專利名稱：“細胞-組織”的培養方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體地說是“細胞-組織”的培養方法。
背景技術：
植物細胞大量培養技術是在植物組織培養快速繁殖的基礎上發展起來的。具體的做法就是把植物細胞從試管或三角瓶內轉移到微生物發酵的大型發酵罐里，給予適當的條件進行培養，使植物細胞像微生物一樣在發酵罐里大量繁殖，然后從大量增殖的植物細胞內直接提取有用的物質。
目前，世界各國如美國、日本、德國、俄羅斯、英國等國的科學家、企業界都在加緊研究，密切注視著植物細胞大量培養工作。
我國在植物細胞大量培養技術研究上也取得了很好的成績，在人參、黃連、西洋參、三七等藥用植物細胞大量培養方面取得了不少科研成果。例如，用細胞大量培養技術從人參細胞提取的培養物，主要有效成分的含量達70％左右，比人工栽培的人參的有效成分高得多。
植物組織培養，就是分離植物體的一部分組織，如根、莖段、葉、花、幼胚等，在無菌試管中，配合一定的營養、激素、溫度、光照等條件，使其產生完整植株。由于其條件可以嚴格控制，生長迅速，1個月左右即為一個周期，因此在植物的生產上有重要應用價值。
生物技術是我國、也是世界21世紀重點發展的技術領域。植物細胞大量培養技術雖然自1970年以來取得了不少成果，尤其是細胞繁殖速度快，污染率低，引人矚目。但是無論在細胞的培養成本上，還是工藝的改進上，都存在著很多問題。而組培雖然被稱為快速繁殖，但是它的繁殖速度離我們的理論值和期望值就顯的太慢，而且污染率高，所以大多數組培室無論是數量還是成本都與我們社會要求有很大的差距。為解決細胞培養成本高，組織培養速度慢的問題，是否能找到一種既有細胞培養和組織培養的優點，又能克服細胞培養和組織培養缺點的方法，就成為該發明所要解決的問題。
發明內容
本發明的目的是提供一種能增加繁殖速度、降低成本的“細胞-組織”的培養方法。
本發明的技術方案為先將培養的植物組織在研缽體中加少許液體培養基研磨后接種，進入旋轉式搖床，培養溫度25±1℃，黑暗條件下進行細胞懸浮培養，將增殖的植物細胞懸浮液倒入有濾紙的布氏漏斗，抽去培養液，再用蒸餾水洗滌若干次，對培養的細胞進行細胞生長測定，選取細胞生長進入靜止期的細胞再接入固體培養基進行叢芽增殖培養，選擇生長良好的芽接入生根培養，最后出苗。
以上所述的細胞懸浮液體培養基的配制方法是用MS基礎培養基添加BA0.3～0.6mg/L、NAA 1～5mg/L、LH 0.5～1.5mg/L、蔗糖19～22g/L混合配制而成。
固體培養基的配制方法是用MS基礎培養基添加6BA和NAA分別為0.2～2mg/L、0.1～0.9mg/L。
本發明的“細胞-組織”的培養方法，能把過去組織培養方法增殖植物的速度提高20倍以上，成本下降50％。據統計，中藥的80％來源于植物，而絕大多數藥用植物是采摘野生的，這就意味著總有一天會把野生的藥用植物采光。現在已有上百種藥用植物緊缺或處于瀕危狀態，即使用種子人工栽培的方法生產藥用植物，繁殖數量也是有限的。因此，使用植物“細胞-組織”培養技術，可以使培養的植物種苗生產速度比傳統的組培速度快20倍。
將細胞培養與組織培養有機的結合，充分發揮細胞培養和組織培養的優點，結合成為“細胞-組織”培養就顯出它強大的生命力，也就是本發明的最大創新點，并可以發展成為一個新興的技術領域。
具體實施例方式
實施例1燈盞花(Erigeron breviscapus)的培養1、燈盞花外植體的選擇及培養由高產的親本植株建立的培養物，其后代產量高于由低產的植株所建立的培養物。
A、選擇通過隨機選取燈盞花野生植株20株，測定燈盞乙素含量，如下表(表1)所示
表1 20株燈盞花中燈盞乙素的含量Tab1 The scutellarin content in 20 individual Erigreron breviscapus(mg/g)
選擇燈盞乙素含量最高株(D8＝6.53mg/g)和最低株(D15＝3.15mg/g)進行愈傷組織誘導，建立無性系，分別標記為Dmax和Dmin。
b、培養誘導愈傷組織及燈盞乙素含量測定取燈盞花葉片，用洗潔凈水清洗干凈后，在流水下沖洗10min，然后轉到潔凈工作臺上，吸干水分，先用70％酒精滅菌30s，再轉入0.1％的HgCl2溶液中滅菌6min，無菌蒸餾水沖洗5次，葉柄剪成0.4cm長的小段，葉片剪成0.5×0.5cm2的小塊，接種于愈傷組織誘導培養基MS+6-BA0.2mg/L+NAA2mg/L+蔗糖30g/L，用0.7％的瓊脂固化，高溫滅菌前pH調為5.8，培養溫度25±1℃。外植體接種后一周左右即可見明顯膨大，20d左右形成直徑約1cm左右的愈傷組織。將愈傷組織切割后轉到同樣培養基上進行繼代增殖培養。F1代時，每瓶接種1.0g(DW)愈傷組織(干重0.12g，折干率為88％)，每種愈傷組織各接種10瓶，共1.2g(DW)。以后將增殖的愈傷組織全部接種作為下一次增殖的起始材料，增殖周期為18d。繼代3代后，各取50g(鮮重)，測定燈盞乙素的含量。
表2不同細胞系愈傷組織中燈盞乙素含量DmaxDminF1 F2 F3 F1 F2 F3愈傷組織收獲量(FW)(g/瓶) 29.54 63.34 207.06 24.38 61.12 190.66愈傷組織收獲量(DW)(g/瓶) 3.230 7.724 20.364 2.942 7.113 20.816愈傷組織生長率(干重)(％) 169.28 138.82 163.65 145.36 141.77 192.64燈盞乙素含量(mg/g)0.040 0.015
結果表明，來源于兩株燈盞花的愈傷組織生長并無顯著差異，愈傷組織中燈盞乙素的含量明顯低于原植株，而且來源于不同植株的愈傷組織，其燈盞乙素的含量不同。燈盞乙素在來源于高含量植株的愈傷組織(Dmax)中的含量明顯高于來源于低含量植株的愈傷組織(Dmin)。
2、進行細胞懸浮培養用100ml三角瓶(其他容器也可以，大小不限)，內盛25ml液體培養基MS+BA 0.4mg/L+NAA 3mg/L+LH 1.0g/L+蔗糖20g/L，進行細胞懸浮培養。對較大的愈傷組織塊，先在研缽中加少許液體培養基研磨后接種。旋轉式搖床轉速125r/min，培養溫度25±1℃，完全黑暗條件下培養。將已可收獲的細胞懸浮液倒入有濾紙的布氏漏斗，抽去培養液，再用蒸餾水洗滌若干次，再抽干備用。
3、叢芽增殖培養選取上述生長進入靜止期的備用細胞再接入固體培養基進行叢芽增殖培養，6BA和NAA的最適濃度分別為0.5mg/L、0.1mg/L。
4、根的誘導生根培養時，選擇生長良好的芽接入生根培養基培養，生根用IBA0.01mg/L+MS培養基，經14天生根。
5、出瓶、煉苗移栽當根長0.5cm，葉生長到3-5片時，無須在培養瓶中練苗，直接把生根的燈盞花苗從培養瓶中取出，移入珍珠巖基質中，保持一定空氣濕度、溫度，經2周后，移至大田中栽培。
實施例2鐵皮石斛(Dendrobium candidum)的培養1、鐵皮石斛外植體的選擇及培養選擇鐵皮石斛莖段，用洗潔凈清洗干凈后，在流水下沖洗2小時，然后轉到潔凈工作臺上，吸干水分，先用70％酒精滅菌30s，再轉入0.1％的HgCl2溶液中滅菌6min，無菌蒸餾水沖洗5次，莖段剪成1cm長的小段，接種于愈傷組織誘導培養基MS+6-BA3mg/L+NAA2mg/L+蔗糖30g/L，用0.7％的瓊脂固化，高溫滅菌前pH調為5.8，培養溫度25℃。外植體接種后20天后可見明顯芽。
2、鐵皮石斛細胞懸浮培養
取上述培養的芽，先在研缽中加少許液體培養基研磨后接種。用100ml三角瓶(其他容器也可以，大小不限)，內盛25ml液體培養基MS+BA0.5mg/L+NAA 1mg/L+LH 1.0g/L+蔗糖20g/L。進行細胞懸浮培養。旋轉式搖床轉速125r/min，培養溫度25℃，完全黑暗條件下培養。將已可收獲的細胞懸浮液倒入有濾紙的布氏漏斗，抽去培養液，再用蒸餾水洗滌若干次，再抽干，備用。
3、芽增殖培養及根的誘導選取細胞生長進入靜止期的鐵皮石斛細胞再接入固體培養基進行叢芽增殖培養，6BA和NAA的最適濃度分別為1mg/L，0.5mg/L。在芽生長過程中，植株生長到2cm左右在該培養基中可接著生根。
4、出瓶、煉苗移栽當根長1cm，無須在培養瓶中練苗，直接把生根的鐵皮石斛苗從培養瓶中取出，移入珍珠巖基質中，保持一定空氣濕度、溫度，經2周后，移至栽培基質(如樹干上等)栽培。
權利要求
1.一種“細胞-組織”的培養方法，其特征在于先將植物組織在研缽體中加少許液體培養基研磨后接種，進入旋轉式搖床，培養溫度25±1℃，黑暗條件下進行細胞懸浮培養，將增殖的植物細胞懸浮液倒入有濾紙的布氏漏斗，抽去培養液，再用蒸餾水洗滌若干次，對培養的細胞進行細胞生長測定，選取細胞生長進入靜止期的細胞再接入固體培養基進行叢芽增殖培養，選擇生長良好的芽接入生根培養，最后出苗。
2.權利要求1所述的細胞懸浮液體培養基，其特征在于按以下方法配制用MS+BA 0.3～0.6mg/L，NAA 1～5mg/L，LH 0.5～1.5mg/L，蔗糖19～22g/L混合配制成細胞懸浮液體培養基。
3.權利要求1所述的固體培養基，其特征在于按以下方法配制用MS基礎培養基添加6BA和NAA分別為0.2～2mg/L、0.1～0.9mg/L制成。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，其目的在于提供一種細胞－組織培養方法。其特征在于先將植物組織在研缽體中加少許液體培養基研磨后接種，進入旋轉式搖床，培養溫度25±1℃，黑暗條件下進行細胞懸浮培養，將增殖的植物細胞懸浮液倒入有濾紙的布氏漏斗，抽去培養液，再用蒸餾水洗滌若干次，對培養的細胞進行細胞生長測定，選取細胞生長進入靜止期的細胞再接入固體培養基進行叢芽增殖培養，選擇生長良好的芽接入生根培養，最后出苗。該方法解決了傳統組織培養方法培養某些植物困難，尤其是一些藥用植物、木本植物因其含有特殊代謝產物而導致培養困難、增殖率低的問題，同時無性系后代保持與母本優良特性的高度一致性，并大幅度提高增殖率，降低培養成本，實現了“細胞－組織”培養工廠化生產。
文檔編號A01H4/00GK1490402SQ0313561
公開日2004年4月21日 申請日期2003年8月16日 優先權日2003年8月16日
發明者陳銳平 申請人:陳銳平