豬飼料添加劑的制作方法

專利名稱：豬飼料添加劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及包含酵母細胞的生物組合物，其可以改善動物的免疫功能。本發明還涉及生產這種生物組合物的方法，及使用這種生物組合物作為動物飼料添加劑的方法。
2.背景技術從二十世紀40年代開始將抗生素加入動物飼料中。在2000年的報道中，美國售出的抗生素有1/3以上用于畜牧業中，即一年大約一千八百萬磅。它們用于治療患病動物；預防圈養在狹窄畜圈或籠子里的其它動物免于感染；及使動物快速生長。在體積方面，大多數抗生素用于前兩個原因。只有6.1％的藥物有生長促進作用。然而，在接觸的動物數方面，生長促進作用巨大。這是因為農場主對全部畜類或禽類以低劑量但每天均給予抗生素。調節性低劑量抗生素不僅有助于保持牲畜健康，而且還改善營養的吸收，這有助于動物在較少飼料基礎上更快生長，并因此提高利潤，尤其在集約農場運作中。估計美國九千二百萬頭豬中有75％的豬常規攝取的飼料中加有抗生素。有大約6％的牛，25％的雞和50％的火雞也是這樣做。
已知過量的抗生素和化學品、包括不被動物代謝的那些抗生素和化學品可以保留在機體內或被排泄。在第一種情況中，其可以累積在肉中(及在奶牛或山羊乳汁中)，被人體攝入。因此，存在這樣的可能性即這些抗生素和化學品污染人類食物。其次及更重要地，微生物暴露于所述抗生素，使所述微生物產生抗生素抗性菌株。如果被排泄，這些抗生素和化學品將釋放入環境中，可以進入土壤并與土壤微生物接觸。已經有推測，即過一段時間后，常用抗生素表現出對抗一些微生物的效力降低，因為抗生素抗性的產生及這種抗性轉移至包括在人體內導致感染的那些微生物在內的微生物。
逐漸有跡象提示廣泛用于農場動物的抗生素逐漸降低用于治療人類傳染病尤其通過食物傳染病原體導致的疾病的重要抗生素的效果。用低水平抗生素處理的農場動物產生細菌的藥物抗性形式。在一種情況中，Synercid獲準用于人體是在20世紀90年代，稱為維及尼霉素的一種密切相關藥物自從1974年已經用于牲畜。事實上，自從1990年在許多發達國家，人獸互傳病原體的多藥抗性菌株感染人體逐漸增多。特別引人注目的是鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)DT104的MR菌株的流行性傳播，目前其表現為幾乎在世界范圍分布。在DT104菌株中，抗性譜增加是令人關注的。在世界上的許多區域，對環丙沙星的易感性降低的趨勢逐漸增加。彎曲菌屬(Campylobacters)的環丙沙星抗性微生物也在增加，關于這類分離株的報道遍布于世界許多國家。見Threllfall E.J.et al.，Acta Vet ScandSuppl 2000；9363-8；Wegener H.C.，N Engl J Med.1999 May 20；340(20)1525-32；Smith K.E.et al.，N Engl J Med.1999 May 20；340(20)1581-2；Wegener H.C.et al.，Acta Vet Scand Suppl.1999；9251-7。
由于考慮到使人體產生疾病的微生物中抗藥性的產生，美國和歐盟的管理機構已經禁止或提議禁止在動物中使用某些抗生素作為生長促進劑。作為辯護，農場主和藥廠反駁說減少使用抗生素將導致疾病和死亡率增加，而且由于使動物達到理想屠宰體重所需時間增加，使肉類更加昂貴。抗生素有助于動物較快增肥，因為它們不需要在抵抗疾病方面消耗能量。有反對意見說正是對生長促進劑的禁止將引起對健康產生巨大危險。不對其加以防護，動物可面臨更嚴重的疾病。結果，獸醫將采用大劑量治療性抗生素。例如，在瑞典禁止使用抗生素當年，超過50000頭豬死于腹瀉。
很清楚的是在抗生素在畜牧業作為預防劑的應用被禁止或減少的同時，急迫需要替代方式降低農場動物感染疾病的幾率。本發明提供了一種解決方案，即使用酵母改善動物的免疫功能。
動物飼料中包含真菌細胞或真菌發酵產物已經應用了一段時間。一些細菌、酵母和霉菌制品，通常稱為益生菌或直接食用微生物，經口服或添加至動物飼料中能提供多種益處。然而，這種制品的作用機制不十分清楚，但確信它們發揮作用是通過改變動物的腸道微生物區系/小型生物群，從而改善腸道健康狀態及改善營養吸收。在反芻動物中，所述制品可以改善在瘤胃中導致氣體浪費性產生的發酵情況。
真菌細胞及產物在動物飼料中的應用例如見Miller出版公司(Minnetonka，Minn.)出版的年度飼料添加劑綱要，或以下專利文獻美國專利No.3,903,307揭示了一種生產動物飼料的方法，其基于通過酵母如Candida utilis和Trichoderma veride發酵廢糖蜜或甘蔗渣。
美國專利No.4,055,667揭示了一種液體動物飼料補劑，其包含用過的啤酒酵母在乙醇水溶液介質中的膠體混合物。
美國專利No.4,582,708揭示了一種動物飼料補劑，其包含具有發酵活性的活酵母細胞(糖酵母屬菌種(Saccharomyces))，一種包含磨碎的谷類、磨碎的豆類或其混合物的增稠成分，一種礦物質混合物，一種液體結合劑，一種維生素混合物，及磨碎的高嶺土。
美國專利No.5,624,686揭示了一種動物飼料添加劑，其通過培養某些細菌或酵母菌種(如Saccharomyces cerevisiae，Candida utilis)并破壞所述微生物細胞而制備，由此使得所述細胞的代謝物有效為動物所用。
美國專利No.6,214,337揭示了一種包含酵母葡聚糖的動物飼料，其衍生自多種酵母菌種(如Saccharomyces cerevisiae，Candida utilis)的細胞壁。
本文對文獻的引用不意味著承認本文所引用任何文獻是相關的現有技術，也不意味著承認所引用文獻被看作對于本申請權利要求書的可專利性有實質的影響。所有對這些文獻的日期的聲明和對內容的陳述均基于申請人掌握的信息，并不意味著對這些文獻的日期或內容的正確性的承認。
3.發明內容本發明涉及一種生物組合物，其可以加入動物飼料中以降低豬中傳染病發生率。
在一個實施方案中，本發明提供了包含大量活酵母細胞的生物組合物，當被攝取時，所述酵母細胞能改善豬的免疫功能。所述生物組合物可以用于降低豬傳染病發生率或使豬的健康狀態最佳化。
在另一個實施方案中，本發明提供了生產所述生物組合物的方法。具體地，本發明方法包括在一系列限定頻率和場強的電磁場的存在下培養酵母細胞，由此所述酵母細胞成為代謝活性的并強力刺激動物免疫系統。多達4種不同酵母細胞成分可以用于形成生物組合物。所述酵母細胞還可以進行馴化(conditioning)步驟以改善其性能。所述馴化步驟包括在含有豬胃液、野山楂汁和野棗汁培養基中培養所述酵母細胞。本發明涵蓋如下的生產所述生物組合物的方法，所述方法包括在活化條件下培養所述酵母細胞，混合本發明的各種酵母細胞培養物，隨后干燥所述酵母細胞并對終產物進行包裝。在優選的實施方案中，起始酵母細胞可商購和/或可公開獲得，例如但非限于Saccharomyces cerevisiae。
本發明生物組合物可以直接喂給動物或用作添加劑摻入正常動物飼料中。本發明涵蓋包含本發明激活的酵母細胞和配料如沸石粉的動物飼料組合物。
4.


圖1酵母細胞的激活和馴化。1酵母細胞培養物；2容器；3電磁場源；4電極。
5.具體實施方案本發明涉及生物組合物，其能改善動物的免疫功能，和/或降低傳染病發生率。本發明提供了生產所述生物組合物的方法以及所述生物組合物作為動物飼料添加劑的應用方法。
本發明的生物組合物包含酵母。與作為飼料成分的酵母傳統應用不同，本發明的酵母細胞不是動物營養素的主要來源。本發明的酵母細胞作為補充物代替或減少目前常規加入牲畜飼料中的抗生素。所述酵母細胞當由動物口服或與飼料一起被攝取時是活的。在動物胃腸道中，所述酵母細胞能刺激動物免疫系統并改善免疫功能，從而降低傳染病發生率。應用本發明的生物組合物可以降低商業動物運作中保持動物健康的總成本，及使在飼料中最少應用抗生素或不用抗生素切實可行。
盡管以下術語具有本領域中充分闡明的含義，以下仍闡述了所述術語在本文中的含義以便于解釋本發明。
本文所用術語“飼料”，廣義上是指任何種類的液體或固體物質，其用于營養動物或維持動物正常生長或加速其生長，包括新生動物及幼小的發育中動物。優選地，所述飼料是豬飼料。
本文所用術語“動物”是指未成年豬(pig)，豬(swine)或成年豬(hog)，并包括圈養豬的所有品種。
本文所有術語“免疫功能”廣泛涵蓋了動物的特異性和非特異性免疫反應，包括體液和細胞介導的防御機制。動物的免疫功能能使動物免于病原體感染和/或從感染中康復，所述病原體如細菌，病毒，真菌，原生動物，蠕蟲及其它寄生蟲。動物的免疫功能還可以預防感染，特別是在動物初次暴露于病原體之后由相同病原體所致的未來感染。許多類型的免疫細胞參與提供免疫功能，包括淋巴細胞的各種亞型(B細胞，T細胞，K細胞，NK細胞)，不同類型的白細胞(巨噬細胞，中性粒細胞，嗜酸性粒細胞，嗜堿性粒細胞)，抗原呈遞細胞(樹狀細胞，內皮細胞)及在具有免疫活性的特定器官和組織中發現的細胞(骨髓，淋巴結，胸腺，粘液囊，淋巴集結)。反芻動物免疫系統的詳細闡述見于John E.Butler所著的反芻動物免疫系統，1981，Perseus Books，在此以其全文并入參考。
在一個實施方案中，本發明提供了生物組合物，其包含至少一種酵母細胞成分。每種酵母細胞成分包含一群活酵母細胞，其已經在特定條件下培養，由此所述酵母細胞能改善動物免疫功能。在優選實施方案中，本發明生物組合物包含多達4種酵母細胞成分。
根據本發明，在某些特定培養條件下，可使酵母代謝性激活，從而有效刺激及增強攝取該酵母的動物的免疫功能。不希望被任何理論或機制束縛，本發明人認為所述培養條件激活和/或增強酵母細胞中一個基因或一系列基因表達，由此所述酵母細胞變得能強力刺激動物免疫系統。預想某些酵母基因產物和動物免疫系統因子之間的相互作用由于所述酵母細胞在下述條件下培養后這些酵母基因產物水平提高而明顯增強。據信這些相互作用涉及胃腸道內和淋巴結內排列的免疫細胞以及循環免疫細胞。這些相互作用的結果是動物的免疫功能改善，如對感染的應答及從感染中康復，及對疾病的抗性得以改善。保護所述動物免于許多類型的傳染病，包括寄生蟲疾病，例如但非限于由細菌，病毒，真菌，原生動物，蠕蟲等所致那些疾病。應用所述生物組合物的益處通過得自動物的實驗結果證實，示出對傳染病抗性或從中迅速康復。
在一個實施方案中，本發明的生物組合物可以直接由動物攝取。在另一個實施方案中，所述生物組合物可以加入飼料中。如相關領域技術人員所已知的，可以使用許多方法和器具將本發明生物組合物與飼料混合。在一個特別的實施方案中，本發明酵母培養肉湯的混合物在喂食動物之前直接加入飼料中。也可以將酵母的干燥粉末在喂食動物之前直接加入飼料中。在本發明另一個實施方案中，將所述酵母細胞與飼料的生料混合，這樣自然摻入所述酵母細胞。所述生物組合物可以通過任何自動機械化方式施加于飼料中和/或與飼料混合。
所用生物組合物的量部分取決于飼養方案，并可以根據經驗確定。例如，生物組合物與動物飼料的比率范圍在0.1％-1％干重，優選0.3％-0.8％，更優選大約0.5％。盡管非必需，本發明生物組合物還可以與其它類型補劑聯合或輪流使用，這些補劑例如但非限于維生素，礦物質和疫苗。
以下5.1和5.2章節是本發明4種酵母細胞成分及其制備方法。5.3章節闡述了包含4種酵母細胞成分中至少一種成分的本發明生物組合物的生產。
5.1酵母細胞培養物的制備本發明提供了酵母細胞，其能改善攝取該酵母細胞的動物的免疫功能。可以組合多達4種不同的酵母細胞成分生產所述生物組合物。
所述生物組合物的一種酵母細胞成分通過在一個交變電磁場或一系列多個交變電磁場(multiple alternating electromagnetic fields inseries)下，在適當培養基中將大量酵母細胞培養一段時間而產生。所述培養程序使酵母孢子萌生，酵母細胞生長及分化，并可以進行分批培養或連續培養程序。本文所用術語“交變電磁場”或“電磁場”或“EM場”是同義的。本發明所用電磁場可以通過本領域熟知的各種方法產生。設備示意圖如圖1所示。所需頻率和所需場強的電磁場由電磁波源(3)產生，其包含能產生電磁波的一或多個信號發生器，優選正弦波，優選頻率范圍為1500MHZ-15000MHz。本領域熟知這種信號發生器。也可以使用能產生較窄頻率范圍信號的信號發生器。如果需要，還可以使用信號放大器以增大信號輸出，及因此增強EM場強。
可以通過各種方式將電磁場應用于所述培養中，包括將酵母細胞置于連接電磁波源的信號發射器鄰近。在一個實施方案中，電磁場通過淹沒于酵母細胞培養物中的電極形式的信號發射器(1)產生。在一個優選實施方案中，一個電極是金屬板，其置于無導電性的容器(2)的底部，另一個電極包含多個導線或導管，它們配置在所述容器內部，由此電磁場的能量可以均勻分布于培養物中。對于垂直的培養器，導線或導管的頂端置于距容器底部3-30cm內(即從底部起大約2-10％容器高)。所用電極導線數根據培養物體積和導線直徑而定。例如，培養物體積為10升或更少時，可以使用直徑在0.5-2.0mm之間的兩或三條電極導線。培養物體積為10-100升時，電極導線或導管的直徑可以為3.0-5.0mm。培養物體積為100-1000升時，電極導線或導管的直徑可以為6.0-15.0mm。培養物體積為1000升以上時，電極導線或導管的直徑可以為20.0-25.0mm。
在本發明的各種實施方案中，可以使用Saccharomyces，Candida，Crebrothecium，Geotrichum，Hansenula，Kloeckera，Lipomyces，Pichia，Rhodosporidium，Rhodotorula Torulopsis，Trichosporon，和Wickerhamia屬酵母。
酵母菌株的非限制性實例包括Saccharomyces cerevisae Hansen，ACCC2034，ACCC2035，ACCC2036，ACCC2037，ACCC2038，ACCC2039，ACCC2040，ACCC2041，ACCC2042，AS2.1，AS2.4，AS2.11，AS2.14，AS2.16，AS2.56，AS2.69，AS2.70，AS2.93，AS2.98，AS2.101，AS2.109，AS2.110，AS2.112，AS2.139，AS2.173，AS2.174，AS2.182，AS2.196，AS2.242，AS2.336，AS2.346，AS2.369，AS2.374，AS2.375，AS2.379，AS2.380，AS2.382，AS2.390，AS2.393，AS2.395，AS2.396，AS2.397，AS2.398，AS2.399，AS2.400，AS2.406，AS2.408，AS2.409，AS2.413，AS2.414，AS2.415，AS2.416，AS2.422，AS2.423，AS2.430，AS2.431，AS2.432，AS2.451，AS2.452，AS2.453，AS2.458，AS2.460，AS2.463，AS2.467，AS2.486，AS2.501，AS2.502，AS2.503，AS2.504，AS2.516，AS2.535，AS2.536，AS2.558，AS2.560，AS2.561，AS2.562，AS2.576，AS2.593，AS2.594，AS2.614，AS2.620，AS2.628，AS2.631，AS2.666，AS2.982，AS2.1190，AS2.1364，AS2.1396，IFFI 1001，IFFI 1002，IFFI 1005，IFFI 1006，IFFI 1008，IFFI 1009，IFFI 1010，IFFI 1012，IFFI1021，IFFI 1027，IFFI 1037，IFFI 1042，IFFI 1043，IFFI 1045，IFFI 1048，IFFI 1049，IFFI 1050，IFFI 1052，IFFI 1059，IFFI 1060，IFFI 1063，IFFI1202，IFFI 1203，IFFI 1206，IFFI 1209，IFFI 1210，IFFI 1211，IFFI 1212，IFFI 1213，IFFI 1215，IFFI 1220，IFFI 1221，IFFI 1224，IFFI 1247，IFFI1248，IFFI 1251，IFFI 1270，IFFI 1277，IFFI 1287，IFFI 1289，IFFI 1290，IFFI 1291，IFFI 1292，IFFI 1293，IFFI 1297，IFFI 1300，IFFI 1301，IFFI1302，IFFI 1307，IFFI 1308，IFFI 1309，IFFI 1310，IFFI 1311，IFFI 1331，IFFI 1335，IFFI 1336，IFFI 1337，IFFI 1338，IFFI 1339，IFFI 1340，IFFI1345，IFFI 1348，IFFI 1396，IFFI 1397，IFFI 1399，IFFI 1411，IFFI 1413；Saccharomyces cerevisiae Hansen Var. ellipsoideus(Hansen)Dekker，ACCC2043，AS2.2，AS2.3，AS2.8，AS2.53，AS2.163，AS2.168，AS2.483，AS2.541，AS2.559，AS2.606，AS2.607，AS2.611，AS2.612；Saccharomyces chevalieri Guillermond，AS2.131，AS2.213；Saccharomyces delbrueckii，AS2.285；Saccharomyces delbrueckii Lindnervar. mongolicus Lodder et van Rij，AS2.209，AS2.1157；Saccharomycesexiguous Hansen，AS2.349，AS2.1158；Saccharomyces fermentati(Saito)Lodder et van Rij，AS2.286，AS2.343；Saccharomyces logos van laer etDenamur ex Jorgensen，AS2.156，AS2.327，AS2.335；Saccharomycesmellis Lodder et Kreger Van Rij，AS2.195；Saccharomycesmicroellipsoides Osterwalder，AS2.699；Saccharomyces oviformisOsterwalder，AS2.100；Saccharomyces rosei(Guilliermond)Lodder etkreger van Rij，AS2.287；Saccharomyces rouxii Boutroux，AS2.178，AS2.180，AS2.370，AS2.371；Saccharomyces sake Yabe，ACCC2045；Candida arborea，AS2.566；Candida Krusei(Castellani)Berkhout，AS2.1045；Candida lambica(Lindner et Genoud)van. Uden et Buckley，AS2.1182；Candida lipolytica(Harrison)Diddens et Lodder，AS2.1207，AS2.1216，AS2.1220，AS2.1379，AS2.1398，AS2.1399，AS2.1400；Candida parapsilosis (Ashford) Langeron et Talice，AS2.590；Candidaparapsilosis(Ashford)et Talice Var. intermedia Van Rij et Verona，AS2.491；Candida pulcherriman(Lindner)Windisch，AS2.492；Candidarugousa(Anderson)Diddens et Loddeer，AS2.511，AS2.1367，AS2.1369，AS2.1372，AS2.1373，AS2.1377，AS2.1378，AS2.1384；Candida tropicalis(Castellani)Berkout，ACCC2004，ACCC2005，ACCC2006，AS2.164，AS2.402，AS2.564，AS2.565，AS2.567，AS2.568，AS2.617，AS2.1387；Candida utilis Henneberg Lodder et Kreger Van Rij，AS2.120，AS2.281，AS2.1180；Crebrothecium ashbyii(Guillermond)Routein，AS2.481，AS2.482，AS2.1197；Geotrichum candidum Link，ACCC2016，AS2.361，AS2.498，AS2.616，AS2.1035，AS2.1062，AS2.1080，AS2.1132，AS2.1175，AS2.1183；Hansenula anomala(Hansen)H et P sydow，ACCC2018，AS2.294，AS2.295，AS2.296，AS2.297，AS2.298，AS2.299，AS2.300，AS2.302，AS2.338，AS2.339，AS2.340，AS2.341，AS2.470，AS2.592，AS2.641，AS2.642，AS2.635，AS2.782，AS2.794；Hansenula arabitolgensFang，AS2.887；Hansenula jadinii Wickerham，ACCC2019；Hansenulasaturnus(Klocker)H et P sydow，ACCC2020；Hansenula schneggii(Weber)Dekker，AS2.304；Hansenula subpelliculosa Bedford，AS2.738，AS2.740，AS2.760，AS2.761，AS2.770，AS2.783，AS2.790，AS2.798，AS2.866；Kloeckera apiculata(Reess emend. Klocker)Janke，ACCC2021，ACCC2022，ACCC2023，AS2.197，AS2.496，AS2.711，AS2.714；Lipomyces starkeyi Lodder et van Rij，ACCC2024，AS2.1390；Pichiafarinosa(Lindner)Hansen，ACCC2025，ACCC2026，AS2.86，AS2.87，AS2.705，AS2.803；Pichia membranaefaciens Hansen，ACCC2027，AS2.89，AS2.661，AS2.1039；Rhodosporidium toruloides Banno，ACCC2028；Rhodotorula glutinis(Fresenius)Harrison，ACCC2029，AS2.280，ACCC2030，AS2.102，AS2.107，AS2.278，AS2.499，AS2.694，AS2.703，AS2.704，AS2.1146；Rhodotorula minuta(Saito)Harrison，AS2.277；Rhodotorula rubar(Demme)Lodder，ACCC2031，AS2.21，AS2.22，AS2.103，AS2.105，AS2.108，AS2.140，AS2.166，AS2.167，AS2.272，AS2.279，AS2.282；Saccharomyces carlsbergensis Hansen，AS2.113，ACCC2032，ACCC2033，AS2.312，AS2.116，AS2.118，AS2.121，AS2.132，AS2.162，AS2.189，AS2.200，AS2.216，AS2.265，AS2.377，AS2.417，AS2.420，AS2.440，AS2.441，AS2.443，AS2.444，AS2.459，AS2.595，AS2.605，AS2.638，AS2.742，AS2.745，AS2.748，AS2.1042；Saccharomycas uvarum Beijer，IFFI 1023，IFFI 1032，IFFI 1036，IFFI1044，IFFI 1072，IFFI 1205，IFFI 1207；Saccharomyces willianusSaccardo，AS2.5，AS2.7，AS2.119，AS2.152，AS2.293，AS2.381，AS2.392，AS2.434，AS2.614，AS2.1189；Saccharomyces sp.，AS2.311；Saccharomyces ludwigii Hansen，ACCC2044，AS2.243，AS2.508；Saccharomyces sinenses Yue，AS2.1395；SchizoSaccharomycesoctosporus Beijerinck，ACCC 2046，AS2.1148；SchizoSaccharomycespombe Linder，ACCC2047，ACCC2048，AS2.248，AS2.249，AS2.255，AS2.257，AS2.259，AS2.260，AS2.274，AS2.994，AS2.1043，AS2.1149，AS2.1178，IFFI 1056；Sporobolomyces roseus Kluyver et van Niel，ACCC2049，ACCC 2050，AS2.619，AS2.962，AS2.1036，ACCC2051，AS2.261，AS2.262；Torulopsis candida(Saito)Lodder，ACCC2052，AS2.270；Torulopsis famta(Harrison)Lodder et van Rij，ACCC2053，AS2.685；Torulopsis globosa(Olson et Hammer)Lodder et van Rij，ACCC2054，AS2.202；Torulopsis inconspicua Lodder et van Rij，AS2.75；Trichosporonbehrendii Lodder et Kreger van Rij，ACCC2055，AS2.1193；Trichosporoncapitatum Diddens et Lodder，ACCC2056，AS2.1385；Trichosporoncutaneum(de Beurm et al.)Ota，ACCC2057，AS2.25，AS2.570，AS2.571，AS2.1374；Wickerhamia fluoresens(Soneda)Soneda，ACCC2058，AS2.1388。通常優選糖酵母屬(Saccharomyces)酵母。在Saccharomycescerevisiae酵母株中，優選Saccharomyces cerevisiae Hansen。
通常地，本發明所用酵母菌株可以得自私立或公立實驗室培養物，或可公開獲得的培養物保藏物，如美國典型培養物保藏中心，10801弗吉尼亞州馬納薩斯大學道，VA 20110-2209，和中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，，中國科學院微生物所，中國北京海淀區2714信箱，郵編100080。
盡管是優選的，本發明酵母細胞成分的制備不限于用純化的酵母菌株起始。每種酵母細胞成分可以通過培養不同菌種或菌株的酵母細胞混合物而產生。酵母細胞成分的組成可以通過本領域熟知的標準酵母鑒別方法確定。
在本發明的不同實施方案中，使用處理、轉移及保存酵母的標準方法。盡管非必需，但當進行本發明生產過程時，需要無菌條件或清潔環境。也可以使用處理動物血液和免疫細胞及研究動物免疫功能的標準方法。這種方法的詳細闡述見實驗室方法進展普通血液學2000，Assendelft等編輯，Arnold，Edward(出版人)；脊椎動物免疫學手冊1998，Pastoret等編輯，學術出版社，及免疫學通用方法1991，Coligan等編輯，John Wiley & Sons公司，在此均以其全文并入參考。
在一個實施方案中，將第一種酵母細胞成分的酵母細胞在存在至少一個可變電磁(EM)場的情況下培養，頻率范圍為7715MHz-7728MHz。可以施加一個單一EM場或一系列EM場，每個電磁場具有在一定范圍內的不同頻率，或一定范圍內的不同場強，或一定范圍內的不同頻率和場強。盡管可以使用任何實用數量的EM場，但優選將酵母培養物暴露于一系列的2，3，4，5，6，7，8，9或10種不同EM場中。可以通過本領域已知方式施加的EM場的各自頻率可以為7715，7716，7717，7718，7719，7720，7721，7722，7723，7724，7725，7726，7727或7728MHz。
EM場的場強在3.5-230mV/cm內。在一個優選實施方案中，系列中開始的EM場比后來的EM場的場強低，由此酵母細胞培養物暴露于場強逐漸提高的EM場中。因此，可以將酵母細胞在較低場強(例如50-85mV/cm)培養10-64小時，然后在較高EM場強(例如85-230mV/cm)再培養10-64小時。當從一個EM場至另一個EM場轉換時，所述酵母細胞培養物可以保持在相同容器中，使用同一套的電磁波發生器和發射器。
所述培養程序可以通過用細胞密度為大約105個細胞/ml的1ml選定的酵母菌株接種物接種100ml培養基起始。將起始培養基在35℃-37℃保持24-48小時，之后暴露于EM場中。所述培養程序優選在溶解氧濃度在0.025-0.08mol/m3的條件下進行，優選0.04mol/m3。氧的水平可以通過本領域已知的任何常規方法控制，包括但非限于攪拌和/或吹氣。
所述培養最優選在液體培養基中進行，所述培養基中含有動物血清和酵母細胞可同化的營養素來源。表1提供了培養本發明第一種酵母細胞成分的培養基實例。
表1
通常地，碳水化合物如糖，例如蔗糖，葡萄糖，果糖，右旋糖，麥芽糖，木糖等及淀粉，可以單獨或組合使用作為培養基中可同化碳源。培養基中利用的碳水化合物來源的精確數量部分依賴于培養基中的其它配料，但碳水化合物的數量通常在培養基重量的大約0.1％-5％之間變化，優選大約0.5％和2％，最優選大約0.8％。在培養基中這些碳源可以單獨使用，或可以組合使用這樣的一些碳源。可以摻入培養基中的無機鹽是能產生鈉，鈣，磷酸根，硫酸根，碳酸根等離子的常規鹽。營養性無機鹽的非限制性實例是(NH4)2HPO4，CaCO3，MgSO4，NaCl，和CaSO4。
動物血清是包含白細胞的一種血液組分，可以通過本領域已知的標準方法如密度梯度離心從全血(100-500ml)中制備。例如使用牛血清，優選豬血清。分離出紅細胞并棄去。在將培養基高壓滅菌并冷卻至大約45℃之后，將血清加入培養基中。
應注意表1提供的培養基成分是非限制性的。可根據需要按比例增加或減少。本領域技術人員根據實際及經濟利益可以對所述培養基進行各種修改，如培養規模和培養基成分的當地供應。
盡管酵母細胞在EM場中培養僅幾小時后就被激活，但所述酵母細胞可以在EM場中長期培養(例如一或多周)。在培養程序結束時，通過本領域已知的各種方法從培養物中回收組成本發明第一種酵母細胞成分的酵母細胞，并在大約0℃-4℃溫度下貯存。回收的酵母細胞也可以干燥并以粉末形式貯存。
用Candida utilis Henneberg Lodder et Kreger Van Rij菌株AS2.281生產本發明第一種酵母細胞成分的一個非限制性實例見于下文第6章所述。
在另一個實施方案中，將第二種酵母細胞成分的酵母細胞在至少一個可變電磁(EM)場中培養，頻率范圍是6825MHZ-6860MHz。可以施加一個單一EM場或一系列EM場，每個電磁場具有在一定范圍內的不同頻率，或一定范圍內的不同場強，或一定范圍內的不同頻率和場強。盡管可以使用任何實用數量的EM場，但優選將酵母培養物暴露于一系列的2，3，4，5，6，7，8，9或10種不同EM場中。可以通過本領域已知方式施加的EM場的各自頻率可以為6825，6826，6827，6828，6829，6830，6831，6832，6833，6834，6835，6836，6837，6838，6839，6840，6841，6842，6843，6844，6845，6846，6847，6848，6849，6850，6851，6852，6853，6854，6855，6856，6857，6858，6859，或6860MHz。
EM場強范圍是6.5-260mV/cm。在一個優選實施方案中，系列中開始的EM場比后來的EM場的場強低，由此酵母細胞培養物暴露于場強逐漸提高的EM場中。因此，可以將酵母細胞在較低場強(例如50-130mV/cm)培養8-88小時，然后在較高EM場強(例如130-260mV/cm)再培養8-88小時。當從一個EM場至另一個EM場轉換時，所述酵母細胞培養物可以保持在相同容器中，使用同一套的電磁波發生器和發射器。
所述培養程序可以通過用細胞密度為大約105個細胞/ml的1ml選定的酵母菌株接種物接種100ml培養基起始。將起始培養基在35℃-37℃保持24-48小時，之后暴露于EM場中。所述培養程序優選在溶解氧濃度在0.025-0.08mol/m3的條件下進行，優選0.04mol/m3。氧的水平可以通過本領域已知的任何常規方法控制，包括但非限于攪拌和/或吹氣。
所述培養最優選在液體培養基中進行，所述培養基中含有動物血清和酵母細胞可同化的營養素來源。表2提供了培養本發明第二種酵母細胞成分的培養基實例。
表2
通常地，碳水化合物如糖，例如蔗糖，葡萄糖，果糖，右旋糖，麥芽糖，木糖等及淀粉，可以單獨或組合使用作為培養基中可同化碳源。培養基中利用的碳水化合物來源的精確數量部分依賴于培養基中的其它配料，但碳水化合物的數量通常在培養基重量的大約0.1％-5％之間變化，優選大約0.5％和2％，最優選大約0.8％。在培養基中這些碳源可以單獨使用，或可以組合使用這樣的一些碳源。可以摻入培養基中的無機鹽是能產生鈉，鈣，磷酸根，硫酸根，碳酸根等離子的常規鹽。營養性無機鹽的非限制性實例是(NH4)2HPO4，CaCO3，MgSO4，NaCl，和CaSO4。
動物血清是包含白細胞的一種血液組分，可以通過本領域已知的標準方法如密度梯度離心從全血(100-500ml)中制備。例如使用牛血清，優選豬血清。分離出紅細胞并棄去。在將培養基高壓滅菌并冷卻至大約45℃之后，將血清加入培養基中。
應注意表2提供的培養基成分是非限制性的。可根據需要按比例增加或減少。本領域技術人員根據實際及經濟利益可以對所述培養基進行各種修改，如培養規模和培養基成分的當地供應。
盡管酵母細胞在EM場中培養僅幾小時后就被激活，但所述酵母細胞可以在EM場中長期培養(例如一或多周)。在培養程序結束時，通過本領域已知的各種方法從培養物中回收組成本發明第二種酵母細胞成分的酵母細胞，并在大約0℃-4℃溫度下貯存。回收的酵母細胞也可以干燥并以粉末形式貯存。
用Saccharomyces cerevisiae酵母菌株AS2.502生產本發明第二種酵母細胞成分的一個非限制性實例見于下文第6章所述。
在另一個實施方案中，將第三種酵母細胞成分的酵母細胞在至少一個可變電磁(EM)場中培養，頻率范圍是8120MHz-8135MHz。可以施加一個單一EM場或一系列EM場，每個電磁場具有在一定范圍內的不同頻率，或一定范圍內的不同場強，或一定范圍內的不同頻率和場強。盡管可以使用任何實用數量的EM場，但優選將酵母培養暴露于一系列的2，3，4，5，6，7，8，9或10種不同EM場中。可以通過本領域已知方式施加的EM場的各自頻率可以為8120，8121，8122，8123，8124，8125，8126，8127，8128，8129，8130，8131，8132，8133，8134，或8135MHz。
EM場強范圍是10.5-290mV/cm。在一個優選實施方案中，串連開始的EM場比后來的EM場的場強低，由此酵母細胞培養物暴露于場強逐漸提高的EM場中。因此，可以將酵母細胞在較低場強(例如10-180mV/cm)培養8-66小時，然后在較高EM場強(例如170-290mV/cm)再培養8-66小時。當從一個EM場至另一個EM場轉換時，所述酵母細胞培養物可以保持在相同容器中，使用相同系列的電磁波發生器和發射器。
所述培養程序可以通過用細胞密度為大約105個細胞/ml的1ml選定的酵母菌株接種物接種100ml培養基起始。將起始培養基在35℃-37℃保持24-48小時，之后暴露于EM場中。所述培養程序優選在溶解氧濃度在0.025-0.08mol/m3的條件下進行，優選0.04mol/m3。氧的水平可以通過本領域已知的任何常規方法控制，包括但非限于攪拌和/或吹氣。
所述培養最優選在液體培養基中進行，所述培養基中含有動物血清和酵母細胞可同化的營養素來源。表3提供了培養本發明第三種酵母細胞成分的培養基實例。
表3
通常地，碳水化合物如糖，例如蔗糖，葡萄糖，果糖，右旋糖，麥芽糖，木糖等及淀粉，可以單獨或組合使用作為培養基中可同化碳源。培養基中利用的碳水化合物來源的精確數量部分依賴于培養基中的其它配料，但碳水化合物的數量通常在培養基重量的大約0.1％-5％之間變化，優選大約0.5％和2％，最優選大約0.8％。在培養基中這些碳源可以單獨使用，或可以組合使用這樣的一些碳源。可以摻入培養基中的無機鹽是能產生鈉，鈣，磷酸根，硫酸根，碳酸根等離子的常規鹽。營養性無機鹽的非限制性實例是(NH4)2HPO4，CaCO3，MgSO4，NaCl，和CaSO4。
動物血清是包含白細胞的一種血液組分，可以通過本領域已知的標準方法如密度梯度離心從全血(100-500ml)中制備。例如使用牛血清，優選豬血清。分離出紅細胞并棄去。在將培養基高壓滅菌并冷卻至大約45℃之后，將血清加入培養基中。
應注意表3提供的培養基成分是非限制性的。可根據需要按比例增加或減少。本領域技術人員根據實際及經濟利益可以對所述培養基進行各種修改，如培養規模和培養基成分的當地供應。
盡管酵母細胞在EM場中培養僅幾小時后就被激活，但所述酵母細胞可以在EM場中長期培養(例如一或多周)。在培養程序結束時，通過本領域已知的各種方法從培養物中回收組成本發明第三種酵母細胞成分的酵母細胞，并在大約0℃-4℃溫度下貯存。回收的酵母細胞也可以干燥并以粉末形式貯存。
用Saccharomyces cerevisiae酵母菌株IFFI1277生產本發明第三種酵母細胞成分的一個非限制性實例見于下文第6章所述。
在另一個實施方案中，將第四種酵母細胞成分的酵母細胞在至少一個可變電磁(EM)場中培養，頻率范圍是8524MHz-8554MHz。可以施加一個單一EM場或一系列EM場，每個電磁場具有在一定范圍內的不同頻率，或一定范圍內的不同場強，或一定范圍內的不同頻率和場強。盡管可以使用任何實用數量的EM場，但優選將酵母培養物暴露于一系列的2，3，4，5，6，7，8，9或10種不同EM場中。可以通過本領域已知方式施加的EM場的各自頻率可以為8524，8411，8412，8413，8414，8415，8416，8417，8418，8419，8420，8421，8422，8423，8424，8425，8426，8427，8428，8429或8554MHz。
EM場強范圍是15-320mV/cm。在一個優選實施方案中，系列中開始的EM場比后來的EM場的場強低，由此酵母細胞培養物暴露于場強逐漸提高的EM場中。因此，可以將酵母細胞在較低場強(例如100-180mV/cm)培養10-60小時，然后在較高EM場強(例如200-320mV/cm)再培養10-60小時。當從一個EM場至另一個EM場轉換時，所述酵母細胞培養物可以保持在相同容器中，使用同一套電磁波發生器和發射器。
所述培養程序可以通過用細胞密度為大約105個細胞/ml的1ml選定的酵母菌株接種物接種100ml培養基起始。將起始培養基在35℃-37℃保持24-48小時，之后暴露于EM場中。所述培養程序優選在溶解氧濃度在0.025-0.08mol/m3的條件下進行，優選0.04mol/m3。氧的水平可以通過本領域已知的任何常規方法控制，包括但非限于攪拌和/或吹氣。
所述培養最優選在液體培養基中進行，所述培養基中含有動物血清和酵母細胞可同化的營養素來源。表4提供了培養本發明第四種酵母細胞成分的培養基實例。
表4
通常地，碳水化合物如糖，例如蔗糖，葡萄糖，果糖，右旋糖，麥芽糖，木糖等及淀粉，可以單獨或組合使用作為培養基中可同化碳源。培養基中利用的碳水化合物來源的精確數量部分依賴于培養基中的其它配料，但碳水化合物的數量通常在培養基重量的大約0.1％-5％之間變化，優選大約0.5％和2％，最優選大約0.8％。在培養基中這些碳源可以單獨使用，或可以組合使用這樣的一些碳源。可以摻入培養基中的無機鹽是能產生鈉，鈣，磷酸根，硫酸根，碳酸根等離子的常規鹽。營養性無機鹽的非限制性實例是(NH4)2HPO4，CaCO3，MgSO4，NaCl，和CaSO4。
動物血清是包含白細胞的一種血液組分，可以通過本領域已知的標準方法如密度梯度離心從全血(100-500ml)中制備。例如使用牛血清，優選豬血清。分離出紅細胞并棄去。在將培養基高壓滅菌并冷卻至大約45℃之后，將血清加入培養基中。
應注意表3提供的培養基成分是非限制性的。可根據需要按比例增加或減少。本領域技術人員根據實際及經濟利益可以對所述培養基進行各種修改，如培養規模和培養基成分的當地供應。
盡管酵母細胞在EM場中培養僅幾小時后就被激活，但所述酵母細胞可以在EM場中長期培養(例如一或多周)。在培養程序結束時，通過本領域已知的各種方法從培養物中回收組成本發明第四種酵母細胞成分的酵母細胞，并在大約0℃-4℃溫度下貯存。回收的酵母細胞也可以干燥并以粉末形式貯存。
用Geotrichum candidum Link酵母菌株AS2.361生產本發明第四種酵母細胞成分的一個非限制性實例見于下文第6章所述。5.2.酵母細胞的馴化在另一個實施方案中，激活的酵母細胞的性能可以如下最佳化在存在取自待喂食所述生物組合物的動物類型的胃腸道中的物質的情況下培養激活的酵母細胞。包含這個馴化過程使激活的酵母細胞適應并耐受動物胃中的酸性環境。
根據本發明，如5.1章節所述制備的激活的酵母細胞可以在具有表5所示成分的培養基中進一步培養。
表5 (/1000ml培養基)
該過程可以根據需要按比例增加或減少。
動物例如豬的胃液，可以得自新鮮屠宰動物胃內容物的液體部分。將胃內容物在無菌條件下過濾，以獲得清澈液體，在使用前可在4℃貯存。
野棗汁是將每克碾碎的野棗與5ml水混合經過濾而制備。野山楂汁是將每克碾碎的野山楂與5ml水混合經過濾而制備。
將酵母細胞混合物在系列電磁場中培養大約48-96小時。根據所包括的酵母菌株，每個電磁場頻率相應于5.1章節所述4種頻率范圍之一。如果四種酵母成分均存在，可以使用以下4種頻帶組合7700-7730MHz；6825-6860MHz；8110-8140MHz；8524-8554MHz。所述EM場可以相繼或同時施加。在此程序中通常將所述酵母細胞置于30mV/cm-320mV/cm范圍的EM場強中。
在酵母細胞培養物暴露于EM場時，所述培養物在大約5℃-38℃之間循環的溫度下溫育。例如在一個典型循環中，起始培養溫度為大約37℃，逐漸降低至大約5℃，然后逐漸升高至大約38℃進行再次循環。每個完整循環持續大約3小時。在循環結束時，可以通過在大約3500rpm離心回收激活和馴化的酵母細胞，并貯存于4℃。5.3生物組合物的生產本發明還提供了一種生產包含本發明酵母細胞的生物組合物的方法。優選地，本發明生物組合物包含通過5.1章節所述方法激活并通過5.2章節所述方法馴化的酵母細胞。最優選地，所述生物組合物包含所有4種酵母細胞成分。
為大量生產本發明的生物組合物，可以按比例擴大培養程序。為舉例示出按比例擴大程序，以下闡述了生產1000kg所述生物組合物的方法將4種酵母細胞成分的每一種貯存培養物均加入培養基中，所述培養基包含250升水中100kg淀粉。然后將酵母細胞在各自頻率和120-450mV/cm場強的電磁場中，在35°-38℃培養。將培養程序進行大約48-96小時，或者酵母細胞數目達到大約2×1010/ml。此時，酵母細胞必須貯存在大約15°-20℃，而且如果不立即使用，在24小時內干燥貯存。對4種酵母細胞的每一種重復該程序。為生產包含所有4種酵母細胞組成分的生物組合物，將4種中每一種酵母細胞成分的250升培養基(即共1000升)混合并組合600kg淀粉。
由于酵母細胞和生物組合物不是必需立即使用，因此制備的酵母細胞和生物組合物可以在兩階段干燥程序中干燥。在第一個干燥階段，將酵母細胞在第一個干燥器中在不超過65℃，不超過10分鐘的條件下干燥，以便酵母細胞迅速靜止。然后將酵母細胞置入第二個干燥器中，并在不超過70℃，不超過30分鐘的條件下干燥，以進一步除去水分。在這兩個階段后，水含量應低于5％。優選在這兩個干燥階段遵守溫度和干燥時間，以便酵母細胞不喪失其活力和功能。然后將干燥的酵母細胞冷卻至室溫。干燥的酵母細胞還可以在離析器中篩選以選擇優選大小的顆粒。干燥的細胞然后可以置于散裝裝袋機中包裝。6.實施例以下實施例例證了可以用作動物飼養添加劑的一種生物組合物的生產。
所述生物組合物包括以下四種酵母成分Candida utilis HennebergLodder et Kreger Van Rij AS2.281，Saccharomyces cerevisiae AS2.502，Saccharomyces cerevisiae IFFI1277和Geotrichum candidum LinkAS2.361。每種酵母細胞成分均能抑制Serpulina hyodysenteriae感染的發生及降低受感染的豬的死亡率。制備4種酵母細胞成分，如下分別測試將含有大約105細胞/ml的AS2.281的一種起始培養物置于如圖1所示的容器(2)中，其中含有表1所示成分的培養基。最初，在無電磁場的情況下將酵母細胞在36±1℃培養約24個小時。然后，在相同培養基中，在36±1℃，將酵母細胞按指定順序在一系列的八個電磁場中培養7715MHz，75mV/cm，10小時；7717MHz，75mV/cm，10小時；7720MHz，75mV/cm，24小時；7724MHz，75mV/cm，48小時；7715MHz，225mV/cm，10小時；7717MHz，225mV/cm，10小時；7720MHz，225mV/cm，12小時；及7724MHz，225mV/cm，24小時。如5.2章節所述，將酵母細胞在下述兩個電磁場中，通過在豬胃液和山楂汁中進一步培養以馴化7720MHz，225mV/cm，12小時；7724MHz，225mV/cm，24小時。在最后培養階段之后，酵母細胞既可以在24小時內使用以生產所述生物組合物，也可以如5.3章節所述干燥貯存。
如下測試該第一種酵母細胞成分對動物的有益作用用360頭豬進行測試(Yu-No.3品種)，所有豬均大約4月齡，體重在≤10％內。將動物分成四組，每組90頭豬。將所有四組動物均注射導致豬痢疾的5×106Serpulina hyodysenteriae。第一組動物(A組)喂食表6所示包含抗生素混合物的飲食。
表6含抗生素的動物飼料成分
B組動物喂食包含激活的AS2.281酵母細胞的飼料。所述激活的酵母細胞存在于一種添加劑中，所述添加劑是將所述干燥的細胞與沸石粉(小于200目)以大約109個酵母細胞/g沸石粉的比率混合制備。針對每995kg基本飼料，加入5kg所述飼料添加劑，產生含有0.5％重添加劑或5×1012個酵母細胞的改良飼料。第三組動物(C組)喂食含有添加劑的飼料，所述添加劑與B組所用添加劑相同制備，除了AS2.281酵母細胞未被激活。D組動物喂食既無抗生素又無酵母添加劑的基本飲食。10周后，各組動物的健康狀況示于下表7。
表7用不同飲食喂養的動物健康狀況
為制備第二種成分，將含有大約105細胞/ml的AS2.502的一種起始培養物置于如圖1所示的容器(2)中，其中含有表2所示成分的培養基。最初，在無電磁場的情況下將酵母細胞在36±1℃培養約22個小時。然后，在相同培養基中，在36±1℃，將酵母細胞按指定順序在一系列的八個電磁場中培養6833MHz，87mV/cm，24小時；6835MHz，87mV/cm，24小時；6842MHz，87mV/cm，10小時；6846MHz，87mV/cm，10小時；6833MHz，232mV/cm，12小時；6835MHz，232mV/cm，12小時；6842MHz，232mV/cm，12小時；及6846MHz，232mV/cm，12小時。如5.2章節所述，將酵母細胞在下述兩個電磁場中，通過在豬胃液和山楂汁中進一步培養以馴化6833MHz，232mV/cm，12小時；6835MHz，232mV/cm，12小時。在最后培養階段之后，酵母細胞既可以在24小時內使用以生產所述生物組合物，也可以如5.3章節所述干燥貯存。
如下測試該第二種酵母細胞成分對動物的有益作用用360頭豬進行測試(Yu-No.3品種)，所有豬均大約4月齡。體重在≤10％內。將動物分成四組，每組90頭豬。將所有四組動物均注射導致豬痢疾的5×106Serpulina hyodysenteriae。第一組動物(A組)喂食表8所示包含抗生素混合物的飲食。
表8含有抗生素的動物飼料成分
B組動物喂食包含激活的AS2.502酵母細胞的飼料。所述激活的酵母細胞存在于一種添加劑中，所述添加劑是將所述干燥的細胞與沸石粉(小于200目)以大約109個酵母細胞/g沸石粉的比率混合制備。每995kg基本飼料加入5kg所述飼料添加劑，產生含有0.5％重添加劑的改良飼料。第三組動物(C組)喂食含有添加劑的飼料，所述添加劑與B組所用添加劑相同制備，除了AS2.502酵母細胞未被激活。D組動物喂食既無抗生素又無酵母添加劑的基本飲食。10周后，各組動物的健康狀況示于下表9.
表9用不同飲食喂養的動物健康狀況
為制備第三種成分，將含有大約105細胞/ml的IFFI1277的一種起始培養物置于如圖1所示的容器(2)中，其中含有表3所示成分的培養基。最初，在無電磁場的情況下將酵母細胞在36±1℃培養約33個小時。然后，在相同培養基中，在36±1℃，將酵母細胞按指定順序在一系列的八個電磁場中培養8120MHz，102mV/cm，10小時；8122MHz，102mV/cm，10小時；8126MHz，102mV/cm，18小時；8132MHz，102mV/cm，18小時；8120MHz，235mV/cm，10小時；8122MHz，235mV/cm，10小時；8126MHz，235mV/cm，22小時；及8132MHz，235mV/cm，22小時。如5.2章節所述，將酵母細胞在下述兩個電磁場中，通過在豬胃液和山楂汁中進一步培養以馴化8126MHz，235mV/cm，22小時；8132MHz，235mV/cm,22小時。在最后培養階段之后，酵母細胞既可以在24小時內使用以生產所述生物組合物，也可以如5.3章節所述干燥貯存。
如下測試該第三種酵母細胞成分對動物的有益作用用360頭豬進行測試(Yu-No.3品種)，均大約4月齡。體重在≤10％內。將動物分成四組，每組90頭豬。將所有四組動物均注射導致豬痢疾的5×106Serpulina hyodysenteriae。第一組動物(A組)喂食表10所示包含抗生素混合物的飲食。
表10含有抗生素的動物飼料成分
B組動物喂食包含激活的IFFI1277酵母細胞的飼料。所述激活的酵母細胞存在于一種添加劑中，所述添加劑是將所述干燥的細胞與沸石粉(小于200目)以大約109個酵母細胞/g沸石粉的比率混合制備。每995kg基本飼料加入5kg所述飼料添加劑，產生含有0.5％重添加劑的改良飼料。第三組動物(C組)喂食含有添加劑的飼料，所述添加劑與B組所用添加劑相同制備，除了IFFI1277酵母細胞未被激活。D組動物喂食既無抗生素又無酵母添加劑的基本飲食。10周后，各組動物的健康狀況示于下表11。
表11用不同飲食喂養的動物健康狀況
為制備第四種成分，將含有大約105細胞/ml的AS2.361的一種起始培養物置于如圖1所示的容器(2)中，其中含有表4所示成分的培養基。最初，在無電磁場的情況下將酵母細胞在36±1℃培養約35個小時。然后，在相同培養基中，在36±1℃，將酵母細胞按指定順序在一系列的八個電磁場中培養8528MHz，98mV/cm，32小時；8534MHz，98mV/cm，32小時；8539MHz，98mV/cm，10小時；8544MHz，98mV/cm，10小時；8528MHz，235mV/cm，16小時；8534MHz，235mV/cm，16小時；8539MHz，235mV/cm，10小時；及8544MHz，235mV/cm，10小時。如5.2章節所述，將酵母細胞在下述兩個電磁場中，通過在豬胃液和山楂汁中進一步培養以馴化8528MHz，235mV/cm，16小時；8534MHz，235mV/cm，16小時。在最后培養階段之后，酵母細胞既可以在24小時內使用以生產所述生物組合物，也可以如5.3章節所述干燥貯存。
如下測試該第四種酵母細胞成分對動物的有益作用用360頭豬進行測試(Yu-No.3品種)，均大約4月齡。體重在≤10％內。將動物分成四組，每組90頭豬。將所有四組動物均注射導致豬痢疾的5×106Serpulina hyodysenteriae。第一組動物(A組)喂食表12所示包含抗生素混合物的飲食。
表12含有抗生素的動物飼料成分
B組動物喂食包含激活的AS2.361酵母細胞的飼料。所述激活的酵母細胞存在于一種添加劑中，所述添加劑是將所述干燥的細胞與沸石粉(小于200目)以大約109個酵母細胞/g沸石粉的比率混合制備。每995kg基本飼料加入5kg所述飼料添加劑，產生含有0.5％重添加劑的改良飼料。第三組動物(C組)喂食含有添加劑的飼料，所述添加劑與B組所用添加劑相同制備，除了AS2.361酵母細胞未被激活。D組動物喂食既無抗生素又無酵母添加劑的基本飲食。10周后，各組動物的健康狀況示于下表13。
表13用不同飲食喂養的動物健康狀況
包含所有4種酵母細胞成分的生物飼料添加劑通過將每種成分的干燥細胞與沸石粉(小于200目)以大約1×109個酵母細胞/g沸石粉的比率混合制備。每995kg基本飼料加入5kg酵母和沸石粉的混合物，產生含有0.5％重酵母和沸石粉的一種添加劑。用360頭豬(Yu-No.3品種)測試其對動物的有益作用，所有動物均大約4月齡。體重在≤10％內。將動物分成四組，每組90頭豬。將所有四組動物均注射導致豬痢疾的5×106Serpulina hyodysenteriae。第一組動物(A組)喂食表14所示包含抗生素混合物的飲食。
表14含有抗生素的動物飼料成分
B組動物喂食包含如上述制備的生物飼料添加劑的飼料。第三組動物(C組)喂食含有添加劑的飼料，所述添加劑與B組所用添加劑相同制備，除了所述酵母細胞未被激活。D組動物喂食既無抗生素又無生物飼料添加劑的基本飲食。10周后，各組動物的健康狀況示于下表15。
表15用不同飲食喂養的動物健康狀況
以上結果表明本發明生物組合物是一種有價值的動物飼料添加劑，其可以用于保持動物健康，及幫助動物從感染中康復。
本發明不限于具體的實施方案的范圍，所述實施方案只是舉例示出了本發明的各個方面，其功能等價方法和成分包含在本發明范圍內。本領域技術人員通過前述教導和所附權利要求書，可以對本發明加以各種修改。這種修改應在所附權利要求范圍內。
權利要求
1.一種生物組合物，其包含至少一種以下酵母細胞成分(a)含有大量酵母細胞的第一種酵母細胞成分，其通過將所述酵母細胞在一個或一系列電磁場中培養而制備，電磁場頻率為7700-7730MHz，場強為3.5-230mV/cm；(b)含有大量酵母細胞的第二種酵母細胞成分，其通過將所述酵母細胞在一個或一系列電磁場中培養而制備，電磁場頻率為6825-6860MHz，場強為6.5-260mV/cm；(c)含有大量酵母細胞的第三種酵母細胞成分，其通過將所述酵母細胞在一個或一系列電磁場中培養而制備，電磁場頻率為8110-8140MHz，場強為10.5-290mV/cm；(d)含有大量酵母細胞的第四種酵母細胞成分，其通過將所述酵母細胞在一個或一系列電磁場中培養而制備，電磁場頻率為8524-8554MHz，場強為15-320mV/cm。
2.權利要求1的生物組合物，其包含(a)，(b)，(c)和(d)的酵母細胞成分。
3.權利要求1或2的生物組合物，其中酵母細胞是Saccharomyces，Candida,和Geotrichum細胞。
4.權利要求1或2的生物組合物，其中所述酵母細胞是Saccharomyces cerevisiae，Candida utilis，Geotrichum candidum細胞。
5.權利要求1或2的生物組合物，其中所述酵母細胞是干燥的。
6.一種動物飼料組合物，其包含權利要求1或2的生物組合物和豬飼料。
7.權利要求6的動物飼料組合物，其中所述生物組合物還包含沸石粉，比率為大約109酵母細胞/1g沸石粉。
8.權利要求7的動物飼料組合物，其中占0.5％重的是權利要求1或2的生物組合物。
9.一種制備生物組合物的方法，所述方法包括在一個電磁場或一系列電磁場中培養大量酵母細胞，所述電磁場頻率為7700-7730MHz，場強為3.5-230mV/cm。
10.權利要求9的方法，其中所述方法還包括在一或多個電磁場中，在包含豬胃液、野山楂汁和野棗汁的培養基中培養所述大量酵母細胞。
11.一種制備生物組合物的方法，所述方法包括在頻率為6825-6860MHz，場強為6.5-260mV/cm的一個或一系列電磁場中培養所述大量酵母細胞。
12.權利要求11的方法，其中所述方法還包括在一或多個電磁場中，在含有豬胃液、野山楂汁和野棗汁的培養基中培養所述大量酵母細胞。
13.一種制備生物組合物的方法，所述方法包括在頻率為8110-8140MHz，場強為10.5-290mV/cm的一個或一系列電磁場中培養所述大量酵母細胞。
14.權利要求13的方法，其中所述方法還包括在一或多個電磁場中，在含有豬胃液、野山楂汁和野棗汁的培養基中培養所述大量酵母細胞。
15.一種制備生物組合物的方法，所述方法包括在頻率為8524-8554MHz，場強為15-320mV/cm的一個或一系列電磁場中培養所述大量酵母細胞。
16.權利要求15的方法，其中所述方法還包括在一或多個電磁場中，在含有豬胃液、野山楂汁和野棗汁的培養基中培養所述大量酵母細胞。
17.一種生產動物飼料組合物的方法，所述方法包括(a)制備權利要求1的一或多種酵母細胞成分，(b)將(a)酵母細胞成分干燥，及(c)將所述干燥的酵母細胞與沸石粉和豬飼料混合。
18.權利要求17的方法，其中所述干燥步驟包括(i)在不超過65℃溫度下干燥一段時間，由此所述酵母細胞休眠；及(ii)在不超過70℃溫度下干燥一段時間，以使水分降低至5％以下。
19.一種降低豬傳染病發生率的方法，包括在一段時間內為豬喂食一種動物飼料組合物，所述動物飼料組合物包含至少一種以下酵母細胞成分(a)含有大量酵母細胞的第一種酵母細胞成分，其通過將所述酵母細胞在一個或一系列電磁場中培養而制備，電磁場頻率為7700-7730MHz，場強為3.5-230mV/cm；(b)含有大量酵母細胞的第二種酵母細胞成分，其通過將所述酵母細胞在一個或一系列電磁場中培養而制備，電磁場頻率為6825-6860MHz，場強為6.5-260mV/cm；(c)含有大量酵母細胞的第三種酵母細胞成分，其通過將所述酵母細胞在一個或一系列電磁場中培養而制備，電磁場頻率為8110-8140MHz，場強為10.5-290mV/cm；(d)含有大量酵母細胞的第四種酵母細胞成分，其通過將所述酵母細胞在一個或一系列電磁場中培養而制備，電磁場頻率為8524-8554MHz，場強為15-320mV/cm。
20.權利要求19的方法，其中所述動物飼料組合物包含(a)，(b)，(c)和(d)酵母細胞成分，和沸石粉。
21.權利要求19的方法，其中所述酵母細胞是Saccharomycescerevisiae，Candida utilis，和Geotrichum candidum細胞。
22.權利要求19的方法，其中所述酵母細胞成分和沸石粉占所述動物飼料組合物重量的5％。
23.權利要求1或2的組合物，其中用于制備第一種酵母細胞成分的大量酵母細胞包括Candida utilis Henneberg Lodder et Kreger VanRij AS2.281細胞，其中用于制備第二種酵母細胞成分的大量酵母細胞包括Saccharomyces cerevisiae AS2.502細胞，其中用于制備第三種酵母細胞成分的大量酵母細胞包括Saccharomyces cerevisiae IFFI1277細胞，其中用于制備第四種酵母細胞成分的大量酵母細胞包括Geotrichum candidum Link AS2.361細胞。
24.權利要求6的動物飼料組合物，其中用于制備第一種酵母細胞成分的大量酵母細胞包括Candida utilis Henneberg Lodder et KregerVan Rij AS2.281細胞，其中用于制備第二種酵母細胞成分的大量酵母細胞包括Saccharomyces cerevisiae AS2.502細胞，其中用于制備第三種酵母細胞成分的大量酵母細胞包括Saccharomyces cerevisiaeIFFI1277細胞，其中用于制備第四種酵母細胞成分的大量酵母細胞包括Geotrichum candidum Link AS2.361細胞。
全文摘要
本發明涉及包含酵母細胞的生物組合物，其可以改善豬的免疫功能。本發明還涉及生產所述生物組合物的方法，及所述生物組合物作為豬飼料添加劑的應用方法。
文檔編號A23K1/18GK1475138SQ0314913
公開日2004年2月18日 申請日期2003年6月18日 優先權日2002年6月18日
發明者張令玉 申請人:歐亞生物科技有限公司