專利名稱：魚類胚胎冷凍方法
技術領域：
本發明涉及魚類胚胎在液氮中冷凍保存的方法。
背景技術：
現有技術利用低濃度的抗凍劑冷凍保存魚類胚胎，冷凍前平衡處理時間10min，因未能充分脫除在冷凍保存過程中多余的水分，容易形成冰晶，對胚胎造成直接損傷，冷凍胚胎不能成活；在降溫速率上采用慢速降溫和分段慢速降溫，不能快速越過容易結冰的危險溫區(0～-60℃)，容易造成胚胎內的水分結冰，冰晶對細胞的細胞核和線粒體等細胞器的超微結構造成嚴重損傷，由于采用慢速降溫，胚胎在抗凍劑中的時間過長，雖然能夠脫除部分水分，但抗凍劑的毒性作用也造成胚胎的死亡，使冷凍仍不能獲得成功。胚胎經液氮冷凍保存后成活的實驗結果不能重復實現。
發明內容
本發明需要解決的技術問題是提供一種可消除和減少冰晶對胚胎損傷的魚類胚胎冷凍方法。
本發明的技術方案包括采用抗凍保護劑、冷凍前平衡處理、液氮中冷凍保存、解凍，其特征是以兩種或兩種以上抗凍劑復合成的易玻璃化溶液作為魚類胚胎冷凍保存的抗凍保護劑；冷凍前平衡處理30～50min后裝至毛細管或0.5ml離心管，并快速進入-196℃液氮中保存；解凍時，在-180℃平衡處理10min，再用38～40℃水浴解凍；最后用稀釋培養液培養，可獲得成活胚胎。
本發明由于采用易玻璃化溶液作為魚類胚胎冷凍保存的抗凍保護劑，可消除和減少冰晶對胚胎損傷；快速降溫法，讓復合抗凍劑快速越過容易結冰的危險溫區，在快速降溫過程中由液態轉變為非晶態的玻璃化液保存魚類胚胎，可避免和減少冰晶對細胞的細胞核和線粒體等細胞器的超微結構造成的損傷，能獲得魚類胚胎冷凍保存成活，具有實驗重復性強的技術效果。
附圖表示的是本發明工藝流程圖。
具體實施例方式
實施本發明的最好方式是以兩種或兩種以上高濃度抗凍劑組合成的易玻璃化的溶液作為魚類胚胎冷凍保存的抗凍保護劑；流程圖中的流程①表示玻璃化溶液用1.2丙二醇+DMSO配制或采用1.2丙二醇+甲醇配制；采用濃度25％～30％的1.2丙二醇與濃度10％～15％DMSO配制的溶液或濃度20％～30％的1.2丙二醇與濃度10％～15％的甲醇配制的溶液低毒、無高滲損傷、易玻璃化；例如保存泥鰍胚胎的玻璃化液配方為1.2丙二醇25％+DMS015％，即總數為100ml玻璃化溶液中60ml蒸餾水+25ml1.2丙二醇十15ml DMSO；不同種類魚類胚胎冷凍保存玻璃化的配比不盡相同，但兩種抗凍劑的總濃度應達到40％以上才能獲得玻璃化的效果；在2～4℃的低溫條件下，玻璃化液的毒性作用比在溫室下小，因此，流程圖中的流程②設定在2～4C進行冷凍前平衡處理，處理時間為30～50min，可充分脫除胚胎中的水分，減少胚胎內結冰；隨后進入流程③裝入毛細管或0.5ml離心管；接著快速進入流程④放在-196℃液氮中保存，讓復合抗凍劑快速越過容易結冰的危險溫區，在快速降溫過程中由液態轉變為非晶態的玻璃化液保存魚類胚胎，可避免和減少冰晶對細胞的細胞核和線粒體等細胞器的超微結構造成的損傷；流程圖的流程⑤表示解凍時在-180℃平衡處理10min，隨后進入流程⑥，用38～40℃水浴解凍；最后進入流程⑦用稀釋培養液培養，用稀釋培養液培養可避免滲透壓差過大而導致胚胎破裂、胚胎死亡，獲得成活胚胎。培養液濃度0.4％NaCl+濃度12％蔗糖+濃度2.5％檸檬酸三鈉配成。例如在50ml蒸餾水中加入NaCl0.4g、蔗糖12g、檸檬酸三鈉2.5g后加蒸餾水稀釋至100ml配成培養液。
權利要求
魚類胚胎冷凍方法包括采用抗凍保護劑、冷凍前平衡處理、液氮中冷凍保存、解凍，其特征是以兩種或兩種以上抗凍劑復合成的易玻璃化溶液作為魚類胚胎冷凍保存的抗凍保護劑；冷凍前平衡處理30～50min后裝至毛細管或0.5ml離心管，并快速進入-196℃液氮中保存；解凍時，在-180℃平衡處理10min，再用38～40℃水浴解凍；最后用稀釋培養液培養。
全文摘要
魚類胚胎冷凍方法，本發明涉及魚類胚胎在液氮中冷凍保存。本發明需要解決的技術問題是提供一種消除和減少冰晶對魚類胚胎損傷的冷凍方法。本發明包括采用抗凍保護劑、冷凍前平衡處理、液氮中冷凍保存、解凍，其特征是以兩種或兩種以上抗凍劑復合成的易玻璃化溶液作為魚類胚胎冷凍保存的抗凍保護劑；冷凍前平衡處理30～50min后裝至毛細管或0.5ml離心管，并快速進入－196℃液氮中保存；解凍時，在－180℃平衡處理10min，再用38～40℃水浴解凍；最后用稀釋培養液培養，可獲得成活胚胎。本發明適用于水產養殖。
文檔編號A01N1/02GK1600098SQ0315126
公開日2005年3月30日 申請日期2003年9月28日 優先權日2003年9月28日
發明者章龍珍, 莊平, 張濤, 馮廣朋, 黃曉榮 申請人:中國水產科學研究院東海水產研究所