專利名稱：真菌生物蛋白可濕性粉劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物真菌提取的生物蛋白，具體涉及真菌生物蛋白制品的劑型。
背景技術：
隨著全球經濟一體化的進程，以提高我國農產品質量和國際競爭力，保障農業生產安全為目標，以解決制約我國農業健康生產的關鍵問題為重點，研究開發保障農產品質量安全、環境友好的關鍵技術及其系列產品，建立農業健康生產技術創新體系，建設農產品綠色清潔生產示范基地，培育環保型農業高科技企業，全面提高我國農業綠色清潔生產技術的整體水平，已成為人們關注的熱點。
我國是一個農業大國，每年由于農作物病蟲害造成的經濟損失達15-25％。由于化學農藥的濫用，人類賴以生存的生態環境遭到了嚴重的破壞，環境污染日趨嚴重，人畜中毒事件頻頻發生。環境保護已成為我國基本國策，生物農藥已列入21世紀優先發展領域。特別是隨著我國加入WTO和人民生活水平的不斷提高，對綠色農產品的生產提出了更高的要求。生物農藥成為現代農產品安全生產、環境友好的關鍵技術措施之一。
近年來，國際上已開展了大量的科學研究與有益的探索。1999年諾華公司開發登記了世界上第一個利用真菌產生的植物活化劑(Bion)，其有效成分為水楊酸類似物，它能夠激發和誘導植物產生免疫、抗病、促進生長的作用。2001年美國EDEN公司又開發登記了更為先進的Messenger(Harpin)，農作物使用后一般可以增產10％，并可用于蔬菜、水果的貯藏保鮮。這類產品獲得了美國2001年度總統綠色化學挑戰獎。我國也開展了水稻黃單胞菌兩個致病變種(Xoo和Xooc)中Harpin蛋白的比較遺傳學研究，發掘出編碼HarpinX的功能基因，并通過轉基因手段發現這類基因可在植物中高效表達。山西省農科院也已從細菌Harpin的研究材料中獲得了具有生物活性的細菌蛋白質材料。證實了細菌蛋白質具有提高植物抗病蟲性和促進植物增產的功能。
美國EDEN生物科學公司利用在原核細菌Harpin的研究中于2001年開發并推出了具有生物活性功能的產品Messenger。CN1344727A提出了不同于細菌蛋白質的真核微生物活性蛋白質，它的分子量、氨基酸及基因序列均有別于Messenger。真菌蛋白質比細菌蛋白質分子量大，氨基酸種類多，在某些方面具有更強的活性功能。CN1344727A研制成功了真菌蛋白制品，但是如何研制一種劑型，既適合工業化生產，又保持真菌活性蛋白的穩定性是目前尚未解決的問題。
發明內容
本發明旨在提出一種真菌蛋白的可濕性粉劑，使真菌活性蛋白制品實現工業化生產，而且解決了真菌蛋白制品的穩定性問題。
本發明是通過以下技術方案實現上述發明目的的。
真菌生物蛋白可濕性粉劑的組分與重量百分比為真菌蛋白1～3％，硅藻土50～60％，表面活性劑20～24％，乙二胺四乙酸二鈉1～2％，硫代硫酸鈉0.5～1％，磷酸緩沖液由磷酸二氫鈉1～2％和磷酸氫二鈉12～20％組成，PH6.8～8.0。
下面進一步詳述本發明以植物病原微生物真菌葡萄孢屬(Botrytis)、交鏈孢屬(Alternaria)、稻瘟菌(Pyrcularia)、青霉菌(Penicillium)、黃曲霉菌(Asporgillus)、紋枯病菌(Rhizoctonia solani)，鐮刀菌(Fusarium)，木霉菌屬(Trichoderma)和疫霉屬(Phytophthora)等真菌中的任一種為材料，在PDA等常規培養液中培養發酵至微生物真菌最大生長量時，經真空抽濾，將抽濾收集的真菌菌絲和孢子按培養液體積1/10加入PH6.8-8.0的5mM磷酸緩沖液或檸檬酸緩沖液，真菌菌絲和孢子懸浮液采用超聲波20-30分鐘或1000-1800bar高壓破碎菌絲和孢子細胞，再以5000rpm離心30分鐘，去除沉淀的破碎細胞組織，上清液用100度沸水水浴15-20分鐘，即獲得具有誘導，激活生物活性的分子量為42-60KD之間特種生物蛋白，以及分子量為30KD和20KD的輔助活性蛋白。經過對誘導，激活生物特種蛋白的理化特性分析，選用和添加蛋白保護及穩定劑，并根據生物農藥登記要求，生產出符合要求的生物制品。將其獲得的微生物特種蛋白1-3克與50-60克硅藻上(細度99％，過75μm標準篩)，20-24克表面活性劑(烷基酚類非離子型表面活性劑，北京市齊民生物環境公司制)，1-2克蛋白質保護劑EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)和0.5-1克蛋白質穩定劑STS(硫代硫酸鈉)以及1-2克磷酸二氫鈉和12-20克磷酸氫二鈉混合的PH6.8-8.0的磷酸緩沖系統等組合配制而成真菌生物蛋白1％到3％可濕性粉劑。配制而成真菌生物蛋白1％到3％可濕性粉劑在烘箱75度中烘干一小時或將上述各組分在流化床干燥噴霧造粒機(實研型流化床，型號STREA-1)上干燥噴霧造粒后，最后在真空包裝機上對樣品進行真空包裝。經過這樣的制備工藝過程而得到的真菌生物蛋白1％到3％可濕性粉劑可在室溫下保存2年以上，其制劑仍具有防病蟲，增產和保鮮的生物活性。
真菌生物蛋白1％到3％可濕性粉劑中所含有的微生物真菌特種生物蛋白它能通過與植物表面蛋白受體的互作，可誘導植物的信息傳導，啟動植物體內一系列代謝反應，引起基因表達，誘導和激活植物自身防衛系統和生長系統，從而產生對病蟲害的抗性，促進植物生長，提高作物產量。本發明的真菌生物蛋白1％到3％可濕性粉劑可通過溶于500倍或1000倍水中配制而成水液體和直接用粉劑劑型，它可用于植物的拌種、浸種、澆根和葉面噴施，生物特種蛋白的使用濃度為10-60μg/ml，經40多種植物的室內盆栽和田間實驗，表明真菌生物蛋白1％到3％可濕性粉劑對病蟲害的防治效率達40-80％。提高作物產量10-20％(詳見表1～表7)。
表1真菌生物蛋白3％可濕性粉劑對提高柑桔座果率的效果
表1可以看出，噴施真菌生物蛋白3％可濕性粉劑1000倍液能使柑桔座果率比對照提高1.67％個百分點，即處理可提高柑桔座果率30％以上。
表2真菌生物蛋白3％可濕性粉劑處理10天后促進植物生長的效果(cm)
表3生物蛋白3％可濕性粉劑對黃瓜(中農12號)發芽影響
將黃瓜種子放在處理液中浸泡4.5小時后，取出后用濾紙將處理液濾干，再將種子放在墊有濾紙(用蒸餾水潤濕)的培養皿中培養，每處理10個種子，三次重復。T值分析法檢測表明3％的可濕性粉劑處理黃瓜種子具有促進種子發芽根系生長的活性。
表4生物蛋白3％可濕性粉劑誘導煙草對蚜蟲的抗性作用
待藥液干后2小時各處理接種30只大小比較一致的蚜蟲，接種于煙草(珊西煙葉)最上部2～3片新葉。
表5.真菌生物蛋白3％可濕性粉劑處理番茄第十四天誘導抗灰霉病害的效果
注T-測驗表明在95％和99％的水平上，真菌生物蛋白可濕性粉劑和清水對照在統計學上具有顯著差異。
表6.真菌生物蛋白3％可濕性粉劑處理番茄第二十天誘導抗灰霉病害的效果
注T-測驗表明在95％和99％的水平上，真菌生物蛋白可濕性粉劑和清水對照在統計學上具有顯著差異。
表7噴施生物蛋白3％可濕性粉劑后第7天接種所誘導對煙草花葉病毒病的抗性效果
經果品的貯存實驗，真菌生物蛋白的保鮮效果顯著(見表8～表11)。用3％的可濕性粉劑處理桃子的保鮮實驗結果如下實驗用桃子(品種為大久保)用3％的可濕性粉劑500倍和1000倍稀釋后，將桃子放在稀釋液中浸沾20-30秒后，讓桃子自然分干后，在室溫下(24-28℃)保存，每處理桃子30個，分別于第4天和第7天調查其桃子的發病率和爛果率。
表8處理4天后的桃子灰霉病和爛果率
表9處理7天后的桃子灰霉病和爛果率
統計分析T值分析法檢測表明微生物蛋白3％的可濕性粉劑500倍和1000倍稀釋可減輕桃子灰霉病的發病率和爛果率，可見微生物蛋白3％的可濕性粉劑處理對桃子具有保鮮作用。用3％的可濕性粉劑處理西紅柿的保鮮實驗結果如下實驗用西紅柿(品種為粉冠)用3％的可濕性粉劑500倍和1000倍稀釋后，將西紅柿放在稀釋液中浸沾20-30秒后，讓西紅柿自然分干后，在室溫下(24-28℃)保存，每處理西紅柿20個，分別于第7天和第10天調查其西紅柿的發病率和爛果率。
表10處理7天后的西紅柿灰霉病和爛果率
表11處理10天后的西紅柿灰霉病和爛果率
統計分析T值分析法檢測表明微生物蛋白3％的可濕性粉劑500倍和1000倍稀釋可減輕西紅柿灰霉病的發病率和爛果率，可見微生物蛋白3％的可濕性粉劑處理對西紅柿水果具有保鮮作用。
真空包裝的真菌蛋白可濕性粉劑在室溫(24～28℃)存放二年后，用紫外分光光度計測試3％的可濕性粉劑的蛋白濃度仍為3％。用SDS-PAGE凝膠電泳測試保存二年后3％的可濕性粉劑的蛋白在42KD等處仍有明顯可見的蛋白條帶，表明保存二年后3％的可濕性粉劑的蛋白是穩定的。
用保存二年后的真菌生物蛋白可濕性粉劑處理黃瓜種子，仍具有促進黃瓜種子發芽、根系生長的活性(表12)。
真菌蛋白可濕性粉劑保存二年后的效果試驗結果如下
樣品經干燥后真空包裝在室溫下(24-28℃)存放二年后，樣品經用黃瓜種子發芽生長法，測試蛋白的穩定性。
表12保存二年后3％的可濕性粉劑對黃瓜(中農12號)種子發芽根系生長的檢測結果。
將黃瓜種子放在保存二年后的3％可濕性粉劑處理液中浸泡6小時后，取出后用濾紙將處理液濾干，再將種子放在墊有濾紙(用蒸餾水潤濕)的培養皿中(28℃)培養，每處理10個種子，三次重復。
統計分析T值分析法檢測表明保存二年后3％的可濕性粉劑處理黃瓜(中農12號)種子仍具有促進種子發芽根系生長的活性。
真菌生物蛋白1％到3％可濕性粉劑，可與常用的酸性，中性農藥混合使用，但不能與堿性物質混用。藥液配制時要充分攪勻，即配即用，噴霧要勻。噴藥時間于早上露水干后，或傍晚用藥。噴藥后6小時遇雨需補噴。藥品宜存放在陰涼通風處。有效期2年。
本發明生產工藝簡單，成本較低，持效期長，可廣泛用于作物的高效、優質、無公害生產和果品保鮮。
本發明創制開發的真菌生物蛋白1％到3％可濕性粉劑中有效成分生物特種蛋白質的作用方式在性質上類似動物免疫的一種抗病機制，屬于一種新型、廣譜、高效、多功能生物農藥，防治黃瓜花葉病毒病、煙草花葉病毒病、蔬菜蚜蟲的效果在75％以上，促生增產效果達10％以上。產品本身無毒，不改變植物的DNA，不引起病蟲害的抗藥性，在植物體內和土壤中易分解，無殘留，可大幅度提高農產品質量和國際競爭力，是農業健康生產技術體系中一種新型環保產品，同時大大節省資源，減輕污染，保護生態環境和人類健康。我國病蟲害每年發生面積約50萬畝次，年需使用防治藥劑110萬噸制劑，在該項研究完成后按病蟲害應防面積和藥劑的5％計，可產生直接經濟效益在10億元人民幣以上，間接經濟效益可達80億元。
具體實施例方式實施例一以篩選獲得的高效西紅柿灰霉病菌菌株(即真菌葡萄孢屬Botrytis)在PDA培養液中(24-26℃)培養發酵3-4天，經真空抽濾，將抽濾收集的真菌菌絲和孢子按培養液體積1/10加入PH6.8-8.0的5mM磷酸緩沖液或檸檬酸緩沖液，真菌菌絲和孢子懸浮液采用超聲波20-30分鐘或1000-1800bar高壓破碎菌絲和孢子細胞，再以5000rpm離心30分鐘，去除沉淀的破碎細胞組織，上清液用100℃沸水水浴15-20分鐘，即獲得具有誘導，激活生物活性的分子量為42-60KD之間特種生物蛋白，以及分子量為30KD和20KD的輔助活性蛋白。將其獲得的微生物特種蛋白1克與60克硅藻土，24克表面活性劑(烷基酚類非離子型表面活性劑)，1克蛋白質保護劑EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)和0.5克蛋白質穩定劑STS(硫代硫酸鈉)以及1克磷酸二氫鈉和12克磷酸氫二鈉的PH6.8-8.0的磷酸緩沖系統等組合配制而成防病蟲保鮮生物蛋白1％可濕性粉劑。配制而成防病蟲保鮮生物蛋白為1％可濕性粉劑在烘箱75度中烘干一小時或將上述各組分在流化床干燥噴霧造粒機(實研型流化床，型號STREA-1)上干燥噴霧造粒后，最后在真空包裝機上對樣品進行真空包裝。經過這樣的制備工藝過程而得到的防病蟲保鮮生物蛋白1％可濕性粉劑可在室溫下保存2年以上，其制劑仍具有防病蟲，增產和保鮮的生物活性。
實施例二以篩選獲得的高效蔬菜黑斑病菌菌株(即交鏈孢屬Alternaria)，在PDA培養液中(25-28℃)培養發酵2-3天，經真空抽濾，將抽濾收集的真菌菌絲和孢子按培養液體積1/10加入PH6.8-8.0的5mM磷酸緩沖液或檸檬酸緩沖液，真菌菌絲和孢子懸浮液采用超聲波20-30分鐘或1000-1800bar高壓破碎菌絲和孢子細胞，再以5000rpm離心30分鐘，去除沉淀的破碎細胞組織，上清液用100度沸水水浴15-20分鐘，即獲得具有誘導，激活生物活性的分子量為42KD之間特種生物蛋白，以及分子量為30KD和20KD的輔助活性蛋白。將其獲得的微生物特種蛋白3克與55克硅藻土，22克表面活性劑(烷基酚類非離子型表面活性劑)，2克蛋白質保護劑EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)和1克蛋白質穩定劑STS(硫代硫酸鈉)以及2克磷酸二氫鈉和15克磷酸氫二鈉的PH6.8-8.0的磷酸緩沖系統等組合配制而成防病蟲保鮮生物蛋白3％可濕性粉劑。配制而成防病蟲保鮮生物蛋白3％可濕性粉劑在烘箱75度中烘干一小時或將上述各組分在流化床干燥噴霧造粒機(實研型流化床，型號STREA-1)上干燥噴霧造粒后，最后在真空包裝機上對樣品進行真空包裝。經過這樣的制備工藝過程而得到的防病蟲保鮮生物蛋白3％可濕性粉劑可在室溫下保存2年以上，其制劑仍具有防病蟲，增產和保鮮的生物活性。
權利要求
1.一種真菌生物蛋白可濕性粉劑，其特征在于其組分與重量百分比如下真菌蛋白 1～3％硅藻上 50～60％表面活性劑 20～24％乙二胺四乙酸二鈉 1～2％硫代硫酸鈉 0.5～1％
全文摘要
本發明涉及微生物真菌提取的生物蛋白制品劑型。本發明的真菌蛋白可濕性粉劑的組分與含量為真菌蛋白1～3％，硅藻土50～60％，表面活性劑20～24％，乙二胺四乙酸二鈉1～2％，硫代硫酸鈉0.5～1％，磷酸緩沖液由磷酸二氫鈉1～2％和磷酸氫二鈉12～20％組成，pH6.8～8.0。用本發明研制的1～3％的可濕性粉劑經大量田間與室內試驗證明，可增強多種作物對多種病蟲害的抗性，防治效率達40～80％，并能促進作物生長，增產率達10～30％，降低果品的爛果率，粉劑在室溫存放兩年真菌蛋白仍保持其活性。本產品無色，無味，無毒害，無殘留，解決了化學制品引起的生態破壞和環境污染的問題，又克服了轉基因植物存在的安全性問題，本品使用方便，用量小，持效期長。
文檔編號A01N25/14GK1493194SQ0312474
公開日2004年5月5日 申請日期2003年8月18日 優先權日2003年8月18日
發明者于耀平, 邱德文 申請人:邱德文