專利名稱：一種多效微生物飼料添加劑及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物飼料添加劑及其制備方法，尤其適用作禽畜、水產動物的飼料添加劑。
背景技術：
抗生素作為飼料添加劑使用已有50年的歷史，為動物的生長和健康做出了巨大貢獻，是目前飼料中用量最大、最廣的添加劑之一。自1975年日本最早報道病原菌抗藥性現象以來，人們發現，由于大量和濫用抗生素已給動物本身、動物產品和環境帶來一系列的問題。主要表現在，動物病原菌產生抗藥性，導致抗生素用量的增加，引起內源性感染和二重感染。特別是長期使用會造成消化道內本身微生態失調和環境的污染。同時抗生素在產品中的殘留還直接影響人類的免疫和健康。飼料微生物添加劑因具有安全、環保、無副作用和抗病、促生長等特點，而受到廣大學者的重視，并已從微生態學理論、作用機理、菌種的篩選及應用等多方面進行了大量的研究，取得了可喜的成果。作為抗生素類添加劑的替代品，飼料微生物添加劑在國內外都已得到廣泛的應用，取得了非常理想的效果，是最有前途的飼料添加劑之一。飼料微生物添加劑屬于微生態制劑或益生素的范疇。其研制開發以動物微生態學(包括微生態平衡理論，微生態失調理論，微生態營養理論和微生態防治理論)為理論依據。飼料微生物添加劑是指攝入動物體內參與腸內微生物平衡的活性微生物培養物，它能通過直接增強動物對腸內有害微生物群落的抑制作用，或者通過增強非特異性免疫功能來預防疾病，并間接起到促進動物生長和提高飼料轉化率的作用。眾多實驗證實了具有提高增重、改善飼料轉化效率、促進畜禽機體免疫功能、降低死亡率及改善環境等效果。如提高肉雞成活率、增重及飼料效率；改善蛋雞生存環境，提高產蛋性能和蛋的品質；提高仔豬成活率和生長速度，有效防止仔豬腹瀉；提高生育肥豬日增重，在母豬日糧中添加可使斷奶仔豬數和斷奶體重顯著提高。在水產養殖上，微生物飼料添加劑能提高羅氏對蝦幼苗的成活率，增強成蝦、大西洋鮭對病原菌的抵抗力；而且添加劑中的光合細菌和化能異養菌能夠降解進入養殖池塘中的各種有機廢物，消除有毒因子，穩定pH值，平衡菌相與藻相，營造良好的水生環境，達到預防疾病、健康養殖的效果。目前使用的益生素主要是芽孢桿菌、乳酸桿菌、糞鏈球菌等單一菌種或復合菌種的制劑。
微生物飼料添加劑采用的菌種主要有乳酸菌類(Lacticacid bacteria)、酵母菌類(Yeasts)和芽孢桿菌類(Bacillus)。
用于飼料添加劑的芽孢桿菌是一種需氧的非致病菌。它在腸道或貯藏過程中都以內生子的形式存在，不消耗飼料養分，可保持飼料的質量。進入腸道后，在腸道上部迅速復活，復活率接近100％。它能使空腸內的pH值下降，氨濃度降低，并消耗大量的氧，維持腸道厭氧環境，抑制病菌的生長，維持腸道正常生態平衡，并有平衡和穩定乳酸菌的作用。它能產生活性很高的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及多種氨基酸。芽孢桿菌抗逆性強，具有耐高溫、耐酸堿、耐擠壓等特點，可耐受顆粒飼料加工的影響。
乳酸菌類是一種可以分解糖類產生乳酸的無芽孢革蘭氏陽性菌，可以厭氧、兼性厭氧生長。乳酸菌在飼料添加劑中具有重要的地位，在美國FAD(1989)公布的40多種飼用微生物中有近30種是乳酸菌。它耐酸，在pH為3.0～4.5時仍可生長，適應于胃腸的酸性環境。乳酸菌是魚腸道的正常菌群，在魚體腸道系統定植，在體內通過生物拮抗，拮抗革蘭氏陰性致病菌，維持腸道中正常的生態平衡，可降低腸道pH值，阻止和抑制有害物質，增強抗感染能力。活菌體內和代謝產物中含有較高的超氧化物歧化酶(SOD)，能增強動物的體液免疫和細胞免疫，增強機體的免疫調節活性，促進生長。但該類菌在生長過程中，不形成芽孢，抗逆性差，易失活，難保藏，所以在飼料工業中的應用受到一定的限制。目前有些市售產品采用微膠囊包被技術，提高了其對環境的抗逆性，但生產成本也相應提高。
酵母菌是喜生長在偏酸性環境的需氧菌，在腸道內大量繁殖。在水產業中可以使用從魚體、水體分離到的酵母，主要有假絲酵母屬(Candida)等。飼料中也可以使用釀造酵母(Brewer’s yeast)和面包酵母(Baker’s yeast)。
發明內容
本發明的目的在于開發一種性能更優越的微生物飼料添加劑及其制備方法。
本發明利用乳酸芽孢桿菌除了具有普通乳酸菌共同的種種有益特性外，還兼有芽孢桿菌的特性，通過特殊的發酵培養制備出含乳酸芽孢桿菌菌數高、芽孢形成率高的發酵液作為飼料添加劑，性能優于現有的微生物飼料添加劑從而實現了本發明的目的。
本發明多效微生物飼料添加劑的技術特征在于含有由下述制備方法得到的含有乳酸芽孢桿菌的發酵液，所述的制備方法包括如下幾個步驟(a)斜面菌種活化將保藏斜面種乳酸芽孢桿菌分別劃線于斜面種培養基上進行活化，所述的斜面種培養基中含蛋白胨10～20.0g/L，酵母膏或牛肉膏或玉米漿3.0～10.0g/L，葡萄糖5～15.0g/L，瓊脂18～22g/L，其余為水，pH7.0～7.2，常規方法滅菌；(b)菌種的一級液體活化將上述培養好的斜面種用接種環分別接種于一級液體培養基中進行培養，使液體種的菌數達1.0×109～5.0×109CFU/mL以上，所述的一級液體培養基中含蛋白胨15.0～25g/L， 酵母膏或牛肉膏或玉米漿5.0～15.0g/L，葡萄糖10.0～30.0g/L，鈣鹽5.0～15g/L，硫酸鎂0.1～1.0g/L，錳鹽0.01～0.1g/L，pH7.0～7.5，其余為水，常規方法滅菌；
(c)種子罐中的培養將上述分別培養好的一級液體種搖勻后在無菌條件下按體積分數1％～5％接種量接入種子罐的培養基中，通氣培養24～48h，待菌數達1.0×109～5.0×109CFU/mL以上，停止培養；(d)大發酵罐中的培養將上述分別培養好的乳酸芽孢桿菌種按體積分數10％～20％的接種量接入發酵罐的培養基中進行培養，溫度37～42℃，轉速180～250r/min，按每m3培養基的空氣為20～30m3/h進行通氣培養48～60h，發酵16～40h后開始補加已滅菌的葡萄糖濃縮液，總補加量為體積分數1％～4％，待菌數達1.0×109～5.0×109CFU/mL以上，停止發酵培養；(c)和(d)步驟中所述的培養基含蛋白胨20.0～30.0g/L，酵母膏或牛肉膏或玉米漿5.0～15g/L，葡萄糖10.0～40.0g/L，鈣鹽5.0～15.0g/L，硫酸鎂0.1～0.5g/L，錳鹽0.01～0.1g/L，其余為水，pH7.0～7.5，常規方法滅菌。
(b)、(c)和(d)步驟中所述的鈣鹽可以是碳酸鈣、硫酸鈣、硝酸鈣等，最好是碳酸鈣，所述的錳鹽可以是硫酸錳、氯化錳、硝酸錳等，最好是硫酸錳。
本發明多效微生物飼料添加劑中最好還含有質量分數2％礦石粉、質量分數2％沸石粉、質量分數2％膨潤土、質量分數5％檸檬酸。
本發明所用的乳酸芽孢桿菌也叫凝結芽孢桿菌，菌號為Bacillus coagulansAB92064，保藏于CCTCC，中國典型培養物保藏中心。這個菌種在《中國典型培養物保藏中心培養物目錄》(陶天申.武漢大學，1998.25.)上公開記載。
本發明多效微生物飼料添加劑的制備方法包括上述(a)、(b)、(c)和(d)步驟。
本發明多效微生物飼料添加劑的制備方法最好在(d)步驟產生的成熟的發酵液中添加質量分數2％礦石粉、質量分數2％沸石粉、質量分數2％膨潤土、質量分數5％檸檬酸，攪拌、混合均勻，即制成多效微生物飼料添加劑。
這種多效微生物飼料添加劑可以按質量分數1％～3％的比例與飼料或餌料混合，用于喂養動物，增加飼養動物對飼料的吸收和提高飼養動物的抗病能力。
本發明具有如下優點。
1、本發明所用的乳酸芽孢桿菌作為理想的微生物添加劑的菌種具備如下特性(1)有良好的安全性，所用菌種不會使人和動物致病，不與病原微生物在自然條件下產生雜交種；(2)易于培養，繁殖速度快；(3)有良好的定植能力，在低pH值和膽汁中可以存活，并能植入腸粘膜；(4)在發酵過程中能產生酸和過氧化氫等物質；(5)能合成對大腸桿菌、弧菌、氣單胞菌等水產動物腸道致病菌的抑制物而不影響自己的活性，有利于促進宿主的生長發育及提高抗病能力；(6)在整個制備和保存過程中能保持生命活力，混入飼料后穩定性好；2、本發明加入的膨潤土、沸石粉等含有大量的微量礦物元素，它可以對飼養動物發揮以下作用(1)對免疫器官和免疫細胞的直接作用；(2)輔助因子的作用；(3)抑菌作用；(4)微量礦物元素作為免疫增強劑的作用、微量礦物元素的抗氧化與防衰老作用、微量礦物元素參與補體反應、微量礦物元素可減輕應激反應。
3、因為動物胃為酸性環境，其中的細菌多為產酸菌和耐酸菌，幼年動物分泌胃酸能力較弱，而使外來菌容易存活和繁殖。本發明加入的檸檬酸作為酸化劑可以提高胃液酸性，促進乳酸芽孢桿菌、乳酸菌等耐酸菌大繁殖，使之在胃中保持優勢菌的地位，而大腸桿菌等外來菌則不能適應酸性環境，并受到乳酸菌等的“排擠”而不能定植存活，因此可以降低動物病理性腹瀉的發生率。酸化劑還能幫助機調整免疫系統反應，增強家禽的抗病力。
4、本發明的制備方法使發酵液中的乳酸芽孢桿菌菌數達1.0×109CFU/mL以上，芽孢形成率在70％以上。由于芽孢形成率高，使得乳酸芽孢桿菌AB92064能順利穿過胃部而定植于腸道，乳酸芽孢桿菌除具有普通乳酸菌共同的種種有益特性外，還兼有芽孢桿菌的特性，在抗干燥，抗高溫，抗酸度方面優于普通乳酸菌，因此可在腸道內大量定植。該菌對飼養動物胃腸道具有明顯的調理功能，能增加飼養動物對飼料的吸收和提高飼養動物的抗病能力。
具體實施例方式
實施例1用2m3發酵罐生產多效微生物飼料添加劑包括以幾個步驟(a)斜面菌種活化用接種針將保藏的菌種乳酸芽孢桿菌AB92064接種一環劃線于新配制的斜面種培養基上，斜面種培養基的化學組成如下(g/L)蛋白胨15.0，酵母膏5.0，葡萄糖10.0，瓊脂20，其余為水，pH7.0；每個種各接支，于40℃培養48小時；(b)菌種的一級液體培養將培養好的斜面種用接種環分別接種一環于一級液體活化培養基中，一級液體培養基化學組成如下(g/L)蛋白胨20.0，酵母膏10.0，葡萄糖20.0，CaCO310.0，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·4H2O 0.05，pH7.2；培養基裝于1000mL三角瓶中，三角瓶裝量為40mL，每個種各接4瓶，于40℃往復式搖床振蕩培養36～48小時，搖床轉速為120r/min，沖程為75mm，使液體種的菌數達1.0×109CFU/mL以上；(c)250L種子罐中的培養將上述分別培養好的一級液體種搖勻后在無菌條件下混合在一個無菌1L的接中瓶中，然后接入種子罐進行培養，種子罐培養基的化學組成如下(g/L)蛋白胨25.0，酵母膏10.0，葡萄糖40.0，CaCO310.0，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.05，其余為水，pH7.2；250L種子罐裝160L培養基，38℃，轉速200r/min，風量為2m3/h，進行通氣培養，保持罐壓0.1MPa，待菌數達1.0×109CFU/mL以上，停止培養；(d)2m3大發酵罐中的培養將上述分別培養好的種160L接入裝有已消毒好培養基的大發酵罐中進行培養，發酵培養基組分(g/L)蛋白胨25.0，酵母膏10.0，葡萄糖40.0，CaCO310.0，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·4H2O 0.05，其余為水，pH7.2；2m3大發酵罐裝1300L培養基，38～40℃，轉速220r/min，風量為空氣140m3/h，發酵24小時，補加500g/L無菌葡萄糖液28L，發酵48小時，再補加500g/L無菌葡萄糖液28L，待菌濃度達1.0×109CFU/mL以上，停止發酵培養；(e)制成成品停止發酵培養后，首先關閉通風管，關掉攪拌電機，打開人孔，加入礦石粉28公斤、沸石粉28公斤、膨潤土28公斤、檸檬酸70L；再蓋上人孔，打開攪拌電機，以160r/min充分攪拌10分鐘，降低攪拌轉速至80r/min，開始放罐，用2條軟管直接、快速放入不同體積的包裝罐中，即制成成品。
實施例2產品應用效果試驗實施例1制成的多效微生物飼料添加劑，進行對鯉魚和草魚進行應用試驗，結果如下15～17g鯉魚魚苗餌料內加入質量分數0.1％本發明的魚微生物添加劑組，其尾均增重率和成活率分別較對照組多8.5％和14.1％；尾重49～53g鯉魚，飼料中加入質量分數0.1％本發明的魚微生物添加劑組，其尾均增重率較對照組多8.64％；尾重51～61g的鯉魚與尾重98～116g的草魚混養，餌料內加入質量分數0.1％本發明的魚微生物添加劑組鯉魚尾均增重率和成活率較對照組分別多14.5％和8.5％，草魚尾均增重率和成活率較對照組分別多30.2％和44.6％；對高、中、低三個餌料營養水平比較試驗，以消化能3800大卡/公斤和粗蛋白32％的中營養水平組的尾均增重率最好，較高營養水平組多31％，比低營養水平組多0.13％；作為豬飼料的添加劑喂養苗豬，有效地防治仔豬黃白痢，降低腹瀉頻率65％以上，提高仔豬飲料轉化率16％，日增重提高21％。在生長肥育豬全期使用時，平均日增重至少可達780g以上，比對照組提高15％以上；作為雞飼料的添加劑喂養蛋雞和肉雞，可使蛋雞產蛋率提高15％～20％左右，可使肉雞同期增重約8％，提高苗雞的成活率，縮短飼養周期，提前出欄，降低料肉比；而作為魚蝦的飼料添加劑，可使對蝦成苗率提高30％左右。結果表明乳酸芽孢桿菌作為微生物添加劑具有安全性，并能促進生長、提高餌料利用率和養殖成活率，而且在中或低等營養水平的飼料中添加多效微生物飼料添加劑的作用表現得更加明顯，效果優于高營養水平，因此本發明是一種理想的飼料添加劑。
權利要求
1.一種多效微生物飼料添加劑，其特征在于含有由下述制備方法得到的含有乳酸芽孢桿菌的發酵液，所述的制備方法包括如下幾個步驟(a)斜面菌種活化將保藏斜面種乳酸芽孢桿菌分別劃線于斜面種培養基上進行活化，所述的斜面種培養基中含蛋白胨10～20.0g/L，酵母膏或牛肉膏或玉米漿3.0～10.0g/L，葡萄糖5～15.0g/L，瓊脂18～22g/L，其余為水，pH 7.0～7.2，常規方法滅菌；(b)菌種的一級液體活化將上述培養好的斜面種用接種環分別接種于一級液體培養基中進行培養，使液體種的菌數達1.0×109～5.0×109CFU/mL以上，所述的一級液體培養基中含蛋白胨15.0～25g/L，酵母膏或牛肉膏或玉米漿5.0～15.0g/L，葡萄糖10.0～30.0g/L，鈣鹽5.0～15g/L，硫酸鎂0.1～1.0g/L，錳鹽0.01～0.1g/L，pH 7.0～7.5，其余為水，常規方法滅菌；(c)種子罐中的培養將上述分別培養好的一級液體種搖勻后在無菌條件下按體積分數1％～5％接種量接入種子罐的培養基中，通氣培養24～48h，待菌數達1.0×109～5.0×109CFU/mL以上，停止培養；(d)大發酵罐中的培養將上述分別培養好的乳酸芽孢桿菌種按體積分數10％～20％的接種量接入發酵罐的培養基中進行培養，溫度37～42℃，轉速180～250r/min，按每m3培養基的空氣為20～30m3/h進行通氣培養48～60h，發酵16～40h后開始補加已滅菌的葡萄糖濃縮液，總補加量為體積分數1％～4％，待菌數達1.0×109～5.0×109CFU/mL以上，停止發酵培養；所述的(c)和(d)步驟中所述的培養基含蛋白胨20.0～30.0g/L，酵母膏或牛肉膏或玉米漿5.0～15g/L，葡萄糖10.0～40.0g/L，鈣鹽5.0～15.0g/L，硫酸鎂0.1～0.5g/L，錳鹽0.01～0.1g/L，其余為水，pH 7.0～7.5，常規方法滅菌。
2.一種多效微生物飼料添加劑，其特征在于所述的鈣鹽是碳酸鈣，所述的錳鹽是硫酸錳。
3.根據權利要求1，2所述的一種多效微生物飼料添加劑，其特征在于含有質量分數2％礦石粉、質量分數2％沸石粉、質量分數2％膨潤土、質量分數5％檸檬酸。
4.一種多效微生物飼料添加劑的制備方法，其特征在于包括如下的幾個步驟(a)斜面菌種活化將保藏斜面種乳酸芽孢桿菌分別劃線于斜面種培養基上進行活化，所述的斜面種培養基中含蛋白胨10～20.0g/L，酵母膏或牛肉膏或玉米漿3.0～10.0g/L，葡萄糖5～15.0g/L，瓊脂18～22g/L，其余為水，pH 7.0～7.2，常規方法滅菌；(b)菌種的一級液體活化將上述培養好的斜面種用接種環分別接種于一級液體培養基中進行培養，使液體種的菌數達1.0×109～5.0×109CFU/mL以上，所述的一級液體培養基中含蛋白胨15.0～25g/L，酵母膏或牛肉膏或玉米漿5.0～15.0g/L，葡萄糖10.0～30.0g/L，鈣鹽5.0～15g/L，硫酸鎂0.1～1.0g/L，錳鹽0.01～0.1g/L，pH 7.0～7.5，其余為水，常規方法滅菌；(c)種子罐中的培養將上述分別培養好的一級液體種搖勻后在無菌條件下按體積分數1％～5％接種量接入種子罐的培養基中，通氣培養24～48h，待菌數達1.0×109～5.0×109CFU/mL以上，停止培養；(d)大發酵罐中的培養將上述分別培養好的乳酸芽孢桿菌種按體積分數10％～20％的接種量接入發酵罐的培養基中進行培養，溫度37～42℃，轉速180～250r/min，按每m3培養基的空氣為20～30m3/h進行通氣培養48～60h，發酵16～40h后開始補加已滅菌的葡萄糖濃縮液，總補加量為體積分數1％～4％，待菌數達1.0×109～5.0×109CFU/mL以上，停止發酵培養；所述的(c)和(d)步驟中所述的培養基含蛋白胨20.0～30.0g/L，酵母膏或牛肉膏或玉米漿5.0～15g/L，葡萄糖10.0～40.0g/L，鈣鹽5.0～15.0g/L，硫酸鎂0.1～0.5g/L，錳鹽0.01～0.1g/L，其余為水，pH 7.0～7.5，常規方法滅菌。
5.一種多效微生物飼料添加劑的制備方法，其特征在于所述的鈣鹽是碳酸鈣，所述的錳鹽是硫酸錳。
6.根據權利要求4，5所述的一種多效微生物飼料添加劑的制備方法，其特征在于在所述的(d)步驟產生的成熟的發酵液中添加質量分數2％礦石粉、質量分數2％沸石粉、質量分數2％膨潤土、質量分數5％檸檬酸，攪拌、混合均勻，即制成多效微生物飼料添加劑。
全文摘要
本發明涉及一種微生物飼料添加劑及其制備方法。其特征在于利用乳酸芽孢桿菌除了具有普通乳酸菌共同的種種有益特性外，還兼有芽孢桿菌的特性，通過特殊的發酵培養制備出含乳酸芽孢桿菌菌數高、芽孢形成率高的發酵液作為飼料添加劑。該添加劑對飼養動物胃腸道具有明顯的調理功能，能增加飼養動物對飼料的吸收和提高飼養動物的抗病能力，尤其適用作禽畜、水產動物的飼料添加劑。
文檔編號A23K1/16GK1579200SQ0314002
公開日2005年2月16日 申請日期2003年8月1日 優先權日2003年8月1日
發明者施慶珊, 許虹, 林小平, 吳家俊, 李良秋, 邱玉棠 申請人:廣東省微生物研究所