專利名稱：一種植物脫病毒快速繁殖的方法
技術領域：
本發明涉及一種無性繁殖植物脫病毒快速繁殖的方法，具體地說，涉及一種誘導植物進入種子繁殖階段，形成種子或未成熟種子(胚)，檢驗其是否帶毒，取無病毒種子胚進行組培擴大，然后進行快速繁殖的方法。
背景技術：
無性繁殖植物病毒病的發生相對普遍和嚴重，所有的植物病毒無一例外均可以通過無性繁殖方式(扦插、嫁接和)垂直傳播。該類植物由于沒有種子繁殖過程，因此其病毒表現逐漸累積和終身帶毒的特點。病毒的長期大量累積，造成無性繁殖植物的種質退化。同時，普遍帶毒(幾乎所有木本和塊莖塊根繁殖的植物都100％攜帶病毒)的植物在自身的生命力下降的同時，引發病毒擴散，可能使周邊農作物和經濟作物遭受病毒的危害，因此，對無性繁殖植物進行病毒檢測是一項非常有價值得工作，尤其是當植物材料來自外地、外國銷售品和需要異地擴散時，病毒檢測和無病毒繁殖體的采用尤為重要。通過組織培養脫除病毒，獲得純凈的植物繁殖體，不僅可以恢復植物生長活力，獲得“復壯”效果，同時還能夠大大提高植物產品的環境安全性，保障產品銷售環節暢通。組織培養獲得的無病毒苗，由于可以從一株母體上獲得遺傳基礎和外觀、品質形狀均一的繁殖體和產品，對于形成植物產品品牌具有無與倫比的優勢。
組培與脫病毒苗生產的關鍵是脫毒技術。獲得無病毒植株的方法有多種，例如熱處理脫毒、芽尖培養脫毒和莖尖微芽嫁接脫毒以及其組合方法。普遍采用的較好的方法是芽尖培養脫毒法，具體的步驟是通過植物頂端分生組織切取小塊(0.2mm以下分生組織)，用各部位器官和組織的培養去分化誘導愈傷組織，然后從愈傷組織再分化產生芽，長成小植株得到脫毒苗是目前通常采用的方法。相關的技術已有許多的專利。例如，CN1031637A、CN1238122A、CN1258435A、CN1258436A披露了采用芽尖組織作為外植體，用消毒劑消毒處理后進行組織培養，得到脫毒苗的方法。WO00/78128公開了培養球莖或塊莖葉基部分的園頂形組織，獲得無毒植物的方法。JP5130816A、JP5084028A公開了一種采用葉芽或苗尖作為外植體在含有6-BA、激動素等激素的固體培養基上培養，獲得無病毒人工草莓的方法。
但是這種分生組織脫毒法存在二個問題1)但由于植物愈傷組織中病毒濃度降低的原因目前還存在著爭議，獲得的脫毒苗不一定完全脫毒，因此需要對大量樣品進行病毒檢測，而病毒檢測往往存在靈敏度的問題；2)需要切取小塊頂端分生組織，具有一定難度，切取組織越小，成活率越低，同時，容易造成污染；3)切取組織越小越容易導致變異發生。
因此，農業生產中仍就需要一種更好的脫毒方法。
針對現有技術的不足，本發明者進行了深入細致的研究，結果發明，通過誘導植物種子胚形成，檢驗其是否帶毒，取無病毒種子胚(一種未成熟種子形式)進行組培擴大，然后進行快速繁殖的方法，于是完成了本發明。
發明內容
本發明的目的是提供一種新的脫病毒方法，它包括如下步驟，通過誘導植物進入種子繁殖階段，形成種子或未成熟種子(胚)，檢驗種子胚是否帶毒，取無病毒種子胚進行組培擴大，獲得大量獲得低病毒負荷量的繁殖體，然后進行快速繁殖的方法。
本發明中所述的植物是指在自然條件下不易產生種子的植物，例如，蘭科、天南星科、旋花科和姜科植物等，優選蘭科、天南星科、旋花科植物。
蘭科植物可以是例如蘭科藥用植物如石斛、金線蓮、天麻、蘭科花卉植物如中國蘭、大花蕙蘭，優選蘭科藥用植物石斛如鐵皮石斛、金線蓮、天麻，蘭科花卉植物如蘭花。
天南星科植物可以是例如半夏、魔芋、芋頭、海芋、象耳芋、萬年青，優選半夏、魔芋、芋頭。
本文中所述的種子繁殖階段形成的是例如未成熟種子胚、未成熟種子和種子，優選未成熟種子胚。
所述的無病毒種子胚可以是上述的未成熟種子胚，也可以取自長在種子或未成熟種子之中種子胚。
本文中所述的病毒指RNA病毒、類病毒、DNA病毒和植物菌原體，優選是RNA病毒。
本發明方法中，通過激素處理所獲得的低病毒負荷量繁殖體的隨后快速繁殖采用常規的方法進行，例如，組培脫毒前，將整株植物經過茉莉酸類似物處理。
與現有的各種植物脫毒方法相比，本發明的方法具有脫毒成功率更高的優點。無病毒半夏比野生半夏在2年的栽培試驗對比中，產量增加至138％～400％，品質明顯改觀。
實施例本發明通過下文的非限定性實施例進行說明。
實施例1掌葉半夏選取品質上乘的掌葉半夏(Pinellia cordata)40個種球進行盆栽，在43d～60d內開始出現花蕾，用不同株進行人工授粉雜交，25天內獲得未成熟種籽，通過未成熟種籽的培養去分化誘導愈傷組織，然后從愈傷組織再分化產生芽，獲得新生植株。分別用DsMV基因組的3′末端序列，5 ′-α-32P作標記制備DNA探針，對新的植株進行病毒RNA點雜交檢測，確定99％的植株確定不攜帶該病毒。以不攜帶DsMV病毒的掌葉半夏珠芽，進行消毒組培，獲得組培苗，形成新的無病毒優質種苗。
實施例2盾葉半夏選取個體均一、品質優良的盾葉半夏(Pinellia ternata)30個種球進行盆栽，在36～55內進入開花期，開花前期采用異株人工授粉雜交，37天內獲得種籽，無菌水浸種處理生芽，再在無菌條件下切取新芽頂端分生組織接種在MS培養基上，附加一定的植物生長調節劑組合，誘導產生新芽，獲得新植株。分別用DsMV基因組的3′末端序列及為模板制備DNA探針，對新的植株進行病毒RNA點雜交檢測，確定98％的植株確定不攜帶該病毒。以不攜帶DsMV病毒的盾葉半夏珠芽，進行消毒組培，獲得組培苗，形成新的無病毒優質種苗。
實施例3芋頭選取品質上乘的芋頭30個種球進行盆栽，在連續短日照處理30d；每天3h強光照，其余時間暗處理，48天獲得開花，異株人工授粉雜交，獲得種子，無菌水浸種處理生芽，再在無菌條件下切取新芽頂端分生組織接種在MS培養基上，附加一定的植物生長調節劑組合，誘導產生新芽，獲得新植株。分別用DsMV基因組的3′末端序列及為模板制備DNA探針，對新的植株進行病毒RNA點雜交檢測，確定98％的植株確定不攜帶該病毒。以不攜帶DsMV病毒的盾葉半夏珠芽，進行消毒組培，獲得組培苗，形成新的無病毒優質種苗。
對照實施例盾葉半夏將盾葉半夏單個的幼嫩塊莖(直徑1厘米)分割成50個切片葉片，經75％的酒精浸泡0.5～1min，再用2％的次氯酸鈉水溶液消毒15min，或用0.1％氯化汞水溶液消毒10min，然后在無菌條件下用無菌水沖洗，再在無菌條件下切段(塊)接種在適宜的培養基上，基礎培養基為MS，蔗糖3％，瓊脂0.7％，PH5.8，附加一定的植物生長調節劑組合，誘導半夏愈傷組織生成和器官分化。培養溫度25±2℃，光強1500LX，光照時間10～12h/d。熱處理，莖尖培養(0.5～0.2mn)，愈傷組織誘導成苗。
雖然，在本文中對本發明原理及方法作了詳盡的說明，但可以理解，本領域技術人員在本發明基礎上可以做出改進或變化，這些內容也屬于本發明的范圍。
權利要求
1.一種植物脫病毒方法，它包括如下步驟誘導植物進行種子繁殖階段，形成種子、未成熟種子或種子胚，檢驗其是否帶毒，取無病毒種子胚進行組培擴大，然后進行快速繁殖的方法。
2.根據權利要求1的方法，其中，所述的無病毒種子胚是未成熟種子胚。
3.根據權利要求1或2的方法，其中，所述的植物選自蘭科、天南星科、旋花科和姜科。
4.根據權利要求3的方法，其中，所述的植物選自蘭科和天南星科。
5.根據權利要求4之的方法，其中，所述的植物材料選自鐵皮石斛、金線蓮、天麻、半夏、魔芋和芋頭。
6.根據權利要求1-5之任一的方法，其中，所述的病毒選自RNA病毒、類病毒、DNA病毒和植物菌原體。
7.根據權利要求5的方法，其中，所述的病毒為RNA病毒。
全文摘要
本發明涉及一種無性繁殖植物脫病毒快速繁殖的方法，具體地說，涉及一種誘導植物進行進入種子繁殖階段，形成種子、未成熟種子或種子胚，檢驗其是否帶毒，取無病毒種子胚進行組培擴大，然后進行快速繁殖的方法。
文檔編號A01H4/00GK1473464SQ02125978
公開日2004年2月11日 申請日期2002年8月7日 優先權日2002年8月7日
發明者陳集雙, 陳潔云, 杜志游, 柴立紅, 劉文洪, 施利新, 谷慶琪 申請人:浙江大學, 北京金長河科技發展有限公司