈，在酒精燈旁，將1mlM培養基緩緩倒入菌根室11，營養補充室12中倒入5 ml不含蔗糖的M培養基，同時在菌絲室10中也緩緩倒入15 ml不含蔗糖的M培養基，目的是保證三室內培養基的厚度達到一致(0.5cm)，且與有機玻璃條的高度持平，以便于菌絲進入菌絲室10和營養補充室12。輕輕地將加入培養基的培養皿5靜置于超凈工作臺，待完全凝固后，截取預先在M培養基上培養的Ri T-DNA轉化胡蘿卜根4的根尖5~8 cm長置于菌根室11中，接種已經表面消毒的地表球囊霉孢子于Ri T-DNA轉化胡蘿卜根4旁進行分室培養。
[0056]本實驗采用單孢子接種，接種方法如下:同上無菌操作過程，用經過高壓滅菌的直徑為9 mm的打孔器在菌根室11的Ri T-DNA轉化胡蘿卜根4旁打孔，移走培養基。其后，再用該打孔器以預先培養于M培養基的地表球囊霉孢子為中心打孔，將孢子移入根旁的空白處，因為菌絲具有負向地性，這樣便于培養基中的菌絲由培養基底部延伸到培養基表面生長，并充分吸收培養基中所需營養物質(見圖3)。此外，由于孢子直徑小，每個培養容器中需移進約10~20個孢子。最后，蓋上培養皿I上蓋，并用ParafilnfM封口膜(型號PM-996)對培養皿進行封口，保證無菌培養，將本實用新型放置在28°C的恒溫箱中進行黑暗培養7天，即可觀察到地表球囊霉孢子的萌發。
【權利要求】
1.采用人工培養基開展叢枝菌根真菌純培養的分室培養裝置，其特征在于:該裝置包括帶有上蓋且呈圓形的培養皿(5);所述培養皿(5)內通過平行的有機玻璃條I (3)、有機玻璃條II (6)將其分隔成菌絲室(10)、菌根室(11)、營養補充室(12);所述有機玻璃條I(3)、所述有機玻璃條II (6)上均粘貼有尼龍網(2);所述菌絲室(10)、菌根室(11)、營養補充室(12)內均放置固體培養基(9);所述菌根室(11)內的所述固體培養基(9)上放置RiT-DNA轉化胡蘿卜根(4);所述營養補充室(12)內的所述固體培養基(9)上放置蘸有蔗糖溶液的棉花棒(7)。2.如權利要求1所述的采用人工培養基開展叢枝菌根真菌純培養的分室培養裝置，其特征在于:所述培養皿(5)的直徑為12cm。3.如權利要求1所述的采用人工培養基開展叢枝菌根真菌純培養的分室培養裝置，其特征在于:所述有機玻璃條1(3)的厚度為0.3cm、長度為12cm、高為0.5cm。4.如權利要求1所述的采用人工培養基開展叢枝菌根真菌純培養的分室培養裝置，其特征在于:所述有機玻璃條II (6)的厚度為0.3cm、長度為7cm、高為0.5cm。5.如權利要求1所述的采用人工培養基開展叢枝菌根真菌純培養的分室培養裝置，其特征在于:所述尼龍網(2)的孔徑為40 μπι。
【文檔編號】C12R1-645GK204291868SQ201420763337
【發明者】王強, 王曉娟, 王茜, 張亮, 金樑 [申請人]蘭州大學