專利名稱：與花粉發育相關的非編碼RNA的cDNA以及制備雄性不育植物的方法
技術領域：
本發明涉及植物分子育種領域，即利用基因工程手段創造雄性不育的育種技術，具體地說，涉及一種來自于玉米花粉cDNA文庫的新的非編碼RNA的cDNA，它與花粉發育相關。本發明還涉及利用所述cDNA制備雄性不育植物的方法，尤其是制備了顯示典型的花粉敗育的轉基因玉米和煙草。
背景技術：
雜種優勢作為一種提高作物產量，改善作物品質，提高作物抗蟲、抗病、抗逆的手段已被廣泛的應用，并取得令人矚目的成就，以植物雄性不育為基礎的雜種優勢利用已成為許多作物的育種目標，在農業生產上發揮巨大的作用。但自然出現的雄性不育類型很少存在著周期長，不育基因來源單一等問題，而且恢復系的培育和后代的篩選上也存在著一定的不足。而利用基因工程創造雄性不育的策略為雜種優勢的利用克服了上述缺陷，目前采用的方法有以下幾個方面1.利用花粉或花藥特異表達啟動子，驅動核糖核酸酶基因在花粉中特異表達，獲得雄性不育植株Mariani等(1990)利用煙草花藥絨氈層特異啟動子TA29將核糖核酸基因導入煙草，結果核糖核酸酶特異表達能夠選擇性地破壞與花粉發育相關的一些器官或組織，阻斷花粉發育進程，導致植物雄性不育。Paul等(1992)利用擬南芥花藥絨氈層特異性啟動子A9特異表達核糖核酸酶基因同樣獲得了雄性不育煙草植株。
2.利用反義RNA技術獲得雄性不育植株將Chs基因的反義基因與CaMV 35S啟動子花藥特異序列串聯構建嵌合基因，導入矮牽牛，結果抑制了Chs合成，阻礙花粉的正常發育，從而得到了雄性不育的矮牽牛(Seymouret al.1993；Van der Krol et al，19990a，1990b；Hall et al.1993)。
3.通過提早降解胼胝質壁獲得雄性不育植株Hird等(1993)將與抗病性相關的β-1，3葡聚糖酶基因分別與擬南芥花粉發育早期啟動子A9，A3融合，轉化矮牽牛后獲得不同程度的雄性不育植株。
發明內容
本發明目的之一是提供一種新的與花粉發育相關的基因，具體地說提供了一種從玉米花粉中克隆獲得的與花粉發育相關的非編碼RNA的cDNA，稱之為ZM401。
本發明的另一目的是提供一種利用所述基因制備雄性不育植物的新方法。本發明將上述基因轉化植物獲得了顯示典型的花粉敗育的轉基因玉米和煙草。
發明詳述本發明通過差異篩選從玉米花粉cDNA文庫中篩選到一個花粉特異的cDNA片段命名為zm401，它與花粉發育相關，該cDNA的序列無長的閱讀框架，長度1149bp，為雙鏈核酸類型，線性。
本發明構建了含有所述cDNA的玉米表達載體。在一個優選的實施方式中，所述的載體包括一個表達盒，以潮霉素磷酸轉移酶基因作為選擇標記基因，編碼氨基核糖苷4-磷酸轉移酶APH(4)-1。所述的表達盒含有玉米花粉特異啟動子和來自胭脂堿合成酶(nos)基因的轉錄終止區域。所述的表達載體優選的是重組質粒pZM401SH。
本發明還構建了含有所述cDNA的煙草表達載體，在一個優選的實施方式中，所述質粒含有35S啟動子，驅動組成型表達，所述的表達載體優選的是重組質粒pBI401F。
本發明將上述含有所述cDNA的重組表達載體轉化植物，獲得了雄性不育轉基因植物。
在一個優選的實施方式中，將含有所述cDNA的玉米表達載體轉化玉米，獲得了顯示典型的花粉敗育的轉基因玉米。
在另一個優選的實施方式中，將含有所述cDNA的煙草表達載體轉化煙草，獲得了顯示典型的花粉敗育的轉基因煙草。
有益效果本發明利用獲得的來自于玉米花粉cDNA文庫的新的非編碼RNA的cDNA，制備了顯示典型的花粉敗育的轉基因玉米和煙草。因此利用本發明的cDNA可制備更多種類的雄性不育植物，這為利用基因工程手段創造雄性不育的策略為雜種優勢的利用開辟了一條嶄新的途徑。
附圖簡述
圖1表示來自玉米的非編碼RNA的cDNA序列，序列特征無長的閱讀框架，長度1149，類型雙鏈核酸，拓撲線性。
圖2由zm401 cDNA核苷酸序列推導的氨基酸序列分析結果(*表示終止密碼子)，含有多個終止子[Translation possibilities analysis ofZM401cDNA(*indicated termination codons)]。
圖3表示含有玉米非編碼RNA的cDNA構建過程。
圖4pBI401F表達載體(含0.7Kb正向cDNA)的構建方案(Constructionof expression vector pBI401F)表示含有玉米非編碼RNA的cDNA的煙草表達載體構建過程。
圖5R0代轉基因玉米(RS60.ZSg0)的Southern雜交，表型變化及花粉育性和組織學分析。
A)部分轉化玉米的hyg和zm401 Southern雜交結果B)轉基因玉米(RS60、RS62)花藥的表型分析C)轉基因玉米(RS60、ZS90)花粉活力的測定D)轉基因玉米(RS60、ZS90)花粉育性的觀察E)轉基因玉米(RS60、ZS90)花藥橫切—示花粉形態異常F)轉基因玉米(RS60、ZS90)花藥橫切—示花粉發育異常、絨氈層退化延遲G)轉基因玉米(RS60、ZS90)花藥橫切—示花粉囊發育異常左邊未轉化植物中間轉基因植物(RS60)右邊轉基因植物(ZS90)圖6煙草花蕾期形態學分析和雙核雄配子體時期組織分析A)非轉化煙草B)非轉化植株雙核雄配子體期絨氈層退化消失C)轉ZM401正義基因的煙草D)轉ZM401正義基因的煙草在雙核雄配子體時期絨氈層退化延遲R0代轉基因煙草的花蕾期的形態分析和雙核雄配子體時期的組織學分析。
具體實施例方式
下面是實現本發明的具體實施方式
。
實施例1通過差異篩選從玉米花粉cDNA文庫中篩選到一個花粉特異的cDNA片段，命名為zm401，用3′RACE(購自GIBCOBRL公司)和5′RACE(購自GIBCOBRL公司)獲得了全長cDNA。
3’RACE中所用引物
P1(21nt)5’--ATCGGGAGCGAGGAGTGGTGC--3’，NGSP2(22nt)5’--GGTGAAGCGTCAATTTATAGGG--3’，5’RACE中所用引物GSP1(18nt)5’-TAGCCATACTCCGGTGAC-3’.
GSP4(25nt)5’--CTCACCGCCGTAAGCTCAATCTTGC--3’，將5′RACE和3′RACE擴增產物分別克隆到pMD18-T(購自Tatara公司)載體上，測序。用重疊PCR將分布在不同載體上的cDNA片段進行拼接。擴增產物克隆到pMD18-T載體上，測序。得到的cDNA全長為1149bp。含有poly(A)尾部，但無完整的閱讀框架。該序列示于
圖1中，稱之為zm401。
重疊PCR中所用引物ZCF1(24nt)ZCF15′-TTGCGAGCACATGGACGGAGGCGC--3′ZCF2(32nt)5′--TTTTTTTTTTTTTTTTTTGATCACGAACCTTATAATAAAGTTGAAGCTGG--3′實施例2用于玉米中表達zm401的表達載體的構建根據已報道的玉米花粉特異表達zm13啟動子的序列(Hanson DD等人(1989)，Plant Cell 1173-178，1989)設計引物ZM13PF(21nt)5′-CCAACTCAGTCCCGTTCAATC-3′；ZM13PR(21nt)5′-CGCCGGGTGAATGTACGTGTT-3′，以玉米基因組DNA為模板，進行PCR擴增，將得到的片段連接到pUC-T載體(Promega公司)上，得到重組質粒pUCZM13，進行序列測定，得到ZM13啟動子。
表達盒是由玉米花粉特異啟動子和來自胭脂堿合成酶(nos)基因的轉錄終止區域(Depickere等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1561-570)組成，選擇標記基因為潮霉素磷酸轉移酶基因，編碼氨基核糖苷4-磷酸轉移酶APH(4)-1。具體構建過程示于圖3將0.6Kb的ZM13啟動子采用HindIII和KpnI雙酶切從pUCZM13載體上切下來，回收，用HindIII和KpnI從pROK401S載體(其制備見下文)上切下0.8Kb35S啟動子，回收大片段，將zm13啟動子與大片段進行連接，得到重組質粒pZM401S。用HindIII將潮霉素磷酸轉移酶基因2.0Kb從pUChyg(Gritz，Land Davies J.1983)載體上端下來，然后用HindIII單切pZM401S載體，將潮霉素磷酸轉移酶基因與經HindIII單切的pZM401S片段連接得到重組質粒pZM401SH。
pROK401S制備過程質粒pB401用KpnI/Sad雙酶切，將得到的片段即zm401片段插入到質粒Rok219的KpnI/Sad位點，得到重組質粒pROK401S。
pROK219制備過程質粒pBI121(購自Clontech公司)用HindIII/XbaI雙酶切，將得到的片段即35S啟動子插入到質粒pUC19(Messing J.1983)HindIII/XbaI位點，得到質粒pUC35S，將pBI121用Sad/EcoRI雙酶切，將得到的片段插入到質粒pUC35S的Sad/EcoRI位點，得到質粒Rok219。
pB401制備過程zm401 cDNA首先克隆在pGEM-7zf(+)(購自Promega公司)載體的EcoRI位點，確定插入方向后，將該質粒用XbaI/BamHI雙酶切，將得到的片段即zm401插入到質粒pBluscript(購自Promega公司)的XbaI/BamHI位點，得到重組質粒pB401。
實施例3用zm13啟動子/zm401表達載體轉化玉米取滅菌的玉米授粉后10-12天的雌穗，剝取幼胚，放于培養基A上(N6培養基，含2mg/L 2，4-D，0.69g/L L-脯氨酸，100mg/L酪蛋白水解物，2％蔗糖)，27-28℃，黑暗培養，使之脫分化，形成愈傷組織，用于基因槍轉化。基因槍轟擊采用BioRad Biolistic PDS-1000/Helium系統。在基因槍轟擊前4小時，將愈傷切成小塊，轉移到含0.4M甘露醇的培養基A上，將實施例2獲得的重組質粒pZM401SH載體用于轟擊，然后，使愈傷組織在該培養基上繼續培養過夜，然后轉移到培養基A上培養4-6天，轉移至含潮霉素(20mg/L)抗性培養基A上，每周繼代一次，2個月后，轉化至分化培養基上(N6培養基，含5％蔗糖)。
實施例4用于煙草中表達zm401的表達載體的構建利用BamHI和Sad雙酶切pB401，將ZM401cDNA切下并回收純化，農桿菌雙元表達載體pBI121進行同樣酶切處理，將GUS報告基因刪除；zm401 cDNA正向插入到載體pBI121中的35S啟動子下游，在35S啟動子驅動下組成型表達，得到重組質粒pBI401F。該載體構建過程見圖4。
實施例5用35S啟動子/zm401表達載體(pBI401F)轉化煙草pBI401F向農桿菌轉化農桿菌感受態細胞的制備挑取根癌農桿菌LBA4404單菌落于3ml的YEB液體培養基(含鏈霉素Sm 125μg/ml)中，28℃振蕩培養過夜；取過夜培養菌液500μl接種于50ml YEB(Sm 125μg/ml)液體培養基中，28℃振蕩培養至OD600為0.5；5000rpm，離心5min；加10ml 0.15M NaCl懸浮農桿菌細胞，5000rpm，離心5min；1ml預冷的20mM CaCl2懸浮細胞，冰浴，24小時內使用，或分裝成每管200μl，液氮中速凍1分鐘，置-70℃保存備用。
pBI401F向農桿菌感受態細胞的轉化取200μl感受態細胞，加入1μg質粒DNA，液氮中速凍1分鐘，37℃水浴5分鐘，然后加入1ml YEB培養基，28℃慢速振蕩培養4小時；1000rpm離心30sec，棄上清，加入0.1ml YEB培養基重新懸浮細胞，涂布于含有100μg/ml Kan和125μg/ml Sm的YEB平板上，28℃培養約48小時。
pBI401F向煙草的轉化取溫室生長的煙草葉片，流水下沖洗掉表面雜物，再用蒸餾水洗滌；70％的乙醇滅菌30秒后，無菌水沖洗一次；2.5％次氯酸鈉處理8～10分鐘；無菌水沖洗三次；將滅菌的煙草葉片切去邊緣和主要葉脈，切成0.4×0.6cm2大小；切好的外植體在已轉化了pBI401F質粒的農桿菌菌液中浸泡10分鐘；用無菌濾紙吸干植物材料表面的菌液，轉入上鋪一層濾紙的MS基本培養基，28℃暗培養；三天后，將材料轉到含有抗生素的分化培養基(MS+3mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA+Kan 75～100μg/ml+Cb 500μg/ml)中進行培養；待抗性芽生長至2～3cm高時，切下小芽轉入生根培養基中誘導生根(MS基本培養基+Kan 100μg/ml+Carbenicillin(Cb購自欣經科公司)500μg/ml)。
實施例6轉基因玉米和煙草花粉中RNA的檢測RNA的提取及點雜交采用現有技術公知的技術，以32P-標記的zm401作為探針進行雜交，結果參見圖5，6，圖中結果表明外源基因在玉米和煙草花粉中得到正常轉錄，轉基因玉米和煙草出現典型的花粉敗育情況。如花藥退化，花粉形態異常，花粉發育不同步，花粉囊合并不同步，絨氈層退化延遲現象。
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權利要求
1.一種與花粉發育相關的非編碼RNA的cDNA，其序列如下所示1 TTGCGAGCACATGGACGGAGGCGCAAATCCATGCCGGCGGTTACGTGCTACGGTGGTGTT61 GAGCATGCGGACACCCTTACGGATGCAACCCAAACACATTCACGTGCTCAATTCGGCCAG121AGCGCGGTTACCACATAGCTGCTCGCGATAGCGGCGAAACCGGATCACCGGCGTGCCCTT181ACCGGTCTACCTAAGCTGGTCGAGTTTAATCCAGGGATGCGGAATGACTCAGTGACCTAC241TAGGGTTATAGTGCTCACGCAAACTTGGACGGAGACTACCAGGATCGGCCGGTCGTCGCG301AGCTATGTCTGCGGCGGCATTCCCGGACAATAACGCAACGTTCTCTAAGCTATGGTGCAG361TAGTGCTTAATCGGCCGAGACCAAGAGCTTCACTAGCATCAGAGGATGTGGAATCGTAGA421CCCGAGGGATATGAACGGACTTGTGGATGGCTGACCACGGCGCGATGTCTCACGGTGGTG481TTCTTGGCCGATTTGGGGAAAAAAGAAATTCGCGAGCTATGGTGGATAATCGGGAGCGAG541GAGTGGTGCTCTGGGTGCGTAACAAGAAGGCGGAACAGGGTGAGGCGTCAATTTATAGGG601ATTGACCACTGGTGCTACGAATTTGGGCAAGATTGAGCTTACGGCGGTGAGTGGGTGAGT661CACCGGAGTATGGCTACCGTGGTGCACGATTGAGCAAGGTCTCGGGTGGTAACTGGCTAT721CACTCACGACTCATTGTGACGTGGTAACACGGTCGATGGTGTGGCGCGACCGAGGTAAAC781GGCGGCCACCATGGCGACGGTCGCACGGCCACGGCGCCGGGCAAGTGGGTACGACGAGGC841AGACCCAATCCAACCCCCTTCTGATCTTTTCACTCCTGCGGTAATATCCTTCCTGAACCA901AGCACGAATCACAGCGGCCAGCGCGAATCCTCATGCGGAGATTACCGACGGCAAGGTGCA961CTGCATCTACGATCTTCTTCAGACACTGTTCATTTTGAATAGCTCATTTACCAGCCTGAC1021 AGAGCAATTTGAGGAGCTTTGTTCTTCGGTTTTCATGTGACGAACTGCTAATCCGACTAC1081 ATCAAAGTTGTTGCCCTATATACCAGCTTCAACTTTATTATAAGGTTCGTGATCAAAAAA1141 AAAAAAAAA。
2.一種表達載體，含有權利要求1所述基因和一種啟動子。
3.根據權利要求2所述的表達載體，其中所述啟動子是植物花粉特異啟動子。
4.一種制備雄性不育的植物的方法，包括將權利要求2所述的表達載體轉化植物。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于其中所述的植物是雙子葉和單子葉植物。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于其中所述的植物是煙草和玉米。
全文摘要
本發明公開了一種新的與花粉發育相關的非編碼RNA的cDNA，該cDNA是從玉米花粉cDNA文庫中篩選得到。本發明利用轉基因技術將所述基因轉化到植物中制備雄性不育植物如雄性不育的煙草和玉米。本發明為利用基因工程手段創造雄性不育的策略為雜種優勢的利用開辟了一條嶄新的途徑。
文檔編號A01H1/00GK1523108SQ0315663
公開日2004年8月25日 申請日期2003年9月5日 優先權日2003年9月5日
發明者敖光明, 于靜娟, 趙倩, 戴曉燕, 李成霞 申請人:中國農業大學