專利名稱：一種克服基因型障礙的小麥組織培養方法
技術領域：
本發明涉及一種克服基因型障礙的小麥組織培養方法。
背景技術：
目前，轉基因小麥的研究基本處于建立和優化轉基因體系階段，與水稻、玉米相比研究差距很大。主要原因之一是小麥轉基因受體的植株再生頻率偏低和基因型障礙，這已經成為限制小麥轉基因成功的瓶頸。植株再生頻率高的小麥品種，無論用基因槍法還是農桿菌法都已經得到轉基因植株，而植株再生頻率差的品種即使用基因槍法也無法得到轉基因植株。正是由于品種的基因型差異而導致的再生頻率問題，使全世界的轉基因小麥研究大都集中在諸如Bobwhite、Pavon等少數基因型上，而這類基因型綜合性狀往往不夠理想，較難在生產中應用。
作為小麥基因轉化的受體，取決于所用的轉基因方法。因為未成熟胚及其愈傷組織具有相對較強的再生能力，作為受體較容易再生出轉基因植株，目前未成熟胚及其衍生物被公認并被廣泛采用。如文獻(Vasil V，et al，Bio/Technology，1992，10667-674)以長期培養的胚性愈傷組織為外植體，通過基因槍將GUS/Bar基因導入小麥品種“Pavon”，獲得對除草劑Basta具有抗性的再生植株及其后代。但是，這個受體系統的植株再生頻率仍然偏低，且仍較明顯地受品種基因型的制約，特別是有接近20％的基因型很難得到再生植株。還有人在小麥組織培養中選擇小花分化至四分體形成期的幼穗作為外植體，但其結果并不比傳統的未成熟胚及其衍生物受體材料優越(舒理慧，科學通報，1982，14882-884；陳梁鴻等，華北農學報，1998，131-5)。
先前研究者大多只選擇了1個或幾個品種基因型為材料，由于研究的品種數量小，不具代表性，這些研究均難以回答和解決基因型障礙問題。因此，提高小麥轉基因受體的植株再生頻率和克服基因型障礙，是獲得小麥轉基因成功的重要因素。
發明內容
本發明要解決的技術問題是選擇適宜外植體及培養條件，以提高小麥轉基因受體的植株再生頻率和克服基因型障礙本發明研究了不同發育時期的幼穗對離體培養的反應。
本發明選用了5個品種(品系)植物材料。取材時期分別為二棱期(1mm)、護穎原基形成期(2mm)、小花原基形成期(2.5mm)、雌雄蕊原基形成期(4mm)、藥隔分化期(6mm)和四分體形成期(10mm)，對這些時期的幼穗進行離體培養，在分化培養之后增加了一個芽苗的誘導及伸長階段。
比較不同時期幼穗的愈傷組織誘導率和綠苗分化率，結果表明，護穎期、小花分化期、雌雄蕊原基分化期的幼穗，不僅愈傷組織誘導率高，而且分化綠苗也較多，說明小麥幼穗離體培養的適宜時期是護穎分化期到雌雄蕊原基分化期1、選擇幼穗作為適宜的外植體；2、找出了幼穗的最佳發育時期，為護穎分化期到雌雄蕊原基分化期，即幼穗長度為2～3mm；3、研究出了不同培養時期各個適宜的培養基與培養條件如下誘導培養基為MS+2、4-D(2mg/l)；分化培養基為MS基本培養基；壯根培養基為1/2MS+IAA2mg/l。
芽苗伸長培養基為MS+NAA0.2mg/l+BA1.5mg/l。
培養條件愈傷組織誘導期室溫(25±1)℃，暗培養；綠苗分化期室溫(26±1)℃，12h/d光培養，光照度為1500-2000lx。
4、圍繞保證愈傷組織發生過程中形態建成的完整和正常，適當延長脫分化過程，在分化潛力高峰期轉入再生培養。
本發明通過選擇適宜外植體、調整培養基成份和配套改進措施，可有效克服小麥組織培養中基因型障礙問題，大幅度提高植株再生頻率和組織培養效率。在76個基因型的試驗中，適時幼穗的愈傷組織的平均誘導頻率達到98％以上，比未成熟胚的絕對百分比高29％，愈傷組織平均植株再生頻率達到71％，比未成熟胚的絕對百分比高54％，所有參試的基因型均能獲得再生植株。
具體實施例方式
實施例1 不同發育時期的幼穗對離體培養的反應A植物材料選用6756、8581、H89、311和1772共5個品種(品系)。
B取材時期分別對二棱期(1mm)、護穎原基形成期(2mm)、小花原基形成期(2.5mm)、雌雄蕊原基形成期(4mm)、藥隔分化期(6mm)和四分體形成期(10mm)時期的幼穗進行離體培養，其中，藥隔期和四分體期幼穗切成2-3段培養。接種前用0.1％HgCl2消毒8-10分鐘，無菌水沖洗3-5次，用鑷子與解剖針剝離出幼穗，接種于誘導培養基上。
C培養基誘導培養基為MS+2、4-D(2mg/l)；分化培養基為MS基本培養基；芽苗伸長培養基為MS+NAA0.2mg/l+BA1.5mg/l；壯根培養基為1/2MS+IAA2mg/l。
D培養條件愈傷組織誘導期室溫(25±1)℃，暗培養；綠苗分化期室溫(26±1)℃，12h/d光培養，光照度為1500-2000lx。
操作步驟①接種前選好材料，用0.1％HgCl2消毒8-10分鐘，無菌水沖洗3-5次，用鑷子與解剖針剝離出幼穗，接種于誘導培養基上25-30天，誘導愈傷組織；②愈傷組織轉接到分化培養基上25-30天；③在芽苗伸長培養基上培養25-30天，誘導芽苗長出及伸長。
④待苗長至3cm左右高時，將綠苗轉至壯根培養基上；⑤比較不同時期幼穗的愈傷組織誘導率和綠苗分化率。
結果見表1和表2表1 小麥不同時期出愈率的比較護穎原基 小花原基雌雄蕊原藥隔 四分體品種 二棱期形成期形成期 基形成期分化期形成期6756 97.4 100 100 96.795.8 968581 - 92.9 96.9100 100 93.2H8996 98.8 100 98.4100 92311- 100 100 100 98.5 1001772 98.8 100 100 100 98.7 97.2表2小麥不同時期綠苗分化率的比較品種 二棱期 護穎原基形 小花原基形 雌雄蕊原基 藥隔期四分體成期 成期 形成期時期6756 18.4 68.8 54.940.432.4 34.28581 - 49 53.751.927.4 -H89 2 5.118.827 18.7 4.2
311 - 54.640.645.436.426.7177916133 19.438.926.626.5從上表中看出，二棱期、藥隔期和四分體時期的幼穗雖然都能誘導出愈傷組織，但狀態不好，綠苗分化的頻率較低。
護穎期、小花分化期、雌雄蕊原基分化期的幼穗，不僅愈傷組織誘導率高，而且分化綠苗也較多，結論小麥幼穗離體培養的適宜時期是護穎分化期到雌雄蕊原基分化期。
實施例2不同外植體對離體培養的反應A適期幼穗選材與培養方法同上；B未成熟胚選材與培養方法操作步驟a.取開花后14天未成熟胚，用0.1％HgCl2消毒8-10分鐘，無菌水沖洗3-5次，用鑷了與解剖針剝離出幼胚，接種于誘導培養基上暗培養25-30天；b.愈傷組織轉接于分化培養基上進行分化(25-30天)；c.綠苗轉接于壯根培養基上。
培養基與培養條件誘導培養基為MS+2、4-D(2mg/1)；分化培養基為MS基本培養基；壯根培養基為1/2MS+IAA2mg/l。愈傷組織誘導期室溫(25±1)℃，暗培養；綠苗分化期室溫(26±1)℃，12h/d光培養，光照度為1500-2000lx。
C試驗方法選用24個品種(品系)的適期幼穗和未成熟胚作為外植體，并圍繞保證愈傷組織發生過程中形態建成的完整和正常，適當延長脫分化過程，在分化潛力高峰期轉入再生培養，比較研究了24個品種(品系)適期幼穗和未成熟胚的愈傷組織誘導率和綠苗分化率。
D試驗結果不同基因型的適期幼穗和未成熟胚的愈傷組織誘導率均高，但不同外植體愈傷組織的形成及狀態不同，適期幼穗接種后一周左右可見愈傷組織，淡黃色，質地較硬；未成熟胚接種后2-3天即可見愈傷組織，白色、質地松軟。不同基因型對適期幼穗、未成熟胚的綠苗分化率的影響很大。24個品種的適期幼穗綠苗分化率平均為40％，最高達85％；而未成熟胚綠苗分化率平均只有10％，最高為48.72％；有近50％的品種的未成熟胚的綠苗分化率均在10％以下，其中2個品種為0(晉麥60和原冬9428)，而相對應的適期幼穗的綠苗分化率平均達到了39％(見表3)。
研究還發現，當分別用H6756品系的未成熟胚和適時幼穗作基因槍法轉化的受體時，未成熟胚的未獲得再生植株，而基因槍轟擊后適時幼穗的植株再生頻率達到37.7％。
E結論通過選擇適宜外植體、調整培養基成份和配套改進措施，可有效克服小麥組織培養中基因型障礙問題，大幅度提高植株再生頻率和組織培養效率。
表3不同外植體對小麥離體培養的反應*
*適時幼穗的幼穗長度為2-3mm；未成熟胚為開花后14-16天的幼胚。
實施例1不同外植體對離體培養的反應對36個品種(品系)適宜時期的幼穗和幼胚進行了愈傷組織誘導率和綠苗分化率的比較研究，結果表明，不同基因型的幼穗和幼胚的愈傷組織誘導率均高，但不同外植體愈傷組織的形成及狀態不同，幼穗接種后一周左右可見愈傷組織，淡黃色，質地較硬；幼胚接種后2-3天即可見愈傷組織，白色、質地松軟。基因型對幼穗、幼胚的綠苗分化率的影響很大，幼穗最高綠苗分化率可達85％(冀Z76)；幼胚最高綠苗分化率只有48.72％(藁城8901)。
權利要求
1.一種克服基因型障礙的小麥組織培養方法，其特征是將護穎分化期到雌雄蕊原基分化期的小麥幼穗作為外植體，進行下述操作①接種于誘導培養基上25-30天，誘導愈傷組織；②愈傷組織轉接到分化培養基上25-30天；③在芽苗伸長培養基上培養25-30天，誘導芽苗長出及伸長；④待苗長至3cm左右高時，將綠苗轉至壯根培養基上。
2.權利要求1所述的小麥組織培養方法，其中所述誘導培養基為MS+2、4-D(2mg/l)；分化培養基為MS基本培養基；壯根培養基為1/2MS+IAA2mg/l；芽苗伸長培養基為MS+NAA0.2mg/l+BA1.5mg/l。
3.權利要求1所述的小麥組織培養方法，其中培養條件為愈傷組織誘導期室溫(25±1)℃，暗培養；綠苗分化期室溫(26±1)℃，12h/d光培養，光照度為1500-2000lx。
全文摘要
一種克服基因型障礙的小麥組織培養方法。本發明選擇幼穗作為適宜的外植體；找出了幼穗的最佳發育時期，為護穎分化期到雌雄蕊原基分化期。研究出了不同培養時期各個適宜的培養基與培養條件。本發明通過選擇適宜外植體、調整培養基成分和配套改進措施，可有效克服小麥組織培養中基因型障礙問題，大幅度提高植株再生頻率和組織培養效率。
文檔編號A01H3/02GK1502227SQ02149150
公開日2004年6月9日 申請日期2002年11月25日 優先權日2002年11月25日
發明者劉錄祥, 趙林姝, 鄭企成, 王晶, 趙世榮, 郭會君, 陳文華 申請人:中國農業科學院原子能利用研究所