專利名稱：人參愈傷組織細胞凍干及超低溫保存方法
技術領域：
本發明涉及植物種質資源的細胞保存，特別是人參愈傷組織細胞的保存。本發明涉及人參愈傷組織細胞的凍干方法和超低溫保存方法，以及凍干的人參愈傷組織細胞。
背景技術：
植物遺傳多樣性是保護人類生存環境和維持農業持續發展的一個關鍵因素，如何保存和利用物種多樣性是當今社會面臨的重大課題之一。植物組織培養技術與超低溫保存技術在植物種質的長期保存中有重要作用，其中一些方法已開始進入應用。至今還未形成一種既在實驗室常用，同時又能夠大規模長期穩定地保存植物種質的技術手段，在一些技術環節上尚需進一步完善。
而對于許多植物細胞，例如人參愈傷組織細胞，尚未有任何保存方法被提出。
發明內容
本發明的目的之一是提供一種保存植物種質，特別是人參愈傷組織細胞的方法。
本發明的另一目的是提供一種恢復植物種質，如人參愈傷組織細胞的方法。
本發明的另一目的是提供一種保存的植物種質，如人參愈傷組織細胞。
本發明的其它目的，體現在本發明內容的詳細描述之中根據本發明，一種保存人參愈傷組織細胞的方法，包括1)在低溫下，將人參愈傷組織細胞與保護劑混合，2)將混合物用冷凍干燥法或超低溫法進行處理，3)保存處理后的混合物。
本發明中采用的保護劑含有海藻糖，例如含有10％的海藻糖；根據需要，還可以添加蔗糖，例如添加10％的蔗糖。
根據本發明的一個實施方案，該保護劑含有10％海藻糖，5-10％DMSO和5-10％甘油。
本發明的一個優選實施方案中，該保護劑含有10％海藻糖，10％蔗糖，5-10％DMSO和5-10％甘油。
根據本發明的方法，人參愈傷組織細胞與保護劑混合前，可對該細胞進行預培養(加速傳代、提高培養基滲透壓、低溫鍛煉)。該保護劑與預培養細胞按1∶1-1∶3的體積比混合。
根據本發明一種恢復保存的細胞生長的方法，包括1)在40-60℃解凍保存的細胞，2)在培養基中培養解凍的細胞。
本發明還涉及一種保存的人參愈傷組織細胞。
圖1是本發明人參愈傷組織細胞凍干及超低溫保存方法的流程圖。
1.本發明采用了冷凍干燥保存技術成功地保存了人參愈傷組織，具有操作簡單、經濟合理、可大批量保存冷凍材料優點。
2.本發明采用了超低溫保存技術成功地保存了人參愈傷組織，具有操作簡單、細胞凍存后恢復生長快優點。
3.本發明使用海藻糖作為植物細胞保存保護劑組分，作為植物種質資源的細胞保存保護劑，特別是人參愈傷組織細胞保存保護劑，目前還尚未有報道。
4.本發明提供了理想的玻璃化保護劑，海藻糖可以和甘油、DMSO、蔗糖、葡萄糖、鮮脫脂牛奶、脯氨酸中配制成復合保護劑并選擇各組分最佳組合，使細胞更容易進入玻璃化狀態。
具體實施例方式
下面結合實施例進一步說明本發明。
實施例1待凍存材料的準備用液體懸浮培養，愈傷組織細胞以培養5～7天為宜；用固體培養，愈傷組織細胞以培養10～15天為宜。
實施例2保護劑配制取海藻糖、蔗糖、葡萄糖、鮮脫脂牛奶、脯氨酸分別配制1-6號保護劑，1、2、4、5、6號保護劑使用67V液體培養基溶解，3號保護劑直接使用鮮脫脂牛奶溶解。分別進行凍干及超低溫保存。各濃度如下1號保護劑5％DMSO、10％甘油2號保護劑20％蔗糖、5％DMSO、10％甘油3號保護劑鮮脫脂牛奶、5％DMSO、10％甘油4號保護劑1.0M脯氨酸、5％DMSO、10％甘油5號保護劑10％海藻糖、5％DMSO、10％甘油6號保護劑10％海藻糖、10％蔗糖、5％DMSO、10％甘油實施例3預培養取待凍存材料在添加海藻糖、蔗糖、葡萄糖、鮮脫脂牛奶、脯氨酸成分的培養基中進行預培養，如按5、6號保護劑配方凍存細胞時，在添加5％DMSO和5％海藻糖的67V培養基中25℃預培養3d，再在5％DMSO和10％海藻糖67V培養基中4℃預培養1d。
實施例4冷凍干燥保存方法首先在冰浴上(0℃)保護劑與預培養細胞按1∶3的體積混合，其濃度為原濃度的1/4，緩緩加入，輕輕攪拌，10min后吸去液體。然后，在原濃度的保護劑中冰浴處理5min，最后以每冷凍管細胞和保護劑的總體積為1ml分裝于西林瓶中，置凍干機內經預凍后，-28℃冷凍干燥22h，取出置-20℃冰箱中凍存。
實施例5超低溫保存方法首先在冰浴上(0℃)保護劑與預培養細胞按1∶3的體積混合，其濃度為原濃度的1/4，緩緩加入，輕輕攪拌，10min后吸去液體。然后，在原濃度的保護劑中冰浴處理5min，最后，以每冷凍管細胞和保護劑的總體積為1ml分裝于塑料凍存管中，以每分鐘降1℃，至-50℃迅速投入液氮中凍存。
實施例6將實施例4中凍存后的細胞放入液體洗滌培養基中洗滌10min，洗滌時應逐漸稀釋，液體洗滌培養基為預培養所用的67V液體培養基吸去洗滌液，液體洗滌培養基需置于0℃，洗滌后細胞轉入預培養所用67V固體培養基上恢復培養。觀察細胞恢復生長情況。細胞恢復生長良好。
實施例7將實施例5中凍存后的細胞在60℃水浴中1min快速化凍，把細胞團放入液體洗滌培養基中洗滌10min，洗滌時應逐漸稀釋，液體洗滌培養基為預培養所用的67V液體培養基吸去洗滌液，液體洗滌培養基需置于0℃，洗滌后細胞轉入預培養所用67V固體培養基上恢復培養。觀察細胞恢復生長情況。細胞恢復生長良好。
本發明結果說明在本發明中觀察到當使用1、2、3、4、5、6號保護劑，分別采用冷凍干燥和超低溫法保存人參愈傷組織細胞，在經過0-6月保存期后，解凍再培養，均有部分細胞恢復生長。但是，使用5、6號保護劑按凍干和超低溫法保存解凍后，細胞恢復期短，生長較快，在5-6周后便可觀察到細胞分裂長出鮮嫩的新細胞，而且6號優于5號。而使用1-4號保護劑按凍干和超低溫法保存解凍后，細胞恢復期較長，細胞存在不同程度褐化現象，生長較慢，在8-10周后，甚至更長時間，才能觀察到細胞分裂長出鮮嫩的新細胞。本發明還觀察到使用5、6號保護劑，同時按凍干和超低溫法保存懸浮培養細胞，超低溫法細胞恢復生長較凍干法快。
實驗說明，采用含海藻糖的保護劑，用凍干法和超低溫法凍存人參愈傷組織細胞是可行的，并且效果很好。
在觀察細胞恢復生長時，由于目前最常用的TTC法和FDA法檢測細胞活性，檢測的只是細胞內某中酶的綜合作用，而真正細胞活性，還需保持細胞結構的完整性，即使經TTC法和FDA法檢測的相對存活率很高，但接種到恢復培養基上，可能根本不能恢復生長，說明細胞的內膜系統或其他結構已遭受不可逆的致命損傷。因此，在本發明中采用最直接、最有力、最具有實際價值的方法，既觀察細胞凍存后恢復生長的比率為判定細胞存活指標。
權利要求
1.一種保存人參愈傷組織細胞的方法，包括1)在低溫下，將人參愈傷組織細胞與保護劑混合，2)將混合物用冷凍干燥法或超低溫法進行處理，3)保存處理后的混合物其中該保護劑含有海藻糖。
2.權利要求1的方法，其中該保護劑含有10％海藻糖，5-10％DMSO和5-10％甘油。
3.權利要求2的方法，其中該保護劑還含有10％蔗糖。
4.根據權利要求3的方法，其中該保護劑含有10％海藻糖、10％蔗糖、5％DMSO和10％甘油。
5.根據權利要求1-4中之一的方法，進一步包括在人參愈傷組織細胞與保護劑混合前，對該細胞進行預培養。
6.根據權利要求5的方法，其中該保護劑與預培養細胞按1∶1-1∶3的體積比混合。
7.一種恢復保存的細胞生長的方法，包括1)在40-60℃解凍保存的細胞，2)在培養基中培養解凍的細胞。
8.一種按權利要求1-6的方法保存的人參愈傷組織細胞。
全文摘要
本發明提供了人參愈傷組織細胞凍干及超低溫保存的方法，其中使用海藻糖作為人參細胞凍干及超低溫保存保護劑組分。本發明還涉及一種保存的人參愈傷組織細胞。采用本發明的方法，保護人參愈傷組織細胞的效果明顯。
文檔編號A01H4/00GK1532279SQ0312098
公開日2004年9月29日 申請日期2003年3月26日 優先權日2003年3月26日
發明者盛軍, 劉曉宇, 李娟 , 劉丹, 回悅君, 郭橋, 于海鵬, 王志武, 張雪梅, 蔡偉明, 盛 軍 申請人:長春生物制品研究所