專(zhuān)利名稱(chēng)：魚(yú)類(lèi)胚胎玻璃化冷凍保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于低溫生物學(xué)中的動(dòng)物胚胎低溫保存技術(shù)，是一種在液氮(-196℃)中長(zhǎng)期保存魚(yú)類(lèi)胚胎的玻璃化冷凍方法。
背景技術(shù)：
種質(zhì)資源是水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)、優(yōu)良品種培育及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。我國(guó)是一個(gè)水生生物種質(zhì)資源較為豐富的國(guó)家，豐富多樣的水生生物種質(zhì)資源和遺傳多樣性對(duì)于我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展起到了非常重要的作用。然而，由于漁業(yè)資源地過(guò)度捕撈、無(wú)序利用及人工放流等，造成了某些魚(yú)類(lèi)資源的衰退和瀕臨滅絕，如長(zhǎng)江鰣、松江鱸等。如果不及時(shí)采取保護(hù)措施，若干年后，在自然界中將難以找到許多魚(yú)類(lèi)原種、良種的遺傳資源。因此，建立重要養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)原種、良種及珍稀瀕危魚(yú)類(lèi)的種質(zhì)資源庫(kù)，將這些魚(yú)類(lèi)的種質(zhì)資源和遺傳多樣性以活的形式長(zhǎng)期保存起來(lái)，已成為魚(yú)類(lèi)種質(zhì)資源保護(hù)和魚(yú)類(lèi)低溫生物學(xué)研究中亟待攻克的重要科技問(wèn)題。
由于魚(yú)卵和胚胎體積大(直徑通常為1-7mm，而哺乳類(lèi)卵直徑多數(shù)在200μm以?xún)?nèi))、含水量多、卵膜通透性差、胚胎由胚體和卵黃囊兩種結(jié)構(gòu)組成、卵黃含量高，因此魚(yú)類(lèi)胚胎的超低溫冷凍保存一直是國(guó)際魚(yú)類(lèi)低溫生物學(xué)界的一個(gè)難題。迄今，國(guó)際上尚未建立魚(yú)類(lèi)胚胎超低溫冷凍保存的有效技術(shù)。在本發(fā)明作出之前，加拿大維多利亞大學(xué)生物系的Harvey(1982)以斑馬魚(yú)為材料率先開(kāi)展了魚(yú)類(lèi)胚胎低溫保存研究。隨后，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)淡水魚(yú)類(lèi)胚胎冷凍保存技術(shù)開(kāi)展了大量研究，并取得一些進(jìn)展。在魚(yú)卵和胚胎冷凍方法上，試用過(guò)的方法有分段慢速降溫、分段快速降溫和玻璃化法3種。分段慢速降溫一般為將樣品從室溫慢速(2-5℃/min)降到冰點(diǎn)的溫度，然后再以極慢的速率(0.05-0.5℃/min)降至約-60℃左右，再以約1-2℃/min降至-85℃，停留約10分鐘，最后快速降溫至-196℃的保存溫度。上海理工大學(xué)低溫生物工程室的Zhang X.S等(1989)采用這種慢速降溫方法在進(jìn)行鯉魚(yú)胚胎冷凍保存時(shí)，從在液氮中保存20分鐘的16枚胚胎中獲得了3枚復(fù)活的胚胎，但遺憾的是，這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在隨后的研究中卻再也重復(fù)不出來(lái)。第二種方法是分段快速降溫法。這種方法與慢速降溫的主要差別就是從0℃到-60℃，采用2-5℃/min的較快速降溫速率。上海水產(chǎn)大學(xué)的張克儉等(1997)采用這種降溫方法對(duì)草魚(yú)和泥鰍胚胎進(jìn)行了冷凍保存實(shí)驗(yàn)，并偶爾取得個(gè)別胚胎復(fù)活的成功事例，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能重復(fù)。以上實(shí)驗(yàn)均因胚胎細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，而導(dǎo)致胚胎死亡。第三種冷凍降溫方法就是玻璃化冷凍法。這種方法借助于極快速降溫，使細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的液體越過(guò)結(jié)冰過(guò)程，而直接形成玻璃狀固體，從而避免細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，減少冰晶形成對(duì)細(xì)胞的損傷，保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。臺(tái)灣水產(chǎn)研究所的Chao N等(1997)比較了幾種玻璃化液對(duì)斑馬魚(yú)胚胎冷凍保存的影響，表明DAP2B(2M DMSO+1M乙酰胺+3M丙二醇)的效果優(yōu)于VSI(20.5％DMSO+15.5％乙酰胺10％丙二醇)的效果，但未獲得冷凍復(fù)活的胚胎。英國(guó)Luton大學(xué)的Zhang和Rawson(1996)研究了斑馬魚(yú)胚胎玻璃化冷凍保存的可行性，表明丁二醇可以形成玻璃化的最低濃度為3Mol/L，幾種不同抗凍劑的混合物可以形成玻璃化，盡管解凍后胚胎形態(tài)正常，但未獲得復(fù)活的斑馬魚(yú)胚胎。美國(guó)Washington國(guó)家動(dòng)物園的Hagedorn等(1998)重點(diǎn)研究了斑馬魚(yú)胚胎對(duì)抗凍劑的滲透屏障，但未獲得過(guò)冷凍復(fù)活的魚(yú)類(lèi)胚胎。在美國(guó)Louisiana州立大學(xué)農(nóng)業(yè)中心的Tiersch T和MazikPM博士(2000)合著的《Cryopreservation in Aquatic Species》這本權(quán)威專(zhuān)著中，將魚(yú)類(lèi)胚胎冷凍保存列為迄今世界上尚未攻克的難題之一。國(guó)內(nèi)長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所的章龍珍等(2001)觀察了泥鰍胚胎在不同玻璃化液中的存活時(shí)間，從中篩選出了幾種可形成玻璃化的抗凍劑溶液，胚胎在這些玻璃化液中的存活時(shí)間可以長(zhǎng)達(dá)70min，但未獲得冷凍復(fù)活的魚(yú)苗。因此，盡管一些學(xué)者對(duì)淡水魚(yú)類(lèi)胚胎的玻璃化技術(shù)進(jìn)行了許多研究，但迄今尚未獲得成功，也沒(méi)有建立切實(shí)可行的玻璃化冷凍保存技術(shù)。而有關(guān)海水魚(yú)類(lèi)胚胎的冷凍保存，特別是牙鲆和鱸魚(yú)胚胎的玻璃化冷凍保存技術(shù)，均未查到任何文獻(xiàn)和專(zhuān)利報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)魚(yú)類(lèi)胚胎具有體積大(直徑為1-7mm)、含水量多、卵膜通透性差、胚胎由胚體和卵黃囊兩種結(jié)構(gòu)組成、卵黃含量高等特點(diǎn)，本發(fā)明專(zhuān)利的目的是通過(guò)建立魚(yú)類(lèi)胚胎玻璃化冷凍技術(shù)，解決在冷凍降溫過(guò)程中胚胎細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，導(dǎo)致胚胎死亡的難題，從而攻克魚(yú)類(lèi)胚胎超低溫冷凍保存的技術(shù)難關(guān)，為建立魚(yú)類(lèi)胚胎冷凍庫(kù)、長(zhǎng)期保存魚(yú)類(lèi)種質(zhì)資源提供技術(shù)手段。
本發(fā)明是按照以下操作技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)的胚胎收集，鏡檢合格后在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至體節(jié)出現(xiàn)期時(shí)使用；用玻璃化基礎(chǔ)溶液(BS2)稀釋抗凍劑1，2-丙二醇(縮寫(xiě)為PG)和甲醇(縮寫(xiě)為MeOH)混合物，配制成不同濃度的玻璃化液(FVS1-FVS4)，其組成為50-67％BS2，20-30％PG及13-20％MeOH；將處于體節(jié)出現(xiàn)期-出膜前期的魚(yú)類(lèi)胚胎逐級(jí)在濃度遞增的玻璃化液中各浸泡9-11分鐘，進(jìn)行凍前平衡；將平衡好的胚胎轉(zhuǎn)入塑料麥管，封口后直接投入液氮中進(jìn)行冷凍保存；需要解凍時(shí)，將麥管從液氮中拿出后進(jìn)行快速解凍。將解凍后的胚胎放在洗脫液中洗脫10分鐘，洗脫液為在BS2中添加0.125Mol/L蔗糖的溶液；然后，添加滅菌海水進(jìn)行培養(yǎng)。
胚胎收集和適宜發(fā)育時(shí)期的確定采集魚(yú)類(lèi)胚胎，通過(guò)抗凍劑處理確定適宜玻璃化冷凍的胚胎發(fā)育時(shí)期，表明從體節(jié)出現(xiàn)期到尾芽期的胚胎均適宜進(jìn)行玻璃化冷凍保存。
玻璃化基礎(chǔ)溶液(BS2)的配制(為100ml水中的重量比)NaCl 2.472％、KCl 0.086％、CaCl2.2H2O 0.146％、MgCl2.6H2O 0.486％、NaHCO30.019％。
抗凍劑為1，2-丙二醇(PG)和甲醇(MeOH)，其濃度分別為20-30％和13-20％。
玻璃化液的配制本發(fā)明中使用的4種玻璃化液的配方分別為FVS1含BS2 67％，PG 20％及MeOH 13％；FVS2含BS2 60％，PG 24％及MeOH 16％；FVS3含BS2 55％，PG 27％及MeOH 18％；FVS4含BS2 50％，PG 30％及MeOH20％。
胚胎的凍前平衡處理將胚胎逐級(jí)依次在濃度為25％，33％，50％，67％及100％的玻璃化液中分五步進(jìn)行平衡處理，共計(jì)45-55分鐘，每步平衡約9-11分鐘。
玻璃化冷凍將在最后一級(jí)玻璃化液中平衡好的胚胎10余粒連同約250ul玻璃化液吸入直徑為3mm，長(zhǎng)為10cm的麥管，用熱壓封口后，以2000℃/min以上的降溫速率，將麥管迅速投入液氮中(-196℃)冷凍保存。
洗脫液的配制在基礎(chǔ)溶液BS2中添加蔗糖，濃度為0.125Mol/L。
解凍和培養(yǎng)將凍存麥管從液氮中拿出，迅速放入39-40℃水浴中，使其快速解凍，麥管從液氮中移出到進(jìn)入水浴的時(shí)間在1-2秒。待胚胎乳白色即將消失時(shí)將麥管從水浴中拿出，剪去封口，用0.125M的蔗糖2ml將麥管中的胚胎沖到培養(yǎng)皿中進(jìn)行洗脫，時(shí)間為10min；添加滅菌海水進(jìn)行培養(yǎng)。
與已有技術(shù)對(duì)比，本發(fā)明技術(shù)具有如下特點(diǎn)
(1)傳統(tǒng)的魚(yú)類(lèi)胚胎冷凍保存技術(shù)是程序控制慢速降溫法，這種方法無(wú)法避免胚胎細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，因而在魚(yú)類(lèi)胚胎冷凍保存中始終未能獲得成功。本發(fā)明技術(shù)采用獨(dú)特的玻璃化液配方和工藝流程，建立的玻璃化冷凍法的降溫速率極高， 能最大限度減少降溫過(guò)程中胚胎細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，使胚胎免受冰晶的損傷，從而獲得冷凍復(fù)活的胚胎和魚(yú)苗。
(2)本發(fā)明技術(shù)可重復(fù)獲得冷凍復(fù)活的牙鲆胚胎，而以前在淡水魚(yú)類(lèi)上利用程序控制降溫法只是偶爾獲得一次復(fù)活的胚胎，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能重復(fù)。本發(fā)明技術(shù)在8次玻璃化冷凍保存實(shí)驗(yàn)中均獲得過(guò)數(shù)量不等的牙鲆冷凍復(fù)活胚胎，從冷凍保存的292粒牙鲆胚胎中共獲得復(fù)活胚20粒，冷凍解凍后胚胎最低復(fù)活率為1.64％，最高復(fù)活率為32.35％，冷凍胚胎平均復(fù)活率達(dá)6.8％。
(3)應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)多次成功地使冷凍復(fù)活胚胎繼續(xù)發(fā)育并孵化出魚(yú)苗，這一結(jié)果為國(guó)內(nèi)外首次獲得，居國(guó)際領(lǐng)先水平。我們?cè)?次玻璃化冷凍保存實(shí)驗(yàn)中，均獲得過(guò)冷凍復(fù)活胚胎繼續(xù)發(fā)育并孵化出魚(yú)苗的結(jié)果。在20枚冷凍復(fù)活胚胎中，共有14枚凍胚孵化出魚(yú)苗，孵化率為70％。冷凍復(fù)活胚胎孵化出的魚(yú)苗，胚體透明，形態(tài)正常，無(wú)畸形，與未冷凍的正常魚(yú)苗完全一樣。充分證明，本發(fā)明技術(shù)具有可靠性和可重復(fù)性。
(4)本發(fā)明技術(shù)無(wú)需使用昂貴的儀器設(shè)備，操作較為簡(jiǎn)單，成本低廉，易于推廣。
具體實(shí)施例方式
魚(yú)類(lèi)胚胎玻璃化冷凍保存方法其技術(shù)路線是胚胎收集→胚胎質(zhì)量及發(fā)育階段的確定→篩選玻璃化基礎(chǔ)液和抗凍劑→玻璃化液的制備→胚胎冷凍前在玻璃化液中的平衡→胚胎向麥管中的轉(zhuǎn)移、麥管的封口、含胚胎的麥管的平衡→在液氮中的冷凍保存→麥管的解凍→胚胎的洗脫與平衡→胚胎的培養(yǎng)。
現(xiàn)以牙鲆胚胎進(jìn)行的玻璃化冷凍保存的成功實(shí)驗(yàn)敘述如下
(1)胚胎收集按照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行牙鲆生產(chǎn)性育苗，收集人工條件下自然產(chǎn)卵的牙鲆受精卵在14-16℃培養(yǎng)，用顯微鏡觀察胚胎發(fā)育階段，選取發(fā)育至肌節(jié)出現(xiàn)期、尾芽期、心跳期、出膜前期等不同時(shí)期胚胎作為冷凍保存材料。
(2)胚胎玻璃化基礎(chǔ)溶液的篩選魚(yú)類(lèi)胚胎都是在一定的水環(huán)境中發(fā)育的。海水魚(yú)類(lèi)胚胎和魚(yú)苗發(fā)育和生活的環(huán)境與淡水魚(yú)類(lèi)完全不同。因此，必須根據(jù)海水魚(yú)類(lèi)胚胎的生理狀況，配制相適應(yīng)的基礎(chǔ)溶液。我們?cè)诖罅繉?shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用NaCl、KCl、CaCl2.2H2O、MgCl2.6H2O、NaHCO3等配制成4種不同濃度的溶液，在室溫(15-16℃)下對(duì)牙鲆原腸期胚胎進(jìn)行培養(yǎng)，使其發(fā)育至出膜，統(tǒng)計(jì)其孵化率。選擇成活率最高的溶液作為配制玻璃化液和洗脫液的基礎(chǔ)溶液(縮寫(xiě)為BS)。其結(jié)果見(jiàn)表1
表1不同基礎(chǔ)液配方篩選結(jié)果
基礎(chǔ)溶 基礎(chǔ)液成分(％)
液名 NaCl KCl CaCl2 MgCl2. NaHCO3 總鹽度 胚胎孵化率(％)
稱(chēng) .2H2O 6H2O (％)
BS12.3750.0760.1360.4660.0183.06878.33±16.37
BS22.4720.0860.1460.4860.0193.20981.5±5.57
BS32.5720.0860.2360.5660.0283.48874.84±6.01
BS42.7920.11 0.23 0.64 0.03 3.80270.73±10.17
由表1可見(jiàn)，基礎(chǔ)溶液BS2產(chǎn)生的胚胎孵化率最高(81.5％)，故選用BS2作為配制玻璃化液和洗脫液的基礎(chǔ)溶液。
(3)抗凍劑毒性的比較不同種類(lèi)抗凍劑對(duì)不同魚(yú)類(lèi)胚胎的毒性不盡相同，我們以大菱鲆胚胎為材料，進(jìn)行了抗凍劑篩選實(shí)驗(yàn)。將大菱鲆神經(jīng)胚分別放在二甲亞砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、甘油、乙二醇(EG)，1，2-丙二醇(PG)及甲醇(MeOH)中平衡處理70min，然后觀察胚胎的發(fā)育，計(jì)數(shù)成活率。其結(jié)果示于表2。
表2.不同種類(lèi)抗凍劑毒性的比較
抗凍劑 DMSO DMF甘油 EGPG 甲醇
胚胎數(shù)(粒)
10 13 23 14 13 12 11 22 15 19 14 11 141312 1828 17
(n＝3)
成活胚數(shù) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 9 4 12 4 06
成活率％ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 64.4 30.8 100 22.2 035.2
平均成活率％ 0 0 0 0 65.1 19.2
結(jié)果表明，只有PG(1，2-丙二醇)和甲醇中的胚胎存活，成活率分別為65.1％和19.2％，其它抗凍劑中的胚胎全部死亡，可見(jiàn)PG的毒性最低，其次為甲醇。故將1，2-丙二醇(PG)和甲醇(MeOH)選作海水魚(yú)類(lèi)胚胎冷凍保存的抗凍劑。
(4)適宜玻璃化的抗凍劑的篩選能否形成玻璃化及玻璃化狀態(tài)的好壞，是建立玻璃化冷凍技術(shù)的關(guān)鍵之一。利用1，2-丙二醇(PG)、甲醇(MeOH)、甘油(Gly)、二甲基甲酰胺(DMF)、乙二醇(EG)和二甲基亞砜(DMSO)等6種抗凍劑，以毒性最小的PG為主因子，在15、20、25、30％(v/v)四個(gè)濃度梯度水平上進(jìn)行組合，利用BS2為基礎(chǔ)溶液，配制成A、B、C、D四組80種不同組成、不同濃度的抗凍劑溶液。將上述各種抗凍劑溶液充裝在麥管中后置于液氮(-196℃)中冷凍10-30min，然后在40℃水浴中迅速解凍，同時(shí)觀察冷凍和解凍時(shí)的玻璃化狀態(tài)，將玻璃化記為“+”，非玻璃化或脫玻璃化記為“-”，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，選擇冷凍和解凍時(shí)玻璃化次數(shù)最多的抗凍劑用于玻璃化液配制。現(xiàn)將篩選出的玻璃化程度較好的幾種溶液的結(jié)果列于表3
表3玻璃化液組成及解凍溫度
玻璃 總濃度 玻璃化程度*
化液 組成 易玻璃化解凍溫度
代號(hào) (％v/v)冷凍 解凍 (℃)
VSD1 PG4+MeOH145 3+2+，1-37～38
VSD2 PG4+MeOH250 3+2+，1-35～42
VSD5 PG4+Gly1 45 3+2+，1-42
VSD9 PG4+DMF1 45 3+2+，1-39
VSD10PG4+DMF2 50 2+，1-2+，1-39～40
VSD14PG4+EG2 50 3+2+，1-35～37
注在冷凍時(shí)“3+”表示3次玻璃化，在解凍時(shí)“2+，1-”表示2次玻璃化，1次脫玻璃化。
從表3可以看出，上述幾種玻璃化溶液的玻璃化概率較高，玻璃化程度較好，但它們?cè)诮鈨鰰r(shí)保持玻璃化狀態(tài)所要求的溫度不盡相同。有些玻璃化液的玻璃化狀態(tài)不錯(cuò)，但他們所要求的解凍溫度不是過(guò)低(如VSD1和VSD14)，就是溫度范圍太狹小(如VSD5和VSD9)。而只有VSD2的玻璃化狀態(tài)又好，又能在35-42℃的較寬水溫范圍內(nèi)解凍而保持玻璃態(tài)。
因此，從抗凍劑的毒性及其玻璃化性質(zhì)等方面綜合考慮，我們篩選出適宜進(jìn)行玻璃化冷凍的理想抗凍劑為1，2-丙二醇(PG)和甲醇(MeOH)。
(5)牙鲆胚胎玻璃化溶液的配制及篩選用步驟(1)中篩選出的基礎(chǔ)溶液BS2將抗凍劑1，2-丙二醇(縮寫(xiě)為PG)和甲醇(縮寫(xiě)為MeOH)按一定比例混合，配制成如下四種玻璃化溶液(FVS1-FVS4)FVS1含BS267％，PG 20％及MeOH 13％；FVS2含BS2 60％，PG 24％及MeOH 16％；FVS3含BS2 55％，PG 27％及MeOH 18％；FVS4含BS2 50％，PG 30％及MeOH 20％。然后將牙鲆肌肉效應(yīng)期胚胎放在上述玻璃化溶液中進(jìn)行平衡處理?，F(xiàn)將處理后的胚胎的成活率、孵化率及畸形率列于表4。
表4牙鲆肌肉效應(yīng)胚在不同玻璃化液中的成活率(％)
玻璃化液 FVS1 FVS2FVS3 FVS4
胚胎成活率(％)54.29±4.4638.68±12.2037.8±1.51 27.71±1.29
孵化率(％)86.49±8.7887.87±5.24 69.21±14.139.42±5.43
畸形率(％)3.25±5.29 9.63±4.46 3.70±6.41 35.71±12.37
由表4可見(jiàn)，胚胎在玻璃化液FVS1、FVS2和FVS3中平衡處理后的成活率和孵化率都明顯高于FVS4處理組，而畸形率則明顯低于FVS4處理組。由此表明，玻璃化液FVS1、FVS2和FVS3都較適合于牙鲆胚胎的玻璃化冷凍保存。
(6)適宜玻璃化處理的胚胎發(fā)育時(shí)期的確定胚胎發(fā)育時(shí)期不同，對(duì)抗凍劑及玻璃化液的耐受能力不同。針對(duì)第(1)條中的胚胎收集，本條將牙鲆4-5對(duì)體節(jié)胚、16-18對(duì)體節(jié)胚、尾芽期胚和心跳期胚分五步進(jìn)入玻璃化液FVS3中，分別處理30min、40min和50min，然后用0.125mol/L蔗糖液洗脫10min。加入滅菌海水培養(yǎng)一定的時(shí)間，統(tǒng)計(jì)成活率，結(jié)果如表5
表5不同發(fā)育時(shí)期牙鲆胚胎在玻璃化液FVS3中處理后的成活率
由表5可以看出，4-5對(duì)肌節(jié)胚、16-18對(duì)肌節(jié)胚和尾芽期胚在玻璃化液FVS3中平衡處理不同時(shí)間后的成活率都較高，而心跳期胚對(duì)FVS3的適應(yīng)能力則明顯低。由此表明，4-5對(duì)肌節(jié)胚、16-18對(duì)肌節(jié)胚及尾芽期胚胎較適合于玻璃化液處理。
(7)胚胎平衡溫度的確定分別在15℃和4℃下，利用FVS3五步法處理牙鲆尾芽開(kāi)始形成期胚胎40min，不經(jīng)冷凍，直接用0.125mol/L的蔗糖洗脫10min，用過(guò)濾海水培養(yǎng)(15.5℃)，統(tǒng)計(jì)其成活率，比較不同平衡溫度對(duì)胚胎成活率的影響，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可見(jiàn)，牙鲆胚胎在15℃平衡后的成活率明顯高于在4℃下的成活率，故選定15℃為有效平衡溫度。
表6不同平衡溫度下尾芽胚的成活率(％)
平衡溫度℃15.0 4.0
五步平衡時(shí)間min 40 40
洗脫時(shí)間min 10 10
成活率(％)83.67±5.7666.27±14.47
(8)胚胎在玻璃化液中平衡步驟的確定采用一步法、三步法或五步法將肌節(jié)出現(xiàn)期胚胎逐步過(guò)渡到玻璃化液(20％DMSO和25％二甲基甲酰胺)中在室溫下平衡處理40分鐘，后用1mol/L蔗糖液洗脫，再用12℃過(guò)濾海水培養(yǎng)，觀察其成活率和孵化率；結(jié)果如表7所示
表7胚胎在不同平衡方法下的成活率
由表7可見(jiàn)，經(jīng)3次重復(fù)試驗(yàn)，肌節(jié)期胚胎采用五步法平衡后的成活率和孵化率明顯高于三步法和一步法組，因此，在隨后的冷凍保存實(shí)驗(yàn)中，都采用五步平衡法。
(9)玻璃化冷凍將在玻璃化液中平衡好的胚胎，連同玻璃化液一起吸入麥管，麥管直徑為2.5mm，長(zhǎng)度為10cm。每管吸入250μl玻璃化液，其中胚胎10余枚，使胚胎在麥管中均勻分布，避免聚集在一起；用火封口后，將麥管以2000℃/min以上的降溫速率投入-196℃的液氮中進(jìn)行玻璃化冷凍保存。保存時(shí)間長(zhǎng)短根據(jù)實(shí)際需要確定。
(10)洗脫液的篩選采用五步法將尾芽期胚胎放在VSD2玻璃化液中平衡處理30min，然后在-20℃冷凍10min，分別用0.0625、0.125、0.25、0.5或1.0Mol/L蔗糖溶液進(jìn)行洗脫，10min后將胚胎轉(zhuǎn)移至海水中，在室溫下(15℃)培養(yǎng)一定時(shí)間，統(tǒng)計(jì)成活率。如表8所示。
由表8可見(jiàn)，0.125Mol/L蔗糖液的洗脫效果最好，胚胎成活率最高。
表8不同濃度蔗糖液的洗脫效果
蔗糖濃度(M) 0.0625 0.125 0.25 0.5 1.0
總樣本數(shù) 72 85 7786 105
成活胚5 14 6 77
平均成活率(％)4.7618.8 8.67 9.83 5.7
(11)胚胎解凍和培養(yǎng)將麥管從液氮中取出，快速插入39-40℃水浴中，不停的搖動(dòng)解凍，麥管從液氮中移出到進(jìn)入水浴的時(shí)間在1-2秒，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)反玻璃化，導(dǎo)致胚胎破碎。在水浴中玻璃態(tài)由透明變?nèi)榘?，再變透明，胚胎的乳白色即將消失時(shí)將麥管從水浴中拿出，剪去封口，迅速用2ml 0.125M的蔗糖洗脫液沖到培養(yǎng)皿中洗脫，洗脫10min后加入14-16℃滅菌海水培養(yǎng)，直到魚(yú)苗孵化出膜。現(xiàn)將牙鲆胚胎玻璃化冷凍保存的主要結(jié)果示于表9。
表9牙鲆胚胎玻璃化冷凍保存結(jié)果
玻璃化胚胎發(fā)育冷凍 樣本數(shù)復(fù)活復(fù)活率孵出魚(yú)苗數(shù)成活時(shí)間
溶液 時(shí)期時(shí)間 胚數(shù)(％)(h)
FVS3 14體節(jié)胚1h 211 4.76 1 108
FVS1 尾芽胚 1h 3411 32.35 9 90
FVS3 尾芽胚 7h33min352 5.71 1 67
FVS3 尾芽胚 1h22min321 3.13 0 18
FVS4 尾芽胚 1h8min 441 2.27 0 72
FVS4 尾芽胚 2h20min351 2.86 0 61
FVS2 肌肉效應(yīng)1h31min302 6.67 2 62
期胚
FVS3 出膜前胚2h34min611 1.64 1 14
總計(jì) 20 14
由表9可見(jiàn)，應(yīng)用上述技術(shù)方案，對(duì)牙鲆體節(jié)期胚，尾芽胚，肌肉效應(yīng)胚，出膜前期胚進(jìn)行了玻璃化冷凍保存實(shí)驗(yàn)，在8次不同的玻璃化冷凍保存實(shí)驗(yàn)中，成功地獲得冷凍復(fù)活胚胎。從292枚冷凍胚胎中，共獲得20枚完全復(fù)活的胚胎，凍胚復(fù)活率最高可達(dá)32％，解凍后胚胎形態(tài)正常，繼續(xù)發(fā)育并孵化出魚(yú)苗，其中14枚復(fù)活胚胎成功孵化出魚(yú)苗，復(fù)活胚胎孵化出魚(yú)苗的百分率高達(dá)70％，凍胚孵化出的魚(yú)苗形態(tài)正常。
權(quán)利要求
1.一種魚(yú)類(lèi)胚胎玻璃化冷凍保存方法，其特征在于它的操作技術(shù)是，包括魚(yú)類(lèi)胚胎收集、制備基礎(chǔ)液和篩選抗凍劑、配制玻璃化液、胚胎冷凍前的平衡處理、投入到液氮中予以冷凍保存等，之后待需時(shí)，予以解凍培育，其魚(yú)類(lèi)胚胎收集為體節(jié)出現(xiàn)期—出膜前期；玻璃化液配制是基礎(chǔ)液和抗凍劑的混合液，基礎(chǔ)液(BS2)為NaCl 2.472％、KCl 0.086％、CaCl2·2H2O 0.146％、MgCl2·6H2O 0.486％、NaHCO3 0.019％；抗凍劑為1，2-丙二醇(PG)、甲醇(MeOH)；玻璃化液配方是BS250-67％，PG20-30％，MeOH13-20％；胚胎冷凍前的平衡處理將胚胎逐級(jí)依次在濃度為25％、33％、50％、67％及100％的玻璃化液中分五次進(jìn)行平衡處理，處理45-55min，每步9-11min；液氮中速凍保存將平衡好的胚胎9-13粒連同250ul的玻璃化液吸入到直徑3mm、長(zhǎng)10cm麥管內(nèi)，熱壓封口后，以2000℃/min的降溫速率投入到-196℃液氮中速凍保存；解凍和培育將麥管從液氮中移出，在1-2秒鐘時(shí)間內(nèi)快速插入39-40℃水浴中使其迅速解凍，在胚胎乳白色即將消失時(shí)，剪開(kāi)麥管，用2ml 0.125M的蔗糖洗脫液，將胚胎沖入器皿中進(jìn)行洗脫，時(shí)間為10min，之后添加14-16℃滅菌海水進(jìn)行培育。
全文摘要
一種魚(yú)類(lèi)胚胎玻璃化冷凍保存方法，通過(guò)比較不同抗凍劑的毒性效應(yīng)和玻璃化性能，篩選出適宜海水魚(yú)類(lèi)胚胎的玻璃化液配方；確定適宜玻璃化處理的胚胎發(fā)育時(shí)期，研制出特定的洗脫溶液，采用分步平衡、快速降溫和解凍的技術(shù)路線，建立了魚(yú)類(lèi)胚胎玻璃化冷凍保存技術(shù)。對(duì)牙鲆不同發(fā)育時(shí)期胚胎進(jìn)行了8次玻璃化冷凍實(shí)驗(yàn)中共獲得冷凍復(fù)活胚20粒，最高復(fù)活率達(dá)32％。其中5次實(shí)驗(yàn)中獲得冷凍復(fù)活胚胎發(fā)育孵化出魚(yú)苗的結(jié)果。在20枚冷凍復(fù)活胚胎中，有14枚凍胚孵化出魚(yú)苗，孵化率高達(dá)70％。凍胚孵出的魚(yú)苗，胚體透明，形態(tài)正常，無(wú)畸形。本發(fā)明技術(shù)無(wú)需昂貴的儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)單，成本低廉，易于推廣，可用于牙鲆等海水魚(yú)類(lèi)胚胎超低溫(－196℃)冷凍保存。
文檔編號(hào)A01K61/00GK1552200SQ0311241
公開(kāi)日2004年12月8日 申請(qǐng)日期2003年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月29日
發(fā)明者陳松林, 田永勝 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所