專利名稱：竹林生物肥的制作方法
技術領域：
本發明涉及含有微生物的肥料，特別是竹林生物肥料。
背景技術：
化學肥料使用方便，肥效快，能提供作物生長的必需元素，對解決人類溫飽問題起了關鍵作用。但是，化學肥料也有許多弊端，如生產時消耗大量能源，生產成本高；生產和使用中會對水和大氣產生污染，流失率高，植物利用率低；過量施用氮素化肥后植物體內積累的亞硝酸鹽對人體健康有害；由于化學肥料元素單一，互相搭配時難以合理配比，使農產品營養價值和風味降低；施用化學肥料，相應地減少有機肥使用隨之帶來土壤中有機質含量降低，使土壤板結、地力下降。因此，人們一直試圖尋找其它肥源。
自從Dbereiner(1976)報道了含脂剛螺菌與玉米根系具有聯合固氮作用以來，引起了國際上的普遍重視，世界各國對許多禾本科農作物及牧草進行固氮能力測定及固氮菌分離，證實禾本科植物普遍具有聯合固氮作用，為利用生物固氮解決禾本科作物的氮素供應找到了希望。目前國際上正從菌株篩選、菌劑應用、菌株的基因工程改良以及植物根系的微生物生態學等諸多領域對此進行研究，研制了許多適合禾本科農作物的聯合固氮菌肥。
目前的研究認為，聯合固氮是介于自生固氮和共生固氮之間的一種固氮形式，聯合固氮和自生固氮之間并無明確界限；聯合固氮菌是一類定殖于植物根際、與植物間有較密切關系，在植物根上不形成特異化結構的固氮菌；在植物根際根系分泌的大量有機碳源物質，為聯合固氮菌的生長、繁殖和固氮提供了碳源和能源，且聯合固氮菌固定的氮素又很容易被植物利用，聯合固氮菌和植物之間呈互惠互利關系；據研究聯合固氮菌具有一定的宿主專一性和同源性，在和其宿主植物聯合時固氮效率非常高，且宿主對其固定氮的利用率也非常高，而聯合固氮菌在自生條件下雖然也能固氮，但固氮效率隨環境條件變化很大，如在人工培養基上合適的溫濕條件下，聯合固氮菌的固氮效率也非常高，但在自然土壤中聯合固氮菌的固氮效率一般來說就比較低。
竹類植物屬禾本科，是我國熱帶、亞熱帶地區的重要森林植物，也是世界許多國家尤其是東南亞各國重要的森林資源。由于其特殊的生長優勢和重要的經濟價值，故越來越受到世界各國的重視，但對其生物固氮研究卻未見報道。1994年本發明人在國際上首次提出竹類植物作為禾本科植物的一大成員應該具有聯合固氮特性的觀點。經過多年研究，不僅證實竹類植物和其它禾本科農作物一樣確實具有聯合固氮作用，并從多種竹類植物根際分離到大量聯合固氮菌，對這些聯合固氮菌進行進一步研究后，篩選到幾株固氮活性較高具有研究利用價值的菌株，用它們對毛竹實生苗、麻竹組培苗及多種筍用竹林進行接種和施用后，證明具明顯提高竹子根系及竹林土壤固氮強度，增加竹子葉片含氮量，促進竹子生長尤其是根系生長，提高筍產量和苗木成活率等作用，并且混合菌種的接種效果優于單一菌種。
目前在我國已基本解決溫飽問題后，環境和食品安全問題已得到廣泛重視，順應國際發展潮流，我國對無公害食品、綠色食品、有機食品的需求越來越高。目前各地發展的無公害竹筍、綠色竹筍及有機竹筍，急需高效生物肥、有機肥和生物有機復合肥等，以部分或完全取代化肥，同時在大面積材用竹林中施用生物肥或有機肥替代化肥，也可以減少水源和環境污染。因此，研制以竹子根際聯合固氮菌作為主要固氮菌種，并配合其它措施生產的竹林生物肥，具有重要意義。竹林生物肥不僅包含了自竹類植物根際分離篩選的聯合固氮菌，而且可以和其它種類的微生物和/或各種有機質(肥)和/或無機肥和/或其它成分復合或混配，形成一類可以滿足不同竹類植物、不同生產目的、不同質量要求的竹林生物肥。
在禾本科農作物上聯合固氮菌肥的應用一般是通過種子包衣或菌劑拌種等方式，使種子和固氮菌密切接觸，種子發芽生根時聯合固氮菌首先占據根系有利位置，在根際形成優勢。由于竹子為多年生植物，而且竹子很少用種子播種，再加上竹類植物根系地下結構的復雜性，給竹子聯合固氮菌肥的施用帶來困難，聯合固氮菌很難直接施入根表和土著菌爭奪有利位置形成優勢菌群，當進入土壤后，接觸到根系的固氮菌才有可能和土著菌競爭并進行聯合固氮，而接觸不到根系的聯合固氮菌如果缺少碳源物質及其它養分的供應時將處于休眠狀態或很快死亡。根據這種情況本發明人提出，竹林施用聯合固氮菌肥時，首先要設法保證聯合固氮菌在土壤中自生條件下的充分存活和旺盛繁殖，在此基礎上才能使固氮菌有可能慢慢地向整個根系滲透并最終占據根際優勢位置進行聯合固氮。因此竹林聯合固氮菌施肥時最好同時配合有機碳源物質及磷鉀元素和多種植物和微生物必須的中微量元素，其中有機碳源物質是關鍵因素，所謂的有機碳源物質包括富含纖維素、半纖維素及各種糖類的有機質或有機肥，這些物質在土壤中經纖維素分解菌分解后可為固氮菌提供豐富的葡萄糖等低分子碳源，因為有充足的有機碳源和礦質元素的供應，且有機質施入土壤后使土壤的保水性增強，使聯合固氮菌進入土壤后可先適應環境在自生條件下生長繁殖并固氮，最終將慢慢地在竹子根際形成優勢菌群和土著菌進行競爭爭奪根際位置進行聯合固氮。這種竹林生物肥不僅具有聯合固氮作用，而且首先也具有自生固氮作用。同時竹林生物肥中也可以配合解磷菌、解鉀菌等各種土壤有益微生物，提高植物和固氮菌對磷鉀元素及有機碳源物質的利用率，因此，在聯合固氮菌的基礎上也可復合磷細菌和鉀細菌。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是減少或替代竹類植物氮素化肥的使用，提高竹筍品質，適應無公害綠色竹筍和有機竹筍生產時對生物肥料的需求，避免筍用竹林和材用竹林泛用化肥對環境的污染而提供一種竹林生物肥，這種生物肥可以通過生物固氮為竹子提供氮素，當配合其它成分如磷細菌、鉀細菌及有機肥和無機肥時也兼有提高肥料和土壤中磷鉀利用率，進一步改良土壤、改善微生物的微生態環境等作用。
本發明竹林生物肥采用的技術方案其特殊之處是由基質和竹類植物根際聯合固氮菌構成，所述的竹類植物根際聯合固氮菌是從竹類植物根際分離的能固定大氣中分子態氮的竹類植物根際聯合固氮菌，該聯合固氮菌是多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa mace)WG-1菌株、多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa mace)WG-2菌株、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis Chester)WG-3菌株和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae(Schroeter)Trevisan)WG-4菌株中的任意一菌株或任意兩種或兩種以上菌株的組合。
所述的從竹類植物根際分離的聯合固氮菌多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa mace)WG-1菌株、多粘芽孢桿菌(Bacilluspolymyxa mace)WG-2菌株、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformisChester)WG-3菌株和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae(Schroeter)Trevisan)WG-4菌株已于2002年3月8日在中國微生物菌種保藏管理委員會林業微生物中心保藏。該中心地址北京中國林業科學研究院內，保藏編號多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxamace)WG-1菌株為CFCC 1252，多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxamace)WG-2菌株為CFCC 1253，地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformisChester)WG-3菌株為CFCC 1251，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae(Schroeter)Trevisan)WG-4菌株為CFCC 1254。
本發明的竹林生物肥，還可以包含磷細菌巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium，菌種保藏號為ACCC 10010)和鉀細菌膠凍樣芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus，菌種保藏號為ACCC10013)。
所述的基質為所述菌種生存的液體介質、吸附劑、有機物料、無機物料之一種或數種；
所述的生物肥為a)液體生物肥，b)固體菌劑，c)生物有機肥和d)生物有機無機肥之任何一種，其中a)液體生物肥是所述的菌種經液體發酵培養基發酵后形成的液體生物肥，其中菌種生存的液體介質，包括水、細菌代謝產物和部分營養物質；b)固體菌劑是所述的液體生物肥經吸附劑吸附后形成的固體菌劑或經凍干后形成的凍干菌劑；c)生物有機肥是所述的液體生物肥或固體菌劑和所述的有機物料構成的生物有機肥；d)生物有機無機肥是所述的液體生物肥或固體菌劑和所述的有機物料、無機物料構成的生物有機無機肥；所述的吸附劑為物料草炭、泥炭、蛭石、輕質碳酸鈣、高嶺土、塘泥、膨潤土、腐植質中的一種或兩種及兩種以上物料的混合物；所述的有機物料為作物秸稈、木屑、動物糞便、城市垃圾、污泥、工農業生產中的有機廢棄物(酒糟、菇渣、糖廠的蔗渣等)等物料中的一種或一種以上物料的混合物；所述的無機物料為市場上銷售的各種含有大量元素及中微量元素的化學肥料等。
所述的從竹類植物根際分離的聯合固氮菌其分離方法為將竹根順竹兜連土挖起，帶回無菌實驗室后抖掉浮土，再用自來水沖凈泥土；挑選健壯活根剪成小于1cm的根段，用無菌水沖洗6次，然后用70％酒精浸泡5min，再用無菌水沖洗6次后用無菌濾紙吸去根段多余水分；分別稱取1g鮮根段放入裝有2ml修改的Dbereiner無氮半固體培養基的青霉素小瓶中，虛蓋瓶蓋(不密封)，于無菌培養箱中30℃培養24小時；蓋好瓶蓋(橡膠瓶蓋)，用蠟封口，注入0.7ml乙炔，繼續培養一小時后，測定乙炔還原活性；從中挑選有活性且活性較高的瓶裝樣品，用接種針挑取培養液在修改的Dbereiner無氮固體平板上劃線分離，然后挑取單菌落并多次純化；純化后的菌，再接入裝有修改的Dbereiner無氮半固體培養基的青霉素瓶中，測定乙炔還原活性(固氮活性)；對具較高乙炔還原活性的細菌進行進一步研究和鑒定。
所述的分離竹子根際聯合固氮菌的經修改的Dbereiner無氮固體和半固體培養基，其配方為稱取葡萄糖5.0g，蔗糖5.0g，蘋果酸5.0g，KH2PO40.4g，K2HPO4.3H2O 0.1g，MgSO4.7H2O 0.2g，NaCl 0.1g，CaCl2.2H2O 0.02g，FeCl3.3H2O 0.01g，Na2MoO4.2H2O0.002g，依次放入燒杯中用水溶解，再加入KOH 4g，攪拌溶化后用pH試紙測定溶液pH，用KOH稀溶液調節其pH至7.2左右，再加入酵母浸膏0.4g，攪拌，溶解，定容至1升。配置固體培養基時加入2％瓊脂，配制半固體培養基時加入0.2％瓊脂，滅菌后備用。
所述的從竹類植物根際分離的四株聯合固氮菌其基本形態和生理生化特征是WG-1菌株[多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa mace)]的基本特征為細胞呈革蘭氏陽性，桿狀，大小為0.7-0.8μm×3.0-3.5μm，具端生到亞端生橢圓形芽孢，孢囊膨大，胞內無PHB顆粒；菌落小，突起，光滑，點狀，乳酪色1-2mm；能產乙酰甲基甲醇(V-P反應陽性)；葡萄糖、木糖、阿拉伯糖產酸并產氣；具接觸酶和淀粉酶；氧化酶和卵磷脂酶陰性，但能分解酪朊；硝酸鹽能還原到亞硝酸鹽；在7％NaCl中不生長，能生長于pH5.7；抗溶菌酶；能在厭氧培養基上生長；二羥基丙酮(甘油)陽性；在無氮培養基上生長好，能固定分子態氮；定名為多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxamace)，但是Ash等(Ash Priest & Collins，Int.J.Syst.Bacteriol 44812-826)已于1994年將多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)轉入多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)。
WG-2菌株[多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa mace)]的基本特征為細胞呈革蘭氏陽性，桿狀，大小為0.7-0.8μm×3.0-3.5μm，具端生到亞端生橢圓形芽孢，孢囊膨大，胞內無PHB顆粒；菌落呈圓形，光滑，透明，低凸，薄，大小為2-3mm；能產乙酰甲基甲醇(V-P反應陽性)；葡萄糖、木糖、阿拉伯糖產酸并產氣；具接觸酶和淀粉酶；氧化酶和卵磷脂酶陰性，但能分解酪朊；硝酸鹽能還原到亞硝酸鹽；在7％NaCl中不生長，能生長于pH5.7；抗溶菌酶；能在厭氧培養基上生長；二羥基丙酮(甘油)陽性；在無氮培養基上生長好，能固定分子態氮；定名為多粘芽孢桿菌(Bacilluspolymyxa mace)，但是Ash等(Ash Priest & Collins，Int.J.Syst.Bacteriol 44812-826)已于1994年將多粘芽孢桿菌(Bacilluspolymyxa)轉入多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)。
WG-3菌株[地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis Chester)]的基本特征為細胞呈革蘭氏陽性，桿狀，大小為0.8μm×2.2-3.0μm；具中生橢圓形芽孢，孢囊稍膨大到不膨大；胞內無PHB顆粒；在7％NaCl、pH5.7和溶菌酶中均能生長；石蕊牛奶胨化，不產酸；V-P反應陽性(產乙酰甲基甲醇)；氧化酶、接觸酶和淀粉酶均陽性；不產卵磷脂酶，而能分解酪朊；能在厭氧培養基上生長；對葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和甘露醇均產酸；二羥基丙酮(甘油)陰性等特征；在無氮培養基上生長好，能固定分子態氮；定名為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis Chester)。
WG-4菌株[肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae(Schroeter)Trevisan)]的基本特征為細胞呈革蘭氏陰性，桿狀，大小為0.8-1.0μm×1.8-2.0μm；發酵葡萄糖產酸產氣；在無氮培養基上生長好，能固定分子態氮；按革蘭氏陰性桿菌編碼鑒定結果為
WG-4菌株定名為肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種(Klebsiellapneumoniae subsp.pneumoniae)。
所述的竹林生物肥中還可包含磷細菌和鉀細菌，所述的磷細菌指巨大芽孢桿菌(Bacillus megatherium)，菌種保藏號為ACCC10010；所述的鉀細菌指膠凍樣芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus)，菌種保藏號為ACCC 10013，可從中國微生物菌種管理委員會農業微生物菌種保藏中心獲得。
本發明的竹林生物肥，其制造方法主要為
a)液體生物肥——①發酵培養多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa mace)WG-1菌株，制成多粘芽孢桿菌WG-1菌株液體生物肥。
②發酵培養多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa mace)WG-2菌株，制成多粘芽孢桿菌WG-2菌株液體生物肥。
③發酵培養地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis Chester)WG-3菌株，制成多地衣芽孢桿菌WG-3菌株液體生物肥。
④發酵培養肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae(Schroeter)Trevisan)WG-4菌株，制成肺炎克雷伯氏菌WG-4菌株液體生物肥。
⑤將所述①、②、③、④四種液體生物肥中的任意兩種或兩種以上按需要的體積比混合，便成為各種混合聯合固氮菌液體生物肥。
⑥將多粘芽孢桿菌WG-1菌株、多粘芽孢桿菌WG-2菌株、地衣芽孢桿菌WG-3菌株和肺炎克雷伯氏菌WG-4菌株中的任意兩株或兩株以上菌按需要的體積比接種，混合發酵，成為各種混合聯合固氮菌液體生物肥。
⑦分別發酵培養磷細菌巨大芽孢桿菌ACCC 10010菌株和鉀細菌膠凍樣芽孢桿菌ACCC 10013菌株，制成巨大芽孢桿菌ACCC10010發酵液和膠凍樣芽孢桿菌ACCC 10013發酵液，將這兩種發酵液和上述①、②、③、④、⑤、⑥中的任意一種聯合固氮菌液體生物肥混配，成為各種含有聯合固氮菌、磷細菌、鉀細菌的混合液體生物肥。
竹類植物根際聯合固氮菌的發酵條件可使用公知的固氮菌的一般發酵條件，本發明中WG-1、WG-2、WG-3和WG-4菌株均可采用以下優化條件接種量10％，培養溫度30-35℃，pH6.8-7.2，攪拌速度200轉/分，培養時間20～30小時，通氣量0.5～1∶1立方米/1000升。
竹類植物根際聯合固氮菌的試管固體斜面培養基，可采用一般固氮菌常用培養基，本發明中的優化培養基配方為葡萄糖0.5％，蔗糖0.5％，KH2PO40.04％，K2HPO4.3H2O 0.01％，MgSO4.7H2O0.02％，NaCl 0.01％，CaCl2.2H2O 0.002％，FeCl3.3H2O 0.001％，Na2MoO4.2H2O 0.0005％，K2SO40.15％，酵母浸膏0.06％，瓊脂2％，pH6.8-7.2。
多種培養基都可用于所述的竹類植物聯合固氮菌的搖床培養和發酵生產，本發明中所述竹類植物聯合固氮菌的搖床培養和發酵罐發酵的優化培養基為葡萄糖0.5％，蔗糖0.5％，玉米粉1％，K2SO40.15％，KH2PO40.04％，K2HPO4.3H2O 0.01％，NH4(SO4)20.1％，MgSO4.7H2O 0.02％，NaCl 0.01％，CaCl2.2H2O 0.002％，FeCl3.3H2O0.001％，Na2MoO4.2H2O 0.0005％，蛋白胨0.1％，酵母浸膏0.08％。
磷細菌巨大芽孢桿菌的培養及發酵條件按公知的方法進行(陳廷偉等，《磷細菌》，農業出版社，1959年，北京)。磷細菌大量培養的發酵培養基可用公知的配方淀粉2％，豆餅粉2％，硫酸銨0.2％，磷酸二氫鉀1％，酵母粉0.1％，碳酸鈣0.01％，蛋白胨0.1％，pH7.2-7.4。其它發酵條件和竹類植物聯合固氮菌相同。
鉀細菌膠凍樣芽孢桿菌的培養及發酵條件按公知的方法進行(陳廷偉等，《磷細菌》，農業出版社，1959年，北京)。鉀細菌大量培養的發酵培養基可用公知的配方淀粉10％，蔗糖0.1％，磷酸氫二鉀0.2％，硫酸銨0.1％，硫酸鎂0.05％，三氯化鐵0.002％，碳酸鈣0.05％，酵母粉0.1％，豆餅粉5％，pH7.2-7.4。其它發酵條件和竹類植物聯合固氮菌相同。
上述菌的具體培養和發酵方法可按常規方法進行，優化的方法為采用通常的微生物提純復壯技術，分別對上述三大類菌的各菌株進行提純復壯處理，再分別將提純復壯后的菌株移接到三大類菌的新鮮固體斜面試管培養基上，在30-32℃分別培養24小時，待表面生長飽滿后進入搖床培養階段。以上述搖床培養基及上述發酵條件對各菌株在三角瓶中搖床上30-32℃培養20-30小時，細菌數達到20億/毫升時以10％的接種量接入一級種子罐，待菌數達到18-20億/毫升時，以10％的接種量接入二級種子罐，再接入三級種子罐，以上述同樣方法進行培養，對于芽孢桿菌，在培養后期可提高溫度，促使細菌生長芽孢，鏡檢菌數達18-20億/毫升，芽孢達80-100％時放罐，成為各種液體生物肥，將它們按所需比例混配便成為各種混合菌株液體生物肥。
b)固體菌劑——將所述的吸附劑粉碎、滅菌后，加入所需要的上述①、②、③、④、⑤、⑥、⑦的液體生物肥(一種或數種)拌和后，使功能菌的數量和含水量控制在肥料要求的范圍，便形成各種固體菌劑。
吸附劑的粉碎和滅菌可采用各種方法，粉碎后的物料應過80目篩，滅菌后的物料雜菌數控制在總菌數的5％以下，并無致病菌。對高濕物料可采用攪拌式高濕物料滾筒烘干機組，控制氣流溫度在600-750℃，烘干滅菌時間15-25分鐘；對普通物料可采用熱風滾筒烘干機200℃熱風烘干滅菌；滅菌后物料冷卻到室溫。
吸附劑和液體生物肥的比例無嚴格限制，可根據原料情況進行調整。但所述的固體菌劑的質量標準最好能夠優化到不含磷細菌和鉀細菌時，聯合固氮菌的有效活菌數最好≥5億個/克；含磷細菌、鉀細菌時，聯合固氮菌、磷細菌、鉀細菌三者之和的有效活菌數最好≥6億個/克，且聯合固氮菌、磷細菌、鉀細菌三者的有效活菌數最好分別≥2億個/克，含水量小于30％。
c)生物有機肥——將發酵好的前述的有機物料粉碎、滅菌后，加入所需要的一種上述a)或b)的液體生物肥或固體菌劑均勻混合，使氮、磷、鉀各種功能菌的數量及含水量控制在肥料要求的范圍，如果水分含量過高可以經低溫干燥處理，制成生物有機肥。
d)生物有機無機肥——將發酵好的前述的有機物料粉碎、滅菌后，根據需要加入少量的經粉碎的化肥，拌勻，再加入所需要的一種上述a)或b)的液體生物肥或固體菌劑，并混合均勻，使氮、磷、鉀各種功能菌的數量及含水量控制在肥料要求的范圍，如果水分含量過高可以經低溫干燥處理，制成生物有機無機肥。
所述的生物有機肥或生物有機無機肥還可以通過下述方法生產將前述的有機物料粉碎，接入所需要的一種上述a)或b)的液體生物肥或固體菌劑，采用目前公知的各種發酵方法，將聯合固氮菌或聯合固氮菌、磷細菌、鉀細菌和有機原料共同發酵，形成生物有機肥；在此生物有機肥中加入適量化肥，便形成生物有機無機肥。由于所述生產竹林生物肥的菌種基本為芽孢桿菌屬細菌，在發酵溫度高時菌種便形成芽孢進入休眠狀態，在發酵溫度適宜時菌種又開始生長繁殖并在發酵的同時固氮，提高有機肥的含氮量。
有機物料的粉碎和滅菌可采用各種方法，粉碎后的物料應過80篩，滅菌后的物料雜菌數控制在5％以下，并無致病菌。對高濕物料可采用攪拌式高濕物料滾筒烘干機組，控制氣流溫度在600-750℃，烘干滅菌時間15-25分鐘；對普通物料可采用熱風滾筒烘干機200℃熱風烘干滅菌；滅菌后物料冷卻到室溫。
有機物料和無機物料的量可根據所生產的肥料種類、種植的植物種類、作物的品質要求、施用地的土壤養分狀況等進行調整，這是本專業人員可以做到的，但是作為生物有機肥或生物有機無機肥，其有機質的含量最好大于50％，而化肥的量不宜太高，作為生產有機食品的肥料時最好不含化肥，或含量不超過6％。
有機質發酵可采用目前公知的各種發酵方法和發酵設備，在水分含量50-70％的條件下通氣發酵。
所述的生物有機肥或生物有機無機肥中的聯合固氮菌有效活菌數，在不含磷細菌或鉀細菌時一般應≥0.3億個/克；含磷細菌、鉀細菌時，聯合固氮菌、磷細菌、鉀細菌三者之和的有效活菌數最好應≥0.6億個/克，且聯合固氮菌、磷細菌、鉀細菌三者的有效活菌數最好分別應≥0.2億個/克；含水率一般在8-12％范圍內。
所述制成的生物有機肥或生物有機無機肥，還可進一步造粒，制成顆粒肥。
造粒可采用各種方法，一般用成球盤造粒機，噴加20％的水分滾動制成直徑3-5毫米顆粒，再經低溫風力干燥制成，如有機質粘結力不夠，可加入10-20％的粘土等作為粘結劑。
本發明的特點和有益效果1、竹類植物根際聯合固氮是由本發明人在國際上率先提出并開展的一項研究。
2、多年研究證明，自竹類植物根際分離的所述的聯合固氮菌株，具明顯提高竹子根系和竹林土壤固氮強度，增加竹子葉片含氮量，促進竹子生長尤其是根系生長，提高筍產量和苗木成活率等作用。用所述的竹類植物根際聯合固氮菌生產的竹林生物肥在筍用竹林施用后，次年可提高筍產量20％以上。
3、由于聯合固氮具有一定的宿主專一性和同源性，因此在竹林栽培和經營中以竹子根際分離的聯合固氮菌生產的竹林生物肥其作用是其它類型生物肥所不能替代的。
4、以竹子根際聯合固氮菌為主要菌種生產的竹林生物肥在配合了解磷菌、解鉀菌及其它土壤有益微生物和有機肥后，不僅可以減少或替代化肥使用，而且還具有改善土壤微生態環境，提高土壤保水保肥性能，全面提供竹類植物生長所需的各種養分等多種功效，對于綠色竹筍和有機竹筍的生產及環境保護具有重要意義。
5、目前市場上的生物肥料品種繁多，但是，適地適樹適作物的專用生物肥卻不多。由于生物肥料中含有活的微生物，而任何生物對自然界的適應性都是有局限的，因此用某種微生物肥料作用于所有植物、所有土壤類型、所有氣候條件是不可能的，而適地適樹適植物選擇的微生物及生產的專用生物肥對某種植物會具有更強的針對性，也更具有研究應用前景。
6、除了聯合固氮作用以外，本發明所使用的菌種還具有一些不明確的對植物的促生作用，如可分泌生長激素類物質及抗病類物質等。
具體實施例方式
實施例11、配制固氮菌試管固體斜面培養基，其配方為葡萄糖0.5％，蔗糖0.5％，KH2PO40.04％，K2HPO4.3H2O 0.01％，MgSO4.7H2O0.02％，NaCl 0.01％，CaCl2.2H2O 0.002％，FeCl3.3H2O 0.001％，Na2MoO4.2H2O 0.0005％，K2SO40.15％，酵母浸膏0.06％，瓊脂2％，pH6.8-7.2。滅菌后，分別接入所述的四株自竹類植物根際分離的聯合固氮菌WG-1、WG-2、WG-3和WG-4菌株，30～32℃培養，使其表面生長飽滿。
2、配制固氮菌的搖床培養培養基，其配方為葡萄糖0.5％，蔗糖0.5％，玉米粉1％，K2SO40.15％，KH2PO40.04％，K2HPO4.3H2O0.01％，NH4(SO4)20.1％，MgSO4.7H2O 0.02％，NaCl 0.01％，CaCl2.2H2O 0.002％，FeCl3.3H2O 0.001％，Na2MoO4.2H2O 0.0005％，蛋白胨0.1％，酵母浸膏0.08％，pH6.8-7.2。裝入1000毫升三角瓶中，滅菌后，分別接入所述的四株自竹類植物根際分離的聯合固氮菌WG-1、WG-2、WG-3和WG-4菌株，30～32℃，搖床震蕩培養，使細菌數達到20億/毫升。
3、配制固氮菌的發酵培養基于發酵罐中，優化的培養基配方同2，滅菌。
4-1分別接入所述的四株自竹類植物根際分離的聯合固氮菌(WG-1、WG-2、WG-3和WG-4菌株)于不同的發酵罐中，接種量10％，發酵溫度30-35℃，pH6.8-7.2，攪拌速度200轉/分，通氣量0.5～1∶1立方米/1000升，培養時間20～30小時，使細菌數達到20億/毫升，便分別制成四種聯合固氮菌液體生物肥或生物肥接種劑；用四株菌的液體培養物等體積混合，便成為一種混合聯合固氮菌液體生物肥。
4-2將所述的四株自竹類植物根際分離的聯合固氮菌(WG-1、WG-2、WG-3和WG-4菌株)等體積共同接入同一發酵罐中發酵，接種量10％，發酵溫度30-35℃，pH6.8-7.2，攪拌速度200轉/分，通氣量0.5～1∶1立方米/1000升，培養時間20～30小時，使細菌數達到20億/毫升，制成混合菌株液體生物肥。
5、按前述的磷細菌培養基和本實施例1、2、3、4-1中同樣的方法培養和發酵磷細菌，制成液體磷細菌生物肥。
6、按前述的鉀細菌培養基和本實施例1、2、3、4-1中同樣的方法培養和發酵鉀細菌，制成液體鉀細菌生物肥。
7、將本實施例4方法制備的混合聯合固氮菌液體生物肥和液體磷細菌生物肥及液體鉀細菌生物肥等體積混合，便制成含有聯合固氮菌、磷細菌、鉀細菌的混合液體生物肥。
實施例2實施例1中以自竹類植物根際分離的4株聯合固氮菌為例，進行竹林液體生物肥的生產。實際生產中也可以僅用四株菌中的任意一株菌或任意兩株菌或任意三株菌，以上述同樣方法進行竹林液體生物肥的生產。
實施例31、將草炭粉碎，過80目篩，用200℃熱風滾筒烘干滅菌，冷卻到室溫。
2、將以實施例1方法制成的各種液體生物肥(包括單一菌種和混合菌種)分別用草炭吸附，使其功能菌的活菌數達到要求的標準，并使含水量＜30％(如含水量過高，可以經低溫風力干燥處理)便制成各種含有單一菌株或混合菌株的固體菌劑。
實施例4將發酵好的動物糞便，如豬糞，風干后粉碎，過80目篩；將粘土風干后粉碎，過80目篩；再將兩種基質分別經200℃熱風滾筒烘干殺滅病菌和蟲卵后冷卻；將按實施例3方法生產的固體菌劑和有機肥基質以及粘土以1∶8∶1的比例混配拌勻，使各功能菌的有效活菌數達到要求的標準，加入20％的水，在成球盤上滾動制成直徑3～5mm顆粒，低溫干燥，制成生物有機肥。
實施例5將發酵好的動物糞便，如豬糞，風干后粉碎，過80目篩；再經200℃熱風滾筒烘干，殺滅病菌和蟲卵后冷卻；用錘式粉碎機分別將氯化鉀和尿素粉碎，再用鈣鎂磷肥、氯化鉀、尿素調整有機肥養分含量，使全N≥2％，全P2O5≥2％，全K2O≥2％；再將按實施例1中第7步驟制成的聯合固氮菌、磷細菌、鉀細菌混合液體生物肥，噴撒到已發酵好的干燥的動物糞便中，在成球盤上滾動制成直徑3～5mm顆粒，低溫干燥，使每克干肥料中聯合固氮菌、磷細菌、鉀細菌三者之和的有效活菌數≥0.6億個/克，且聯合固氮菌、磷細菌、鉀細菌三者的有效活菌數分別≥0.2億個/克，制成生物有機無機肥。
實施例6將植物秸稈粉碎，1∶1和豬糞混配，再將按實施例1或實施例2兩種方法生產的各種液體生物肥的一種，按重量10％接入到其中，使含水量為60％，在固體發酵裝置中通氣攪拌發酵7天，使每克肥料中的功能菌活菌數達到要求的標準，制成生物有機肥。
實施例7將植物秸稈粉碎，1∶1和豬糞混配，再將按實施例1或實施例2兩種方法生產的各種液體生物肥的一種，按重量10％接入到其中，使含水量為60％，在固體發酵裝置中通氣攪拌發酵7天，出罐后用鈣鎂磷肥、氯化鉀、尿素調整養分含量，使全N≥2％，全P2O5≥3％，全K2O≥3％，并使每克肥料中的功能菌活菌數達到要求的標準，制成生物有機無機肥。
權利要求
1.竹林生物肥，其特征是由基質和竹類植物根際聯合固氮菌構成，所述的竹類植物根際聯合固氮菌是從竹類植物根際分離的能固定大氣中分子態氮的竹類植物根際聯合固氮菌，該聯合固氮菌是多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa mace)WG-1菌株、多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa mace)WG-2菌株、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis Chester)WG-3菌株和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae(Schroeter)Trevisan)WG-4菌株中的任意一菌株或任意兩種或兩種以上菌株的組合。
2.如權利要求1所述的竹林生物肥，其特征是該肥料還包含磷細菌巨大芽孢桿菌(Bacillus megatherium，菌種保藏號為ACCC10010)和鉀細菌膠凍樣芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus，菌種保藏號為ACCC 10013)。
3.如權利要求1或2所述的竹林生物肥，其特征是所述的基質為所述菌種生存的液體介質、吸附劑、有機物料、無機物料之一種或數種；所述的生物肥為a)液體生物肥，b)固體菌劑，c)生物有機肥和d)生物有機無機肥之任何一種；所述的液體生物肥是所述的菌種經液體發酵培養基發酵后形成的液體生物肥；所述的固體菌劑是所述的液體生物肥經吸附劑吸附后形成的固體菌劑或經凍干后形成的凍干菌劑；所述的生物有機肥是所述的液體生物肥或固體菌劑和所述的有機物料構成的生物有機肥；所述的生物有機無機肥是所述的液體生物肥或固體菌劑和所述的有機物料、無機物料構成的生物有機無機肥；所述的吸附劑為物料草炭、泥炭、蛭石、輕質碳酸鈣、高嶺土、塘泥、膨潤土、腐植質中的一種或兩種及兩種以上物料的混合物；所述的有機物料為作物秸稈、木屑、動物糞便、城市垃圾、污泥、工農業生產中的有機廢棄物中的一種物料或兩種及兩種以上物料的混合物；所述的無機物料為化學肥料。
全文摘要
可供無公害綠色竹筍和有機竹筍生產中對生物有機肥的需求，以減少或替代化肥使用的一種竹林生物肥，是由基質和竹類植物根際聯合固氮菌構成，所述的竹類植物根際聯合固氮菌是從竹類植物根際分離的能固定大氣中分子態氮的竹類植物根際聯合固氮菌，該聯合固氮菌是多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa mace)WG－1菌株、多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa mace)WG－2菌株、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis Chester)WG－3菌株和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae(Schroeter)Trevisan)WG－4菌株中的任意一菌株或任意兩種或兩種以上菌株的組合。本發明的肥料可用于竹林培育。
文檔編號C05G1/00GK1443729SQ02111038
公開日2003年9月24日 申請日期2002年3月12日 優先權日2002年3月12日
發明者吳曉麗, 顧小平 申請人:吳曉麗, 顧小平