專利名稱：蘭州百合的快速繁殖方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體地屬于一種蘭州百合(Liliumdavidii var.unicolor)的快速繁殖方法。
背景技術：
蘭州百合(Lilium davidii var.unicolor)，又稱大王百合、甜百合和平陸百合等。它除具有觀賞價值外，還可藥用和食用。蘭州百合品質優、抗病性強和產量高(畝產1500kg，單個鱗莖最重者達0.5kg)，比其它食用百合如龍牙百合、宜興百合更適宜種植。但蘭州百合的子球長成商品球約需3至4年，而且以鱗莖為主的常規無性繁殖，繁殖速度慢，浪費商品球，病毒在鱗莖逐年種植中積累，造成品質和優良性狀的退化。迄今為止，現有技術未見有蘭州百合快速繁殖方法的報道。
發明內容
本發明的目的在于解決現有技術存在的上述問題，采用組織培養方法對蘭州百合進行快速繁殖，達到在短時間內生產大量優質種苗，提供給廣闊山區種植，為農民開展多種經營、脫貧致富增加一條途徑。
為了實現本發明的目的，本發明提供了如下的技術方案蘭州百合的快速繁殖方法，選取蘭州百合鱗片、葉和根的切段，采用外植體消毒后接入含不同植物激素的培養基，誘導產生芽，繼代培養后移入生根培養基，當試管苗高約3-5厘米時移栽入種植煉苗基質，鱗片不定芽的誘導和快繁培養基為MSBA2mg/L、NAA0.2mg/L，根、葉誘導和繁殖培養基為MSBA2mg/L、NAA0.4mg/L，試管苗生根培養基為1/2MSNAA0.3mg/L，溫度27±2℃，光照強度2000LX，光照時間12h/d，pH為5.8。
上述的快速繁殖方法，外植體消毒采用蘭州百合鱗片、葉和根，用自來水沖洗后，用75％酒精溶液處理30s，用0.1％HgCl2水溶液消毒8min，用無菌水沖洗4至5次，每次5min，再用無菌紙吸干材料上所帶的水分，切口基部去掉2-3mm，切為上、中、下三段，接入含不同植物激素的水溶液的培養瓶，誘導產生芽以供試驗用；上述的快速繁殖方法，所說種植煉苗基質用挖地基時深處污染少的黃土一份與過篩腐葉土兩份均勻混合，用1/20甲醛溶液水浸消毒，密封24h，打開周邊覆蓋塑料薄膜，約6天后裝袋使用。
上述的快速繁殖方法，所說生根培養用蘭州百合產生的不定芽，在繼代培養中增殖、長高、長葉，將5cm左右的不定芽切割下來，接在1/2MSNAA0.3的培養基上，15d左右便可生根，生根率95％以上。
上述的快速繁殖方法，所說移栽過程采用當完整的試管苗高約3-5cm，根健壯，便可移入已消毒過的基質中，試管苗由異養、恒溫和無菌狀況下移入土中要進行自養，不可傷試管苗的葉片和根尖，以防傷口染菌，移入土中后要保持濕度，用塑料薄膜覆蓋，為保溫透氣以防試管苗過濕霉變，每天早上11時至下午2時，視苗狀況進行通風，隨著試管苗的適應，逐漸加長通風時間，待試管苗長出新葉后，可揭膜粗放管理。
具體實施例方式為了更好地理解本發明的實質，下面將結合本發明的實施例進一步對本發明進行說明，但本發明的內容并不局限于此。
實施例11材料與方法1.1材料蘭州百合鱗片、葉和根的切段1.2.1外植體消毒采用蘭州百合鱗片、葉和根，用自來水沖洗后，用75％酒精溶液處理30s，用0.1％HgCl2水溶液消毒8min，用無菌水沖洗4至5次，每次5min，再用無菌紙吸干材料上所帶的水分，切口基部去掉2-3mm，切為上、中、下三段，接入含不同植物激素的水溶液的培養瓶，誘導產生芽以供試驗用。
1.2.2培養條件鱗片不定芽的誘導和快繁培養基為MSBA2mg/L(單位下同)、NAA0.2，根、葉誘導和繁殖培養基為MSBA2NAA0.4，試管苗生根培養基為1/2MSNAA0.3。溫度27±2℃，光照強度2000LX，光照時間12h/d，pH為5.8。
1.2.3種植煉苗基質栽苗基質用挖地基時深處污染少的黃土一份與過篩腐葉土兩份均勻混合，用1/20甲醛溶液水浸消毒，密封24h，打開周邊覆蓋塑料薄膜，約6天后裝袋使用。
2結果2.1.鱗片不定芽的誘導繁殖鱗片接種在MSBA2NAA0.2培養基上，兩周左右鱗片顏色由白變綠，約3周鱗片腹面膨脹，鱗片切口處出現白色小突起(新產生不定芽)單獨或排狀數個著生，這些產生不定芽的鱗片可切割、繼代在MSBA2NAA0.2的培養基上增殖。影響因素有植物激素種類、組合與量(見表1)，以及鱗片不同切段在鱗片中的位置(見表2)。
表1 植物激素對鱗片不定芽分化的影響培養基(mg/l) 分化不定芽所需天數 分化率(％，90d)BA2NAA0.2 16d開始分化不定芽98％BA2NAA0.2 30d開始分化不定芽50％BA2 28d開始分化不定芽80％NAA0.290d開始分化不定芽67％表2 鱗片不同部位對不定芽分化的影響鱗片部位芽分化的天數分化率(％，90d)上部 53d始分化芽 1.5％(2芽/片)中部 22d始分化芽 36％(3-5芽/片)下部 20d始分化芽 91％(8-11芽/片)完整鱗片 18d始分化芽 95％(1-13芽/片)注每處理試驗鱗片總數為30片；培養基為MSBA2NAA0.2。
2.2根段不定芽的誘導不定芽發生部位多在根切口處，根中部也有不定芽分化，并伴隨著愈傷組織產生。將2-3cm長的根切為2段，一般根基部的分化率大于根尖部分(表3)。
表3 培養基對根切段不同部位芽分化的影響培養基(mg/L) 根尖部分 根基部完整根BA2NAA1 30d初芽，分化率50％BA2NAA0.4 20d初芽，分化率50％BA2NAA0.240d初芽，分化率37d初芽，分化率 28d初芽，分化率30％10％ 30％BA2NAA0.4 40d初芽，分化率21％KT10IAA10 21d初芽，分化率10％NAA1 僅誘導愈傷組織，10％2.3葉段不定芽的誘導分化情況見表4。
2.4生根培養蘭州百合產生的不定芽，在繼代培養中增殖、長高、長葉，將5cm左右的不定芽切割下來，接在1/2MSNAA0.3的培養基上，15d左右便可生根，生根率95％以上。
表4 培養基對葉切段不同部位芽分化的影響培養基(mg/L) 葉尖部分葉基部葉中部 全葉BA2NAA0.2 37d初芽， 37d初芽， 37d初芽， 28d初芽，50％分化10％分化50％分化 20％分化BA2NAA0.4 28d初芽，50％分化，但出芽率為上面的2倍NAA2 90d天內無不定芽產生2.5移栽當完整的試管苗高約3-5cm，根健壯，便可移入已消毒過的基質中。試管苗由異養、恒溫和無菌狀況下移入土中要進行自養，必須細心管理。注意不要傷試管苗的葉片和根尖，以防傷口染菌，移入土中后要保持濕度，要用塑料薄膜覆蓋。為保溫透氣以防試管苗過濕霉變，每天早上11時至下午2時，視苗狀況進行通風，隨著試管苗的適應，逐漸加長通風時間，待試管苗長出新葉后，可揭膜粗放管理，移苗成活率達95％以上。
3討論在組織培養條件下蘭州百合鱗片、葉片和根的不同切段的培養效應所得的結論是各器官切段不定芽的分化速度和數量是下段＞中段＞上段。芽的誘導和增殖的最適外植體為鱗片。蘭州百合組織培養中鱗片不定芽誘導和快繁培養基為MS+BA2mg/L+NAA0.2mg/L，增殖培養基與上相同，3d左右不定芽開始分化。生根培養基為1/2MS+NAA0.3mg/L，15d左右生根，生根率95％以上。月增殖率為1∶4，初建無性系時，整個繁殖周期約需3個月。
百合是一種單子葉植物。國內外大量研究表明，單子葉植物的薄壁細胞一般不易回復到分生組織狀態。但百合科植物例外，以蘭州百合鱗片、根和葉片等外植體組培進行脫分化時，具有獲得初生分生組織的趨勢。這為蘭州百合各種組織、器官等誘導與分化，以及規模化生產提供了可能。采用蘭州百合根段和葉段培養，大大增加了外植體來源(約10倍以上)。
蘭州百合的鱗莖、根和葉片等外植體，可以切割為2至3段培養，均能誘導與分化不定芽。但它們所處位置不同，不定芽分化能力的大小也不同，從不定芽出現時間早晚和誘導叢芽數來看，鱗片為基部＞中部＞上部，根部為基部＞根尖，葉片為基部＞中部＞葉尖。造成這種現象的原因，與外植體營養狀況有關。例如鱗片培養中，外圍肥厚鱗片分化不定芽的能力比內部較小而薄的鱗片強，一片鱗片的厚度也是基部＞中部＞上部。另外鱗片分化能力與外加植物激素種類和濃度關系也很大。百合的鱗莖是貯藏器官，同時又是無性繁殖器官，從植株的整體情況來講，它位于中間偏下部位，從遺傳勢的角度出發，這種情況應全息于每個鱗片即鱗片中偏下，對小鱗莖發生有較強的遺傳勢，小鱗莖發生能力中下部最強，頂部差，符合生物全息率的遺傳優勢理論。關于再生植株的遺傳變異問題通過愈傷組織長期循環培養，百合在植株活力、染色體數目、葉斑、葉形及大小、花的發育和多年生性上等都會發生變異，但這些變異的特征不能有性遺傳。通過對麝香百合(2n)愈傷組織培養6年，其染色體和再生能力都無變化。用蘭州百合葉、根和鱗片作外植體得到的再生植株沒有經過愈傷組織途徑，而是直接由不定芽到試管苗。
權利要求
1.蘭州百合的快速繁殖方法，選取蘭州百合鱗片、葉和根的切段，采用外植體消毒后接入含不同植物激素的培養基，誘導產生芽，繼代培養后移入生根培養基，當試管苗高約3-5厘米時移栽入種植煉苗基質，其特征在于鱗片不定芽的誘導和快繁培養基為MSBA2mg/L、NAA0.2mg/L，根、葉誘導和繁殖培養基為MSBA2mg/L、NAA0.4mg/L，試管苗生根培養基為1/2MSNAA0.3mg/L，溫度27±2℃，光照強度2000LX，光照時間12h/d，pH為5.8。
2.根據權利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于所說外植體消毒采用蘭州百合鱗片、葉和根，用自來水沖洗后，用75％酒精溶液處理30s，用0.1％HgCl2水溶液消毒8min，用無菌水沖洗4至5次，每次5min，再用無菌紙吸干材料上所帶的水分，切口基部去掉2-3mm，切為上、中、下三段，接入含不同植物激素的水溶液的培養瓶，誘導產生芽以供試驗用；
3.根據權利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于所說種植煉苗基質用挖地基時深處污染少的黃土一份與過篩腐葉土兩份均勻混合，用1/20甲醛溶液水浸消毒，密封24h，打開周邊覆蓋塑料薄膜，約6天后裝袋使用。
4.根據權利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于所說生根培養用蘭州百合產生的不定芽，在繼代培養中增殖、長高、長葉，將5cm左右的不定芽切割下來，接在1/2MSNAA0.3的培養基上，15d左右便可生根，生根率95％以上。
5.根據權利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于所說移栽過程采用當完整的試管苗高約3-5cm，根健壯，便可移入已消毒過的基質中，試管苗由異養、恒溫和無菌狀況下移入土中要進行自養，不可傷試管苗的葉片和根尖，以防傷口染菌，移入土中后要保持濕度，用塑料薄膜覆蓋，為保溫透氣以防試管苗過濕霉變，每天早上11時至下午2時，視苗狀況進行通風，隨著試管苗的適應，逐漸加長通風時間，待試管苗長出新葉后，可揭膜粗放管理。
全文摘要
蘭州百合的快速繁殖方法，選取蘭州百合鱗片、葉和根的切段，采用外植體消毒后接入含不同植物激素的培養基，誘導產生芽，繼代培養后移入生根培養基，當試管苗高約3－5厘米時移栽入種植練苗基質，鱗片不定芽的誘導和快繁培養基為MSBA2mg/L、NAA0.2mg/L，根、葉誘導和繁殖培養基為MSBA2mg/L、NAA0.4mg/L，試管苗生根培養基為1/2MSNAA0.3mg/L，溫度27±2℃，光照強度2000LX，光照時間12h/d，pH為5.8。
文檔編號A01H4/00GK1460409SQ0313514
公開日2003年12月10日 申請日期2003年6月4日 優先權日2003年6月4日
發明者龍春林, 程漢英, 張長芹, 羅吉鳳, 左太春, 王俐 申請人:中國科學院昆明植物研究所