專利名稱：玉米酪氨酸蛋白磷酸酶基因及其編碼蛋白與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程領域中一種玉米酪氨酸蛋白磷酸酶基因及其編碼蛋白與應用。
背景技術：
干旱缺水是限制我國北方廣大地區農、林、牧業生產的主要因素之一。近年來大量的研究表明，植物具有對干旱脅迫快速感知和主動反應的能力，這種快速感知和主動反應能力的獲得是通過一系列逆境信息傳遞過程實現的。植物可以通過一系列的信息傳遞產生各種抗逆的生理、生化反應，以渡過短暫的干旱的不利環境。脫落酸(abscisic acid，ABA)作為五大類植物激素之一，已被公認為，對提高植物抗逆性起至關重要的作用，人們也通俗地稱之“誘抗素”。ABA不僅可以作為長距離信號，由根部運輸到植物葉片，調控氣孔開關，從而調控植株整體的水分關系，而且ABA還可以作為細胞信號介導眾多基因的表達，以提高植物的抗逆性。ABA之所以能夠作為逆境信號物質其根本基礎在于水分虧缺等環境脅迫可以快速及大量地誘導ABA的積累。水分虧缺誘導ABA積累過程實際上是一個細胞逆境信息傳遞過程，該過程包括細胞對水分虧缺的識別、細胞信號轉導及ABA生物合成關鍵酶基因表達的調控等。水分虧缺誘導ABA積累包含整個細胞逆境信息傳遞系統中最關鍵的信息傳遞鏈，對該信息傳遞鏈的研究不僅有助于揭示水分虧缺原初信號的識別和轉導機制，而且有可能為通過基因工程操縱植物的抗逆性提供直接的手段或策略。
近年來本發明人所在實驗室圍繞水分脅迫誘導ABA積累的細胞逆境信號展開了大量的研究，但是沒有發現人們熟知的信號組分或信號系統，如Ca2+、CaM、IP3和DG、PKC、CDPK、MAPK可以參與水分脅迫誘導ABA積累的細胞信號傳遞；卻發現了水分脅迫誘導的ABA積累可被還原劑及酪氨酸蛋白磷酸酶(PTP)的專一抑制劑阻斷(PlantCell and Environment 2000，231389-1395和科學通報2003，48(4)369-373)。PTK(酪氨酸蛋白激酶)/PTP催化的酪氨酸可逆蛋白磷酸化在動物及酵母細胞的信號傳遞中均起著非常重要的作用，例如PTP可以作為受體識別許多胞外信號，某些胞內PTP可以和激活的生長因子受體反應來調節細胞的生長和分化等。但是長期以來人們一直忽略了對植物酪氨酸蛋白磷酸酶的研究，認為植物細胞中不存在由PTK/PTP催化的酪氨酸蛋白可逆磷酸化系統，直到最近幾年才偶有報道植物細胞中存在PTP，但對其功能還沒有深入的了解。鑒于PTP專一抑制劑和還原劑可阻斷干旱誘導的ABA積累，且在動物細胞中PTK/PTP催化的酪氨酸蛋白可逆磷酸化系統常常受到氧化還原的調控，因此認為對DTT敏感的PTP可能參與了水分虧缺誘導ABA積累的調控。
ABA信號的起源問題即水分虧缺誘導ABA積累的分子機制問題是ABA信號傳遞的核心問題，也是提高植物抗旱性的關鍵問題。
發明創造內容本發明的目的是提供一種參與調控ABA生物合成的玉米酪氨酸蛋白磷酸酶及其編碼基因。
本發明所提供的玉米酪氨酸蛋白磷酸酶編碼基因ZmRSPTP1，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼SEQ ID№2蛋白質序列的核苷酸序列；3)與序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性的DNA序列。
本發明所提供的玉米酪氨酸蛋白磷酸酶ZmRSPTP1，是序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列或將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質。
序列表中的SEQ ID №1由1122個堿基組成。
序列表中SEQ ID №2是由373個氨基酸殘基組成的蛋白質。
含有本發明基因的表達載體及細胞系均屬于本發明的保護范圍。
只要控制酪氨酸蛋白磷酸酶ZmRSPTP1的表達量及其活性，就能操縱ABA在植物體內的積累，從而解決植物的抗旱性問題。本發明的酪氨酸蛋白磷酸酶基因ZmRSPTP1在植物抗旱領域具有廣闊的應用前景，可用于培育抗旱植物特別是抗旱玉米，其經濟效益潛力巨大。
圖1為蛋白純化過程中各蛋白組分的SDS/PAGE電泳2為ZmRSPTP1-His融合蛋白初步純化后的SDS-PAGE電泳3為PAO和DTT對融合蛋白ZmRSPTP1-His酶活性的影響柱狀圖具體實施方式
實施例1、PTP的提取和純化及N-末端序列測定1)玉米胚芽鞘中總蛋白的提取玉米種子(農大4967)浸泡催芽后，播在裝有蛭石和細紗混合物(2∶1)的8cm×30cm×60cm的盤中。28℃黑暗培養5天，當胚芽鞘長度為3cm左右時，取胚芽鞘進行如下各種實驗。
200g胚芽鞘用3倍體積Buffer A(50mM MOPS pH7.4，2μg/ml亮抑制蛋白酶肽，2μg/ml pepatatin A，1mM PMSF，1mM EDTA，10％甘油，0.1％triton x-100)研磨勻漿后，4層紗布過濾，10000×g離心30分鐘，上清液用Sephadex G-25脫鹽，直接用于蛋白純化。
2)用陰、陽離子交換柱及分子篩純化玉米胚芽鞘中對DTT敏感的PTP組分①用陰、陽離子交換柱層析分離PTP組分(i)DEAE-Sepharose柱層析DEAE-Sepharose柱(3.5×20cm)用Buffer B平衡(50mM MOPS pH7.4，2μg/ml亮抑制蛋白酶肽，2μg/ml pepatatin A，1mM PMSF，1mM EDTA，5％甘油)，樣品上柱后，用2000ml Buffer B預洗脫至流出蛋白濃度為零。1500ml 0-0.7M NaCL梯度洗脫，每管收集10ml，以pNPP為底物測定磷酸酶活性，將活性管溶液(DEAE洗脫液)合并。
(ii)SP-Sepharose柱層析上述DEAE洗脫液用Buffer C透析(50mM乙酸鈉緩沖液，pH4.7，1mM PMSF，1mM EDTA，5％甘油)。SP-Sepharose柱(2.6×20cm)用Buffer C平衡，上樣。Buffer C預洗脫至蛋白濃度為零。0-0.6M NaCL梯度洗脫。每管收集5ml，以pNPP為底物測定磷酸酶活性，將活性管溶液(SP洗脫液)合并。檢測各SP洗脫液組分磷酸酶活性對DTT(1mM)的反應，將對DTT敏感的SP洗脫液組分用10KD超濾管濃縮至5ml。
②用分子篩層析純化PTP組分將①中得到的PTP組分進行兩次Sephacryl S-200分子篩層析。Sephacryl S-200(2.6×100cm)用Buffer C平衡，樣品上柱，Buffer C洗脫，每管收集3ml。以pNPP為底物測定磷酸酶活性，將活性管溶液(S-200洗脫液)合并，10KD超濾管濃縮至0.5ml，過第二次分子篩Sephacryl S-200(1×80cm)，Buffer C洗脫，每管收集0.5ml。以pNPP為底物測定磷酸酶活性，將活性管溶液合并。
③PTP組分純度的檢測將步驟②得到的PTP組分按照常規方法用BIO-RAD蛋白小型膠系統進行SDS-PAGE(12％膠)后，用銀染色。結果如圖1所示，A為總蛋白，B為①中得到經DEAE-Sepharose分子篩層析后具有PTP酶活性組分經SDS-PAGE電泳結果；C為①中得到的經SPSepharose分子篩層析后具有DTT敏感的PTP組分經SDS-PAGE電泳結果；D為步驟②中得到的經兩次Sephacryl S200分子篩層析后具有DTT敏感的PTP組分經SDS-PAGE電泳結果。銀染色表明D泳道中的樣品為一條分子量為42kD的蛋白帶，說明蛋白已得到均一的純化。
④對PTP組分進行酶活性檢測總反應體系為50μl，其中含有35μl反應緩沖液(50mM MOPS，pH6.0，1mMEDTA，10％甘油，500μM PMSF)，5μl蛋白磷酸酶底物(2mM通用底物pNPP或1mM PTPase底物END(pY)INASL及磷酸酪氨酸)，10μl蛋白樣品，加DTT使其終濃度為1mM。反應在25℃進行30分鐘，加Pi分析試劑終止反應。釋放的Pi以Malachite-molybdate染料顯色，650nm測定吸收值。蛋白磷酸酶活性以單位時間單位蛋白樣品釋放Pi的量來計算。測得純化后的蛋白磷酸酶活性為1200nmol pi min-1mg-1蛋白。該PTP組分命名為ZmRSPTP1(reducer sensitive PTP1)。
3)N-末端序列測定經上述步驟純化得到的蛋白樣品進行N-末端部分氨基酸測序，使用Edman降解法又稱異硫氰酸苯酯法(簡稱PTH法)進行N-末端序列測定。得到的N-末端序列為MNCLQNLLKEPPIVGS。
實施例2、ZmRSPTP1編碼的cDNA的克隆(1)玉米胚芽鞘總RNA的提取按照Invitrogen公司總RNA提取試劑盒(TRIzol Reagent)(貨號15596-026)的方法進行玉米胚芽鞘總RNA的提取。
(2)玉米胚芽鞘mRNA的分離純化按照Promega公司試劑盒(PolyAtract mRNA Isolation System III(withMagnetic Stand)貨號Z5300)的方法進行玉米胚芽鞘mRNA的分離純化。
(3)反轉錄合成按照Invitrogen公司的SuperScriptTMRNaseH-Reverse Transcriptase產品說明進行反轉錄。
(4)PCR擴增ZmRSPTP1以反轉錄合成的cDNA為模板，根據PTP的N-末端序列測定結果(MNCLQNLLKEPPIVGS)，從N端6個氨基酸及玉米密碼子偏愛性設計8個上游引物如下ATGAACTGCTTGCAG；ATGAACTGCTTCCAG；ATGAACTGCCTCCAG；ATGAACTGCCTGCAG；AACTGCTTGCAGAAC；AACTGCTTCCAGAAC；AACTGCCTCCAGAAC和AACTGCCTGCAGAAC。下游引物為TTTTTTTTTTTTTTTA；TTTTTTTTTTTTTTTG和TTTTTTTTTTTTTTTC。PCR反應體系的組成為5μl 10×Taq buffer，4μl 10×dNTP，1μl 上游引物、1μl下游引物(上下游引物各一個進行不同組合，分開做PCR，共24個PCR反應)，1μl模板(約5ng)，0.5μl Ex-Taq酶，38.5μl H2O。PCR程序為
94℃ 3min 72℃ 5minPCR產物經QIAGEN GEL EXTRACTION KIT(#28704)回收純化，送上海生工測序部測序。測得的ZmRSPTP1的核苷酸序列如序列表中序列1。ZmRSPTP1的氨基酸序列如序列表中序列2。在GenBank中進行蛋白BLAST，結果玉米ZmRSPTP1與擬南芥中的AtPTPKIS1及番茄中的LePTPKIS1有較高同源性，同源性分別達到62％及59％。
實施例3、在酵母細胞中體外表達ZmRSPTP1及活性檢測(1)在酵母細胞中體外表達ZmRSPTP1①PCR擴增ZmRSPTP1編碼基因以Upper和Lower為引物，分別在ZmRSPTP1編碼基因上引入Sma I/Cla I位點，并在3’-端引入6個組氨酸。引物序列如下Upper5’-CTGCCCGGGATGAACTGCCTCCAGAACC-3’；Lower5’-TCAATCGATGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCGCTCGGCGGC-3’。PCR程序為94℃ 3min 72℃ 5min②將回收后的PCR產物用Sma I/Cla I酶切，并回收。
③將酵母表達載體p426GAL1用Sma I/Cla I酶切，并回收。
④將分別酶切并回收后的ZmRSPTP1編碼基因與p426GAL1連接，構建成玉米ZmRSPTP1編碼基因的表達載體p426GAL1-ZmRSPTP1-6His。
⑤按照Gietz，RD.和RH.Schiestl的方法(Gietz，RD.and RH.Schiestl.(1995)Transforming Yeast with DNA.(Invited chapter)Methods in Molecular andCellular Biology.Vol 5，#5；255-269)轉化酵母。
結果如圖2所示，在酵母表達的融合蛋白，通過Invitrogen公司的ProBondTMPurification System初步純化，得到42kD的蛋白帶(圖2箭頭所示)，表明含有6×His標簽的重組蛋白不僅在酵母中表達了，而且得到了純化。圖2中，A，B為初步純化的ZmRSPTP1-His融合蛋白；M為標準分子量。另外通過常規免疫印跡也檢測到ZmRSPTP1-DHA(Double Hemagglutinin)融合蛋白在酵母細胞中的表達。其中，檢測DHA的一抗用Roche公司高親和力的單克隆抗體3f10(#1867423)。
(2)ZmRSPTP1的活性檢測按照實施例1中2)的④的方法對初步純化的融合蛋白ZmRSPTP1-His進行PTP酶活性檢測。結果如圖3所示，表明得到很高酶活性(780nmol Pi mg-1protein min-1)的酪氨酸蛋白磷酸酶，而且酶活可被還原劑1mM DTT(dithiothreitol)抑制至少75％，被PTP專一抑制劑PAO(phenylarsine oxide)100μM抑制至少50％以上。圖3中，C為對照；PAO為100μM PAO藥劑處理；DTT為1mM DTT藥劑處理。體外表達的ZmRSPTP1-His融合蛋白的酶特性與從玉米胚芽鞘中純化到的還原劑敏感的PTP 42kDa蛋白特性完全一致。
序列表<210>2<211>1122<212>DNA<213>玉米屬玉米(Zea mays L.)<400>1atgaactgcc tccagaacct gctcaaggag cctccaatcg tggggtccag gtcgatgagg60cggccctctc cgctgaatct ggcgatggtc cgcggcggca gtcgccgatc aaacaccgtc120aaaactttgc aggcccctgg ggcgtccact tccggtgccg agagcagcgc cgtggagatg180ggcaccgaga agtccgaagt gtacagcact aacatgacgc aggctatggg agcagcgttg240acatatagac atgaactcgg gatgaactac aatttcatac gcccagactt gattgtagga300tcctgcttac agagtccact tgatgttgat aagcttcgga agattggtgt caaaactgta360ttctgcttgc agcaagattc agatcttgaa tattttggag tcgacatccg tgccattcaa420gattattctc tacaattcaa agatattgtg cactgccgtg cggaaattag ggattttgat480gcttttgatt tgcgattgag gcttcctgct gtggttagca aattgcacaa acttatcaac540tgtaatggtg gtgtaacata tatacattgt actgctggac ttggaagagc tcctgctgtt600gcattggctt atatgttctg gattcttggg tacagtctca atgaaggaca tcggctgcta660cagagtaaaa gggcttgctt tccgaagttg gaagccatta agttggcaac tgctgacatt720ctgacaggat tatccaaaaa cacaatcact ttgaagtggg aagctgatgg ttcttcctct780gttgaaattt ctgggctcga cattggctgg ggtcagagaa ttcctttgac atatgatgag840gagaaaggag cttggtttct tgagaaagag ttgcctgaag gacggtatga atacaaatac900gtagtggatg gcaaatggct atgcaacgag catgagctga taacgaaacc gaatgctgac960ggccacgtga acaactatgt tcaggtctcc agagacggca cgagcgatga agagaaggag1020cttagggagc ggttgactgg tcgggaccct gatctcacgg accaggagag gctgatgatc1080agagagtact tggaacagta cgcggatgcc gccgagcgct ag 1122<210>2<211>373<212>PRT<213>玉米屬玉米(Zea mays L.)
<400>2Met Asn Cys Leu Gln Asn Leu Leu Lys Glu Pro Pro Ile Val Gly Ser15 10 15Arg Ser Met Arg Arg Pro Ser Pro Leu Asn Leu Ala Met Val Arg Gly20 25 30Gly Ser Arg Arg Ser Asn Thr Val Lys Thr Leu Gln Ala Pro Gly Ala35 40 45Ser Thr Ser Gly Ala Glu Ser Ser Ala Val Glu Met Gly Thr Glu Lys50 55 60Ser Glu Val Tyr Ser Thr Asn Met Thr Gln Ala Met Gly Ala Ala Leu65 70 75 80Thr Tyr Arg His Glu Leu Gly Met Asn Tyr Asn Phe Ile Arg Pro Asp85 90 95Leu Ile Val Gly Ser Cys Leu Gln Ser Pro Leu Asp Val Asp Lys Leu100 105 110Arg Lys Ile Gly Val Lys Thr Val Phe Cys Leu Gln Gln Asp Ser Asp115 120 125Leu Glu Tyr Phe Gly Val Asp Ile Arg Ala Ile Gln Asp Tyr Ser Leu130 135 140Gln Phe Lys Asp Ile Val His Cys Arg Ala Glu Ile Arg Asp Phe Asp145 150 155 160Ala Phe Asp Leu Arg Leu Arg Leu Pro Ala Val Val Ser Lys Leu His165 170 175Lys Leu Ile Asn Cys Asn Gly Gly Val Thr Tyr Ile His Cys Thr Ala180 185 190Gly Leu Gly Arg Ala Pro Ala Val Ala Leu Ala Tyr Met Phe Trp Ile195 200 205Leu Gly Tyr Ser Leu Asn Glu Gly His Arg Leu Leu Gln Ser Lys Arg210 215 220Ala Cys Phe Pro Lys Leu Glu Ala Ile Lys Leu Ala Thr Ala Asp Ile225 230 235 240
Leu Thr Gly Leu Ser Lys Asn Thr Ile Thr Leu Lys Trp Glu Ala Asp245 250 255Gly Ser Ser Ser Val Glu Ile Ser Gly Leu Asp Ile Gly Trp Gly Gln260 265 270Arg Ile Pro Leu Thr Tyr Asp Glu Glu Lys Gly Ala Trp Phe Leu Glu275 280 285Lys Glu Leu Pro Glu Gly Arg Tyr Glu Tyr Lys Tyr Val Val Asp Gly290 295 300Lys Trp Leu Cys Asn Glu His Glu Leu Ile Thr Lys Pro Asn Ala Asp305 310 315 320Gly His Val Asn Asn Tyr Val Gln Val Ser Arg Asp Gly Thr Ser Asp325 330 335Glu Glu Lys Glu Leu Arg Glu Arg Leu Thr Gly Arg Asp Pro Asp Leu340 345 350Thr Asp Gln Glu Arg Leu Met Ile Arg Glu Tyr Leu Glu Gln Tyr Ala355 360 365Asp Ala Ala Glu Arg370
權利要求
1.玉米酪氨酸蛋白磷酸酶編碼基因ZmRSPTP1，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼SEQ ID №2蛋白質序列的核苷酸序列；3)與序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性的DNA序列。
2.根據權利要求1所述的基因，其特征在于所述ZmRSPTP1是序列表中的SEQ ID№1。
3.玉米酪氨酸蛋白磷酸酶ZmRSPTP1，是序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列或將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質。
4.根據權利要求3所述的玉米酪氨酸蛋白磷酸酶ZmRSPTP，其特征在于它是序列表中的SEQ ID №2。
5.含有權利要求1所述基因的表達載體。
6.含有權利要求1所述基因的細胞系。
7.權利要求1所述基因在培育抗旱植物中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于所述基因在培育抗旱玉米中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種玉米酪氨酸蛋白磷酸酶基因及其編碼蛋白與應用。其目的是提供一種參與調控ABA生物合成的玉米酪氨酸蛋白磷酸酶及其編碼基因與應用。本發明所提供的玉米酪氨酸蛋白磷酸酶編碼基因ZmRSPTP1，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼SEQ ID №2蛋白質序列的核苷酸序列；3)與序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性的DNA序列。本發明還提供了該基因的編碼蛋白即玉米酪氨酸蛋白磷酸酶ZmRSPTP1。本發明的酪氨酸蛋白磷酸酶基因ZmRSPTP1在植物抗旱領域具有廣闊的應用前景，可用于培育抗旱植物特別是抗旱玉米，其經濟效益潛力巨大。
文檔編號A01H1/00GK1584034SQ0315394
公開日2005年2月23日 申請日期2003年8月21日 優先權日2003年8月21日
發明者賈文瑣, 吳忠義, 黃叢林, 曹鳴慶 申請人:北京農業生物技術研究中心, 中國農業大學