新的細菌植酸酶及其生產方法

專利名稱：新的細菌植酸酶及其生產方法
技術領域：
本發明涉及細菌來源的新植酸酶，以及有關的生產方法。本發明更具體地涉及衍生自酸孢菌(Acidocella)屬細菌的新植酸酶，以及編碼這些植酸酶的多核苷酸。本發明還涉及含有這些多核苷酸的載體，以及在其組織內表達所述植酸酶的轉化的宿主生物。本發明還涉及包含至少一種植酸酶活性的新細菌提取物。
具體而言，本發明的細菌提取物和植酸酶特別適合用于動物營養物的飼料組合物。該適合性與它們的特性有關，具體的是，在與制備所述組合物的條件以及在動物的消化系統中遇到的條件相對應的溫度和pH條件下它們的活性。
磷是所有生物的生存所必需的元素。具體地說，對于家畜的飼養者確保他們的動物攝取足夠量的磷以使它們得到最佳生長和發育是至關重要的。大多數家畜飼喂以植物為基礎的飼料組合物。這些植物含有大量的磷酸鹽，它們將這些磷酸鹽以儲藏化合物—植酸的形式貯存在它們的組織中。按平均值，植酸含有50-70％存在于植物中的磷酸鹽。植酸自然流動，其所含有的磷酸鹽在大多數家畜中釋放，特別是反芻動物。然而，植酸不能被單胃的動物所代謝，例如豬和家禽。因此，在這些動物中，包含在其攝入食物中的植酸隨糞便排除，飼養者不得不用無機磷酸鹽補充所述的攝入量，以使動物攝取足夠量的磷酸鹽。這一策略造成飼養者額外的花費并產生來自排放到環境中的非-同化植酸的污染。在密集的飼養區域更增加了這種污染。
還已知植酸是包含于攝取的食物中的重要營養元素的螯合劑，例如，鎂、鈣、鋅或鐵。這一特性導致食物攝取的營養質量下降，給予植酸抗營養劑的特性。
為了對與單胃的動物缺乏植酸的同化作用有關的各種缺點作出反應，設想將一種酶——植酸酶引入這些家畜攝取的食物中。植酸酶水解植酸，釋放肌醇和無機磷酸鹽。植酸酶，和編碼這些植酸酶的基因已從很多生物中分離得到。植酸酶主要是從真菌中分離得到(Howson和Davis，1983，Enzyme Microb.Technol.5，377-382；Wyss等，1999，Appl.Environ.Microbiol.，65(2)，359-366)。在產生植酸酶的真菌中，將涉及曲霉屬(Aspergillus)，具體是無花果曲霉(A.ficuum)(Ullah和Gibson，1987，Preparative Biochemistry17(1)，63-91；Ullah和Dischinger，1993，Biochem.Biophys.Res.Commun.，192(2)，747-753)，土曲霉(A.terreus)(Mitchell等，1997，Microbiology，143(部分1)，245-252)，黑曲霉(A.niger)(Dvorakova等，1997，FoliaMicrobiol(Praha)，42(4)，349-352)，煙熏曲霉(A.fumigatus)(Pasamontes等，1997，Appl.Environ.Microbiol，63(5)，1696-1700)，在青霉屬Penicillium中，具體是乳酶青霉(P.caseicolum)，在菌絲霉屬(Myceliophthora)中，具體是嗜熱菌絲霉(M.thermophila)(Mitchell等，1997，Microbiology，143(部分1)，245-252)，在藍霉屬(Talaromyces)中，具體是嗜熱藍霉(T.thermophilus)，在脈孢菌屬(Neurospora)中，具體是粗糙脈孢菌(N.crassa)和好食脈孢菌(N.sitophila)，在茶毒菌屬(Thermomyces)中，具體是絨狀荷毒菌(T.lanuginosus)(Berka等，1998，Appl.Environ.Microbiol.，64(11)，4423-4427)，或者在紅曲霉屬(Monascus)中，具體是安卡細曲霉(M.anka)。還在細菌中發現植酸酶。通過實施例，將涉及芽胞桿菌屬(Bacillus)的細菌，具體是枯草桿菌(B.subtilis)(Powar和Jagannathan，1982，J.Bacteriol.151(3)，102-1108；Shimizu，1992，Biosci.Biotech.Biochem.56(8)，1266-1269；Keruvo等，1998，Appl.Environ.Microbiol.，64(6)，2079-2085)，假單胞菌屬(Pseudomonas)(Cosgrove，1970，Austral.J.Biol.Sci.23，1207-1220)，埃希氏菌屬(Escherichia)，具體是大腸桿菌(Golovan等，2000，Can.J.Microbiol.46，59-71)，腸桿菌屬(Enterobacter)(Yoon等，1996，Enzyme and Microbiol.Technol.；18，449-454)，或鏈霉菌屬(Streptomyces)。還分離了酵母植酸酶(Dvorakova，1998，Folia Microbiol.43(4)，323-338)，例如許旺酵母(Schwaniiomyces occidentalis)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。最后，在植物中發現植酸酶，具體是在大豆中(Ullah和Gibson，1988，Arch.Biochem.Biophys，260(2)，514-20)，在玉米中(Maugenest等，1997，Biochem J.，322(部分2)，511-7)；Maugenest等，1999，Plant Mol.Biol.，39(3)，503-14)，或在擬南芥菜屬(Arabidopsis)(Mullaney和Ullah，1998，Biochem.Biophys.Res.Commun.，251(1)，252-5)。
可以表征植酸酶的特性包括植酸的米氏常數(Km)，活性的最適pH和最適溫度，以及在給定的pH和溫度下該活性的穩定性。也可使用有關植酸酶結構的數據，例如分子量(MW)，等電點(pI)或肽序列。由于可以將它們用于動物營養物中，植酸酶必須具有與用于這種營養物的飼料成分進行的加工不矛盾的特性。具體的是，必須保持使用的植酸酶的活性，如果可能，在制備這些飼料的過程溫度和pH的條件下植酸酶的活性必須是最佳的，并且存在于動物消化道中的植酸酶吸收這些飼料的營養成分。這些限制引導人們主要去尋找具有活性的植酸酶，該活性耐受高溫條件，例如在制備飼料組合物的過程中使用的溫度條件，并且它還耐受酸性pH條件，例如家畜消化道中存在的pH條件。
為了滿足這些標準，人們在生物中尋找植酸酶，具體的是微生物，它們在符合這些標準的溫度和pH條件的環境中發育。該策略使之可以分離耐受高溫的植酸酶，例如，描述于專利申請WO 97/35016或EP 0 684 313中的那些植酸酶，以及具有低Km的植酸酶，例如，描述于專利申請EP 0 960 934的那些植酸酶。為了賦予其優越的特性，另一個策略是通過定點誘變人工改變已知植酸酶的序列。這一策略具體描述于專利申請WO 99/48380，EP0 897 985和EP 0897 010。
只鑒別了幾種在低的最適pH下具有活性的植酸酶。這種植酸酶具體鑒別于真菌中，例如描述于專利申請JP 7067635的乳酪青霉的植酸酶和描述于專利申請WO 98/13480的安卡紅曲霉的植酸酶，以及在酵母中，例如描述于專利申請EP 699 762的許旺酵母(Schwaniiomyces occidentalis)的植酸酶。然而，到目前為止，沒有分離和鑒別導致具有低的最適pH的植酸酶，具體是最適pH小于4。
附圖的描述


圖1解氨酸孢菌(Acidocella aminolytica)ATCC 51361的植酸酶的活性作為溫度的函數。相對活性的值100％對應于給定溫度下植酸酶的最適活性。
圖2解氨酸孢菌ATCC 51361的植酸酶的活性作為pH的函數。相對活性的值100％對應于給定pH的植酸酶的最適活性。
圖3速生酸孢菌(Acidocella facilis)ATCC 35904的植酸酶的活性作為溫度的函數。相對活性的值100％對應于給定溫度下植酸酶的最適活性。
圖4速生酸孢菌ATCC 35904的植酸酶的活性作為pH的函數。相對活性的值100％對應于給定pH的植酸酶的最適活性。
圖5包含于在實施例5.5中純化的并由OFR281編碼的片段中的植酸酶的活性作為溫度的函數。相對活性的值100％對應于給定溫度下植酸酶的最適活性。
圖6包含于在實施例5.5中純化的并由OFR281編碼的片段中的植酸酶的活性作為pH的函數。相對活性的值100％對應于給定pH的植酸酶的最適活性。
詳細描述本發明涉及分離編碼由序列標識SEQ ID NO2描述的植酸酶的多核苷酸。該植酸酶和編碼它的多核苷酸也顯示出它們起源于酸孢菌屬細菌菌株的特征。
根據本發明，術語“多核苷酸”是指由天然或人工序列基礎組成的核酸分子，它可以是DNA或RNA型的，較佳是DNA型，具體是雙鏈的。當所述的多核苷酸是天然的，可清楚地理解本發明不包括其自然環境中的這種多核苷酸，而包括從天然發現這種多核苷酸的活生物的基因組中分離和純化的相同的多核苷酸。該核苷酸可通過提取或純化直接獲得，或通過拷貝間接獲得。然而，當多核苷酸人工整合入活生物的基因組而不是其天然存在的基因組時，或者當它作為生物的基因組中的一個或多個拷貝再人工引入其起源的活生物時，本發明包括所述的多核苷酸。當該多核苷酸是探針時，它通常是單鏈的。
因此，本發明包括編碼由序列標識SEQ ID NO2描述的植酸酶的肽序列的多核苷酸。本領域熟練的技術人員熟知該定義包括編碼同一氨基酸序列，因此編碼同一植酸酶的、由序列標識SEQ ID NO2表示的所有多核苷酸，盡管包含由于遺傳密碼的簡并而造成不同的核苷酸序列。
本發明還包括與上述多核苷酸同源的多核苷酸，所述同源多核苷酸編碼與由序列標識SEQ ID NO2表示的植酸酶同源的植酸酶。根據本發明，術語“同源”是指編碼植酸酶的多核苷酸，該多核苷酸的序列相對于由序列標識SEQ IDNO2表示的編碼植酸酶的多核苷酸發生了改變。同源的多核苷酸通過與編碼由序列標識SEQ ID NO2表示的植酸酶的多核苷酸的同一性程度進行表征。通過比較它們的序列得到兩個同源多核苷酸之間的同一性程度，通常用這些序列之間相同核苷酸的百分比表達。通過給定的序列長度測定同一性程度，通過比較較短的序列確定序列的長度測定同源序列的同一性程度。因此，本發明包括相對于編碼由序列標識SEQ ID NO2表示的植酸酶的多核苷酸具有一個或多個序列改變的多核苷酸，并且編碼植酸酶，該植酸酶的特性與由序列標識SEQID NO2表示的植酸酶的特性相同。
根據本發明，表達“相同的植酸酶”或“具有相同特性的植酸酶”主要是指具有植酸酶活性的蛋白質，與它們的內在特性無關，如Km、對于活性最適的pH或對于活性最適的溫度。植酸酶活性水平可以通過表征植酸酶活性的任何方法測定。術語“植酸酶”是指一種酶，該酶的催化活性在于水解植酸以釋放肌醇和無機磷酸鹽。然而，既然大多數的植酸酶不能完全水解植酸(含有6個磷酸鹽)，根據本發明植酸酶的催化活性可導致無機磷酸鹽和肌醇磷酸鹽酯的釋放，根據植酸酶的水解能力，所述的酯可以是肌醇單-、二-、三-、四-或五-磷酸鹽酯。通過實施例，可根據Shimizu(1992，Biosci.Biotech.Biochem.56(8)，1266-1269)的方法測定植酸酶的活性，具體如實施例2所描述。然而，表征植酸酶活性的任何方法，或者是通過測定底物量的減少或者是通過測定來自酶促反應的產物的積累，可用于測定植酸酶的活性。具體的是，相似的方法，例如使用另一種底物或其它試劑可測定所述植酸酶的活性。
在同源多核苷酸中存在的序列改變可以是核苷酸的增加、缺失或取代，該核苷酸可以是天然的或通過常規的誘變技術獲得的。已知編碼具有相同功能的蛋白質的這種同源多核苷酸天然存在于不同的活種的基因組中，甚至存在于不同品種、變種或菌株的基因組中。因此，對于本領域熟練的技術人員，使用講授的編碼由根據本發明的序列標識SEQ ID NO2表示的肽序列的多核苷酸，使用熟知的分子雜交技術來分離這種同源多核苷酸是容易的(Sambrook等，1989，分子克隆實驗室手冊，第二版，Nolan C.編，紐約Cold Spring HarborLaboratory Press)。
分子雜交是一種成對反應，該反應發生于在其核苷酸序列間具有一定程度的同一性的多核苷酸互補鏈之間。因此，雜交使之可以使用編碼由序列標識SEQID NO2表示的植酸酶的多核苷酸來鑒定與這些多核苷酸同源的多核苷酸，在活生物基因組中而不是其所衍生的生物的基因組中，例如其它細菌，具體的是Acidocella的其它菌株，并編碼與由序列標識SEQ ID NO2表示的植酸酶具有相同特性的植酸酶。多核苷酸間的序列同一性越大，在所述的多核苷酸間的雜交可能性越大也越容易，這些多核苷酸編碼具有相同特性的蛋白質的概率越大。雜交多核苷酸的方法廣泛描述于文獻中(Sambrook等，1989，分子克隆實驗室手冊，第二版，Nolan C.編，紐約Cold Spring Harbor LaboratoryPress)，并為本領域熟練的技術人員所熟知。例如，它們是基于篩選從活生物或從該生物的組織建立的基因組或cDNA文庫。使用由已知多核苷酸或其片段組成的探針進行篩選，以在這些文庫中鑒定與所述探針同源的多核苷酸，該探針將與所述多核苷酸雜交。根據本發明，探針由編碼由序列標識SEQ ID NO2表示的植酸酶的多核苷酸或其片段組成。為了鑒別與探針雜交的多核苷酸，標記所述探針，例如，用放射性元素，如32P。也可使用本領域熟練的技術人員所熟知的市售可得的非放射性標記。
因此，本發明還包括能夠選擇性地與一種編碼由序列標識SEQ ID NO2表示的植酸酶的多核苷酸或其片段雜交的多核苷酸。應理解，如果這些多核苷酸編碼與由序列標識SEQ ID NO2表示的植酸酶等價的植酸酶，那么它們僅僅是本發明的一部分。根據本發明，因此表達“能夠選擇性雜交的多核苷酸”是指通過一種常規的分子雜交方法(Sambrook等，1989，分子克隆實驗室手冊，第二版，Nolan C.編，紐約Cold Spring Harbor Laboratory Press)，在大于所述探針與其它相對非同源的多核苷酸非特異性雜交的水平上，與編碼由序列標識SEQ ID NO2表示的植酸酶的一種多核苷酸或其片段組成的標記探針雜交，具體地說是其它cDNA，如果標記的多核苷酸是從cDNA文庫得來的。雜交水平根據探針標記產生的信號測定。能夠選擇性雜交的多核苷酸和探針間的相互反應產生的信號水平通常比由探針與其它產生“背景噪聲”的多核苷酸間的相互反應產生的信號水平強10倍，較佳是100倍。通常使用正常的，較佳是嚴格的或非常嚴格的雜交和洗滌條件獲得選擇性雜交(例如使用含有至少5×SSC和1％SDS的緩沖液，在約50℃-60℃下雜交，用0.1％的SDS連續洗滌并SSC的濃度逐漸從2×SSC下降至0.4×SSC而溫度從20℃增加到50℃)。本領域熟練的技術人員將可調節雜交條件，例如，必要地調節用于雜交步驟和洗滌步驟的溫度和緩沖液的鹽濃度。這些條件應具體地以使用探針的長度和存在于用這種探針篩選的文庫中的多核苷酸的同一性程度的的函數進行調整。為了優化由雜交的同源序列產生的信號，同時使背景噪聲最小化，調整雜交條件是必需的。
能夠與根據本發明多核苷酸選擇性雜交的多核苷酸可以從基因組文庫或產生的cDNA文庫分離，例如從細菌菌株，具體的從酸孢菌屬的菌株。可使用標準雜交技術分離這種多核苷酸(Sambrook等，1989，分子克隆實驗室手冊，第二版，Nolan C.編，紐約Cold Spring Harbor Laboratory Press)，使用編碼由序列標識SEQ ID NO2表示的植酸酶的多核苷酸及這些多核苷酸的片段，或與之互補的多核苷酸作為探針。當通過這些技術分離得到一個多核苷酸時，必須確定其序列并鑒定由該多核苷酸編碼的蛋白質的特性，具體的是檢驗該蛋白質是一種與由序列標識SEQ ID NO2表示的植酸酶相等的植酸酶。
因此，上述雜交技術可以分離與編碼由序列標識SEQ ID NO2描述的植酸酶的多核苷酸同源的多核苷酸。這種多核苷酸以及它們編碼的植酸酶可被在生物技術領域中掌握標準分子生物學技術的熟練的技術人員容易地鑒別。因此，本發明包含與編碼由序列標識SEQ ID No.2描述的植酸酶的多核苷酸同源的多核苷酸。優選地，同源多核苷酸的同一性程度相對于編碼由序列標識SEQ IDNO2表示的植酸酶的多核苷酸至少為50％，較佳是至少為70％，80％，更佳是至少90％，和更佳是至少95％。測定和鑒別序列間同一性程度的方法是本領域熟練的技術人員所熟知的。例如，可使用PILEUP、BLAST程序(具體是Altschul等，1993，J.Mol.Evol.36290-300；Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215403-10)，或BestFit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Unix第8版，Genetics Computer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711，使用Applied Mathematics中描述的Smith和Waterman算法，1981，第2期，482-489)。
這種同源的多核苷酸也可通過常規誘變技術人工獲得。
一種較佳地編碼由序列標識SEQ ID NO2表示的植酸酶的多核苷酸是用序列標識SEQ ID NO1表示的。
根據本發明具體的實施例，上述編碼植酸酶的多核苷酸來源于酸孢菌屬的細菌。
優選地，根據本發明多核苷酸編碼植酸酶的最適pH活性為小于或等于4。表達“活性的最適pH”是指根據本發明在該pH值下植酸酶的活性最大，使用上述方法測定該活性，相當于植酸降解和無機磷酸產生的量。
根據本發明具體的實施例，根據本發明編碼植酸酶的多核苷酸具有如下特征(a)最適溫度＝65℃(b)最適pH＝3.5根據本發明另一個具體的實施例，根據本發明編碼植酸酶的多核苷酸具有如下特征(a)最適溫度＝70℃(b)最適pH＝4根據本發明另一個具體的實施例，根據本發明編碼植酸酶的多核苷酸具有如下特征(a)最適溫度＝60℃(b)最適pH＝3.5較佳地，根據本發明編碼植酸酶的多核苷酸來自解氨酸孢菌的細胞菌株，具體的是菌株解氨酸孢菌ATCC 51361，或來自速生酸孢菌的細菌菌株，具體的是菌株速生酸孢菌ATCC 35904。
本發明還涉及上述多核苷酸的片段。術語“片段”具體是指至少20個核苷酸的片段，具體的是至少50個核苷酸，較佳是至少100個核苷酸。這種片段通常被稱作寡核苷酸。它們可用做雜交探針來鑒別同源多核苷酸，或作為引物通過PCR(聚合酶鏈反應)技術來鑒定和擴增這種同源多核苷酸，該PCR技術描述于Ausubel等，(1987)《新編分子生物學實驗指南》(Current Protocolsin Molecular Biology)，John Wiley和Sons，6.3-6.4節)。
術語“片段”也指根據本發明編碼由序列標識SEQ ID NO2表示的植酸酶片段、或與由序列標識SEQ ID NO2表示的植酸酶同源或相等的植酸酶的片段的多核苷酸的片段。
本發明還涉及含有至少一個上述多核苷酸的多核苷酸。
上述所有的多核苷酸或者編碼由序列標識SEQ ID NO2表示的植酸酶，或者是同源的植酸酶，或者這些植酸酶的活性片段。因此，本發明擴展為由所有這些多核苷酸編碼的全部植酸酶。該定義包括由序列標識SEQ ID NO2表示的植酸酶，與該植酸酶同源的植酸酶以及這些植酸酶的活性片段。
根據本發明較佳地實施例，植酸酶是一種至少包含由序列標識SEQ ID NO2表示的肽序列的蛋白質。較佳地，由序列標識SEQ ID NO2描述的肽序列表示的植酸酶水解存在于植酸酶分子上的6個磷酸鹽中的5個。
因此本發明還包括與由序列標識SEQ ID NO2表示的植酸酶同源的植酸酶。根據本發明，術語“同源植酸酶”是指相對于由序列標識SEQ ID NO2表示的植酸酶，其序列發生改變的植酸酶。與同源多核苷酸相似，同源植酸酶是其肽序列顯示一定程度同一性的植酸酶，其同一性程度通常用相同氨基酸的百分比表達。因此本發明包括相對于由序列標識SEQ ID NO2表示的植酸酶具有一個或多個序列修飾的植酸酶，并且其特性與由序列標識SEQ ID NO2描述的植酸酶的特性相同。這些修飾可以是天然地或通過常規的誘變技術得到的氨基酸的增加、缺失或取代。優選地，同源植酸酶的同一性程度相對于由序列標識SEQ ID NO2表示的植酸酶至少為60％，較佳是至少70％，至少80％，更佳是至少90％，和更佳是至少95％。測定和鑒別序列間同一性程度的方法是本領域熟練的技術人員所熟知的。例如，可使用PILEUP、BLAST程序(具體是Altschul等，1993，J.Mol.Evol.36290-300；Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215403-10)，或BestFit程序(Wisconsin Sequence AnalysisPackage，Unix第8版，Genetics Computer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711，使用應用數學(Applied Mathematics)中描述的Smith和Waterman算法，1981，第2期，482-489)。
根據本發明具體的實施例，本發明植酸酶來源于酸孢菌屬的細菌。
優選地，根據本發明植酸酶具有適合其活性的小于或等于4的最適pH。表達“適合其活性的最適pH”是指根據本發明在該pH值時植酸酶的活性最大，該活性可使用上述方法進行測定并對應于植酸降解和產生無機磷酸鹽的量。
根據本發明具體的實施例，植酸酶具有如下特性(a)最適溫度＝65℃(b)最適pH＝3.5根據本發明另一個具體的實施例，植酸酶具有如下特性(a)最適溫度＝70℃(b)最適pH＝4根據本發明另一個具體的實施例，植酸酶具有如下特性(a)最適溫度＝60℃(b)最適pH＝3.5根據本發明另一個具體的實施例，本發明的植酸酶來源于解氨酸孢菌細菌的菌株，具體的是菌株解氨酸孢菌ATCC 51361，或者來源于速生酸孢菌的菌株，具體的是菌株速生酸孢菌ATCC 35904。
本發明還擴展到由序列標識SEQ ID NO2表示的植酸酶的片段以及同源植酸酶的片段。術語“片段”主要是指生物活性片段，即具有與完整的植酸酶的活性相同的植酸酶活性的片段，如實施例2中描述的通過分析，或類似的分析測定。
本發明還涉及嵌合基因，該嵌合基因包括功能性地相互連接，在宿主生物中發揮功能的至少一個啟動子，編碼根據本發明的植酸酶的多核苷酸，以及在同一宿主生物中發揮功能的終止子元件。一個嵌合基因可含有的各種元件是，首先，調節轉錄、翻譯和蛋白質成熟的元件，例如啟動子，編碼信號肽或轉運肽的序列，或組成聚腺苷酸化信號的終止子元件，其次，編碼蛋白質的多核苷酸。表達“功能性地相互連接”指所述嵌合基因的元件以這樣的方式相互連接，即這些元件中某一元件的功能受到另一個元件的功能影響。通過實施例，當啟動子能夠影響所述編碼序列的表達時它與編碼序列功能性地連接。根據本發明嵌合基因的構建及其各種元件裝配可使用本領域熟練的技術人員熟知的技術進行，具體地描述于Sambrook等，(1989，分子克隆實驗室手冊，Nolan C.編，紐約Cold Spring Harbor Laboratory Press)。組成嵌合基因的調節元件的選擇主要取決于它們必須發揮功能的宿主生物，本領域熟練的技術人員能夠選擇在給定的宿主生物中發揮功能的調節元件。術語“功能性的”是指在給定的宿主生物中能夠發揮功能。
根據本發明嵌合基因包含的啟動子或是組成型的或是誘導型的。通過實施例，在細菌中用于表達的啟動子可選自如下啟動子。在大腸桿菌中用于表達的啟動子由lac、trp、lpp、phoA、recA、araBAD、proU、cst-1、tetA、cadA、nar、tac、trc、lpp-lac、Psyn、cspA、PL、PL-9G-50、PR-PL、T7、λPL-PT7、T3-lac、T5-lac、T4基因32、nprM-lac、VHB和蛋白質A啟動子(Makrides，1996，Microbiol.Rev.60512-538；Current Opinions in Biotechnology，1996，7；Weickert等，1996，Current Opinions in Biotechnology 7494-499)或其它Ptrp啟動子(WO 99/64607)組成。用于在革蘭氏陽性菌如棒桿菌或鏈霉菌中表達的由PtipA(Holmes等，1993，EMBO J.123183-3191)或PS1和PS2(FR91/09870)啟動子或在專利申請EP0629699A2中描述的啟動子組成。用于在酵母和真菌表達的乳酸克魯維酵母由(K.lactis)PLAC4啟動子(Van den Berg等，1990，Bio/Technology 8135-139)或乳酸克魯維酵母Ppgk啟動子(專利申請FR91/05294)、木霉tef1或cbh1啟動子(WO 94/04673)、青霉his，csl或apf啟動子(WO00/68401)和曲霉gla啟動子(Gwynne等，1987，Bio/Technology5713-719)。
嵌合基因還可含有編碼信號肽或轉移運的亞細胞定向序列。這種序列位于編碼植酸酶的多核苷酸的上游或下游，使之可以指引所述植酸酶特異性地進入宿主生物的細胞區室，或引導它釋放進入細胞外空間。例如，嵌合基因可含有編碼信號肽或轉運肽的序列，用于引導植酸酶進入具體的細胞質的區室，例如線粒體、質體、內質網或液泡。較佳地，編碼信號肽的定向序列指引植酸酶進入非原質體或細胞外基質。
根據本發明的一個實施例，轉運肽可以是葉綠體、液泡或線粒體的定向信號，然后它在葉綠體、液泡或線粒體中被切割。這種肽廣泛描述于文獻中Neuhaus和Rodgers，1998，Plant Molecular Biology 38127-144；EPSPS轉運肽描述于專利USP 5188642；核酮糖二羧化酶/加氧酶小亞基轉運肽(EP189707)。
根據另一個實施例，轉運肽可由用于指引進入細菌外周質的信號肽組成，例如pac(Schumacher等，1986，Nucl.Acids.Res.145713-5727)，ompA(Bowden和Georgiou，1990，J.Biol.Chem.26516761-16766)和phoA(Chang等，1986，Gene 44121-124)基因的信號肽，或細菌表面錨定肽的信號肽，例如PS1和PS2基因的信號肽(FR91/09870)。
轉運肽可以是單肽或雙肽。雙轉運肽通過中間序列任選地分離。通過葉綠體轉運肽的實施例，將提及在轉錄方向上雙轉運肽包括編碼植物基因的轉運肽的序列，該植物基因編碼位于質體中的酶，來自編碼位于質體中的酶的植物基因的成熟N-末端部分的一部分序列，和編碼植物基因的次級轉運肽的序列，該植物基因編碼位于質體中的酶。這種雙葉綠體轉運肽，例如描述于專利申請EP0 508 909中。
根據一個實施例，轉運肽可包括用于增加釋放進入培養基的感興趣的蛋白質的量的各種元件。因此將提及由載體蛋白和與感興趣的蛋白質融合的蛋白水解酶切位點的組合(USP 6130063)。
根據本發明，嵌合基因還可包括其它調節序列，這些序列位于啟動子和編碼序列之間，例如轉錄激活劑(增強子)。
本發明還涉及含有根據本發明的嵌合基因的克隆和/或表達載體。根據本發明該載體用于轉化宿主生物和在該生物中表達植酸酶。該載體可以是質粒、粘粒、噬菌體或病毒。較佳地，根據本發明的轉化載體是質粒。通常，該載體的主要特性應是在宿主生物的細胞中自我保持和自我復制的能力，具體是依靠復制起始的存在，和表達其中的植酸酶。為了宿主生物穩定轉化的目的，載體也可整合進入基因組。然后載體的組成限于在宿主中合成植酸酶所需的元件。這種載體的選擇，以及根據本發明將嵌合基因插入該載體的技術完整地描述于Sambrook等(1989，分子克隆實驗室手冊，第二版，Nolan C.編，紐約ColdSpring Harbor Laboratory Press)，也是本領域熟練的技術人員一般知識的一部分。優選地，除了依據本發明的嵌合基因，本發明使用的載體還包括編碼選擇性標記的嵌合基因。該選擇性標記使之可以選擇有效轉化的宿主生物，即摻入載體的宿主生物。根據本發明具體的實施例，轉化的宿主生物是一種植物或真菌。在可使用的選擇性標記中，將提及由包含抵抗抗生素或殺真菌劑的基因的標記物組成，例如，潮霉素磷酸轉移酶基因(Gritz等，1983，Gene25179-188；Punt等，1987；Gene 56117-24)，鏈絲菌素乙酰轉移酶，編碼具有腐草霉素抗性的多肽，具有苯菌靈抗性的突變的β-微管蛋白(Gold等，1994，Gene 142225-30)，或雙丙氨酰膦(bialaphos)乙酰轉移酶(Avalos等，1989，Curr Genet，16369-72)。其它標記物可以是補充營養缺陷型的基因，例如pyrA、pyrB、pyrG、pyr4(Buxton和Radford，1983，Mol.Gen.Genet.190403-405)，arg4、argB(Berse等，1983，Gene 25109-117)和trpC(Goosen等.，1989，Mol.Gen.Genet.219282-88)基因，鉬蝶呤(molybdopterin)合酶基因(Appleyard等，1998，J Biol Chem 27314869-76；Unkles等，1999；J BiolChem，27419286-93)或乙酰胺酶(Beri和Turner，1987，Curr Genet，11639-41)。另一類選擇性標記物由耐受除草劑的基因組成，例如耐受雙丙氨酰膦的bar基因(White等，NAR 181062，1990)，耐受草甘膦的EPSPS基因(US5,188,642)，耐受異惡唑的HPPD基因(WO 96/38567)，或草甘膦氧化還原酶基因(US5463175)。還將提及由編碼易于鑒別的酶如GUS酶的基因，或在轉化的細胞中編碼色素或調節色素生產的酶的基因組成。這種選擇性標記基因具體地描述于專利申請WO 91/02071，WO 95/06128，WO 96/38567和WO 97/04103。
本發明還涉及含有依據本發明的至少一個嵌合基因的轉化的宿主生物，或整合進入其基因組或者在染色體外的遺傳因子上攜帶，例如質粒。術語“宿主生物”是指為了產生依據本發明的植酸酶可將依據本發明的嵌合基因引入任何低等或高等單細胞或多細胞生物。較佳地，宿主生物是一種微生物，具體的是真菌，例如青霉屬、曲霉屬、金孢子菌屬(Chrysosporium)或木霉屬，細菌，例如，埃希氏菌屬，具體的是大腸桿菌，棒桿菌屬，或鏈霉菌屬，酵母，具體的是酵母菌屬、克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)或畢赤酵母菌屬(Pichia)，桿狀病毒，或植物細胞。宿主生物也可以是植物或植物的一部分。
表達“轉化的宿主生物”是指已摻入其基因組的宿主生物，或在染色體外的遺傳因子中，例如質粒，依據本發明的至少一個嵌合基因，從而在其組織中或在培養基中產生植酸酶。為了獲得依據本發明的宿主生物，本領域熟練的技術人員可使用許多已知的轉化方法中的一種。
其中一種方法是使欲轉化的宿主生物的細胞或組織與聚乙二醇(PEG)和依據本發明的載體接觸(Chang和Cohen，1979，Mol.Gen.Genet.168(1)，111-115；Mercenier和Chassy，1988，Biochimie 70(4)，503-517)。電穿孔是另一種方法，該方法是將欲轉化的細胞或組織和本發明的載體置于電場中(Andreason和Evans，1988，Biotechniques 6(7)，650-660；Shigekawa和Dower，1989，Aust.J.Biotechnol.3(1)，56-62)。另一個方法是使用微注射直接將載體注射入細胞或組織中(Gordon和Ruddle，1985，Gene 33(2)，121-136)。優選地，可使用“生物彈道(“biolistic”)方法。該方法是用在吸附有本發明的載體上的顆粒轟擊細胞或組織(Bruce等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(24)，9692-9696；Klein等，1992，Biotechnology 10(3)，286-291；美國專利No.4,945,050)。
文獻中描述了用于大腸桿菌和其它革蘭氏陰性菌的轉化細菌的一些方法(Ausubel等，1995，《精編分子生物學實驗指南》，John Wiley和Sons，紐約；Inoue等，1990，Gene 9623-28；Chung等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA862172-2175)。還可使用接合作用(Cameron等，1989，J.Bacteriol，171547-557)。對于革蘭氏陽性菌以及原生質體的轉化，可使用電穿孔，具體的是用于鏈霉菌屬的細菌(Bonamy等，1990，FEMS Microbio.Lett 66263-270；Hopwood等，1985，《鏈霉菌的遺傳操作實驗室手冊》(Genetic Manipulationof Streptomycesa Laboratory Manual.John Innes Foundation，Norwich)。
文獻中也描述了轉化真菌的一些方法(Talbot，2001，《絲狀真菌的分子和細胞生物學》(Molecular and cellular biology of filamentous fungi，牛津大學出版社，紐約)。對于曲霉菌用PEG進行原生質體的轉化描述于EP0260762，在WO 00/36120中描述了該方法適用索狀青霉(Penicilliumfuniculosum)。還已知通過限制性內切酶介導的整合作用或REMI進行轉化(Sanchez等，1998，Mol.Gen.Genet.25889-94)，正如使用農桿菌屬(Agrobacterium)細菌的原生質體的轉化(de Groot等，1998，NatureBiotechnology 16839-842)。文獻中還描述了轉化酵母的技術，具體的是在Ausubel等(1995，《精編分子生物學實驗指南》，John Wiley和Sons，紐約)和Van den Berg等(1990，Bio/Technology 8135-139)中。
在具體的情況下，當欲轉化的宿主生物起源于植物時，優選地使用農桿菌屬的細菌轉化植物細胞或組織，較佳地用根癌農桿菌(A.tumefaciens)感染所述植物細胞或組織(Knopf，1979，Subcell.Biochem.6，143-173；Shaw等，1983，Gene 23(3)315-330)或者發根農桿菌(A.rhizogenes)(Bevan和Chilton，1982，Annu.Rev.Genet.16357-384；Tepfer和Casse-Delbart，1987，Microbiol.Sci.4(1)，24-28)。優選地，根據Ishida等(1996，Nat.Biotechnol.14(6)，745-750)描述的方法進行根癌農桿菌的植物細胞或組織的轉化。本領域熟練的技術人員將依據欲轉化的宿主生物的特性選擇適當的方法。
本發明還涉及含有至少一種植酸酶活性的新細菌提取物，該提取物的特征為它源自酸孢菌屬的細菌。根據本發明，術語“細菌提取物”是指可水溶的或在水溶液中可溶解的部分，所述部分來自粉碎的或離心分離的細菌，這樣細菌成分釋放進入固體部分和液體部分，該液體部分含有全部溶解的細菌成分。植酸酶的活性與植酸降解的量相符，并通常使用由酶反應釋放的無機磷酸鹽定量測定。具體地說，依據Shimizu(1992，Biosci.Biotech.Biochem，56(8)，1266-1269)的方法測定植酸酶的活性，具體如下面實施例2所描述。然而，表征植酸酶活性的任何方法，或者是通過測定底物量的減少或者通過測定來自酶反應的產物的積累，都可用于測定依據本發明的細菌提取物的植酸酶的活性。
依據本發明的細菌提取物的以源自酸孢菌屬的細菌為特征。Kishimoto等描述了酸孢菌屬細菌的特征(1995，System.Appl.Microbiol.18，85-91)。
較佳地，依據本發明的細菌提取物表達植酸酶活性，其活性的最適pH小于或等于4。該活性的最適pH與在依據本發明的的細菌提取物中測定的植酸酶活性最大時的pH一致。
根據本發明具體的實施例，含有植酸酶活性的細菌提取物具有如下特性(a)最適溫度＝65℃(b)最適pH＝3.5根據本發明另一個具體的實施例，含有植酸酶活性的細菌提取物具有如下特性(a)最適溫度＝70℃(b)最適pH＝4根據本發明另一個具體的實施例，含有植酸酶活性的細菌提取物具有如下特性(a)最適溫度＝60℃
(b)最適pH＝3.5術語“最適溫度”和“最適pH”是指在該溫度和pH下，在依據本發明的細菌提取物中測定的植酸酶活性最大。
根據本發明的具體的實施例，依據本發明的細菌提取物源自解氨酸孢菌的細菌菌株，具體的是菌株解氨酸孢菌ATCC 51361，或源自速生酸孢菌的細菌菌株，具體的是菌株速生酸孢菌ATCC 35904。
本發明還涉及制備所述細菌提取物的方法。該方法的特征在于包括如下步驟(a)培養酸孢菌屬的菌株(b)濃縮步驟(a)中培養的細菌(c)粉碎步驟(b)中分離的細菌(d)離心步驟(c)中得到的粉碎的物質(e)回收步驟(d)中得到的具有植酸酶活性的上清液依據本方法，酸孢菌屬的菌株培養于可使該細菌繁殖的合適的培養基中，該培養基的pH調整到所述菌株發育的自然環境的pH條件。文獻描述了細菌的多種培養基，本領域熟練的技術人員可以選擇它們并調整其pH條件。通過實施例，一種嗜酸菌的培養基，具體是酸孢菌屬，描述于Kishimoto等，1995，System.Appl.Microbiol.18，85-91)。
培養后，濃縮得到的細菌。可使用很多方法濃縮細菌，具體地通過離心或過濾。濃縮后，粉碎細菌。細菌的粉碎在于使細菌細胞破裂。可使用本領域熟練的技術人員已知的各種方法進行。較佳地，通過將細菌暴露于超聲波場進行粉碎。然后離心粉碎的細菌物質以分離不溶的細胞碎片，然后回收含有可溶的細胞成分的離心上清液，具體的是表示植酸酶活性的酶。
根據本發明具體的實施例，依據本發明的方法使用的菌株是解氨酸孢菌的菌株，具體的是菌株解氨酸孢菌ATCC 51361，或速生酸孢菌的菌株，具體的是菌株速生酸孢菌ATCC 35904。
本發明還涉及生產依據本發明的植酸酶的方法。根據本發明的實施例，該方法的特征在于包括如下步驟(a)培養酸孢菌屬的菌株(b)濃縮步驟(a)中培養的細菌(c)粉碎步驟(b)中分離的細菌
(d)離心步驟(c)中得到的粉碎的物質(e)回收步驟(d)中得到的具有植酸酶活性的上清液(f)純化步驟(e)中回收的上清液中的植酸酶該方法的步驟(a)到(e)與上述制備細菌提取物的方法的步驟(a)到(e)相同。制備依據本發明植酸酶的本方法的步驟(f)是純化步驟(e)中回收的上清液中的植酸酶。植酸酶的純化可使用任何蛋白質分離技術進行，具體的是本領域熟練的技術人員熟知的電泳和層析技術。為了得到純化的植酸酶，本領域熟練的技術人員可使用上述測定植酸酶活性的方法，以鑒別含有所述植酸酶的純化部分。
較佳地，依據本發明的方法中使用的菌株是解氨酸孢菌的菌株，具體的是菌株解氨酸孢菌ATCC 51361，或速生酸孢菌的菌株，具體的是菌株速生酸孢菌ATCC 35904。
根據本發明另一個實施例，具體地當依據本發明的植酸酶釋放到培養基中時，該方法的特征在于包括如下步驟(a)培養酸孢菌屬的菌株(b)通過除去細菌回收培養基(c)純化步驟(b)中回收的培養基中的植酸酶根據這一方法，通過除去細菌回收培養基的步驟可使用分離包含于液體部分中的固體部分的任何方法進行。具體的是，過濾和離心是進行該步驟的合適的方法。
根據本發明的另一個實施例，生產依據本發明的植酸酶的方法使用依據本發明的轉化的宿主生物，并特征在于包括如下步驟(a)培養依據本發明的轉化的宿主生物(b)濃縮步驟(a)中培養的轉化的宿主生物(c)粉碎步驟(b)中分離的轉化的宿主生物(d)離心步驟(c)中得到的粉碎的物質(e)回收步驟(d)中得到的具有植酸酶活性的上清液(f)純化步驟(e)中回收的上清液中的植酸酶生產根據本發明實施例的植酸酶的本方法的步驟(f)是純化步驟(e)中回收的上清液中的植酸酶。植酸酶的純化可使用任何蛋白質分離技術進行，具體地是本領域熟練的技術人員熟知的電泳和層析技術。為了得到純化的植酸酶，本領域熟練的技術人員可使用上述測定植酸酶活性的方法，以鑒別含有所述植酸酶的純化部分。
較佳地，本方法中使用的轉化的宿主生物是微生物。具體而言，所述的微生物可以是真菌，例如青霉屬，曲霉屬，金孢子菌屬或木霉屬，細菌，例如，埃希氏菌屬，具體的是大腸桿菌，棒桿菌屬或鏈霉菌屬，酵母，具體的是酵母菌屬、克魯維酵母菌屬或畢赤酵母菌屬，桿狀病毒或植物細胞。
根據本發明另一個實施例，具體地當依據本發明的植酸酶釋放到培養基中時，該方法特征在于包括如下步驟(a)培養依據本發明的轉化的宿主生物(b)通過除去所述轉化的宿主生物回收培養基(c)純化步驟(b)中回收的培養基中的植酸酶根據本方法，通過除去轉化的宿主生物回收培養基的步驟可使用分離包含于液體部分中的固體部分的任何方法進行。具體的是，過濾和離心是進行該步驟合適的方法。
本發明還涉及至少含有依據本發明的[空隙(lacuna)]植酸酶的酶組合物。根據具體的實施例，依據本發明的酶組合物含有本發明的細菌提取物。
術語“酶組合物”是指至少含有依據本發明的[空隙(lacuna)]植酸酶的組合物，該植酸酶與促進其穩定性和保守性的多樣的佐劑結合。依據本發明的酶組合物可以是液體形式，所述組合物及其包含的植酸酶存在于水溶液中，或是固體形式，所述組合物及其包含的植酸酶凍干成粉末形式。
根據本發明具體的實施例，除了依據本發明的植酸酶，酶組合物包括至少一種額外的酶。該額外的酶可具有植酸酶活性，或具有不同于植酸酶活性的活性。當這種額外的酶具有植酸酶活性時，所述植酸酶活性較佳地區別于和互補于依據本發明的植酸酶的植酸酶活性。當這種額外的酶具有不同于植酸酶活性的活性時，例如，它可具有木聚糖酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、支鏈淀粉酶、酰胺酶、磷酸酶或甘露聚糖酶活性。
較佳地，將所述酶組合物摻入家畜的飼料中，具體的是單胃的動物，較佳地是豬或家禽。
本發明還涉及至少含有依據本發明的[空隙(lacuna)]植酸酶的飼料組合物。
術語“飼料組合物”主要是指用于家畜的飼料，具體的是用于單胃動物的飼料，較佳地是豬或家禽。添加了本發明酶組合物的依據本發明的飼料組合物理論上是一種用于家畜的飼料。因此，該依據本發明的飼料組合物是用于家畜的飼料，其中加入了至少一種依據本發明的酶組合物，所述飼料和所述酶組合物混合以得到所述飼料組合物。
根據本發明具體的實施例，所述飼料組合物含有至少一種依據本發明的轉化的宿主生物。根據本發明另一個具體的實施例，所述飼料組合物含有至少一種酸孢菌屬的細菌。優選地，酸孢菌屬的細菌是解氨酸孢菌的細菌，具體的是菌株解氨酸孢菌ATCC 51361，或速生酸孢菌的細菌，具體的是菌株速生酸孢菌ATCC 35904。
本發明還涉及包含至少一種依據本發明的細菌提取物或植酸酶的飼料組合物。
優選地，依據本發明的飼料組合物將用于單胃動物的營養物。根據本發明具體的實施例，所述飼料組合物用于豬的營養物。根據本發明的另一個具體的實施例，所述飼料組合物用于家禽的營養物。
本發明的目的還包括生產上述飼料組合物的方法。
根據本發明具體的實施例，所述方法是培養依據本發明的宿主生物或酸孢菌屬的細菌，使用本領域熟練的技術人員已知的任何濃縮方法濃縮所述宿主生物或所述細菌，具體的是過濾或離心，然后將濃縮的所述細菌的宿主生物摻入飼料組合物。優選地，當依據本發明的方法使用酸孢菌屬的細菌時，它是解氨酸孢菌的菌株，具體的是菌株解氨酸孢菌ATCC 51361，或速生酸孢菌的細菌，具體的是菌株速生酸孢菌ATCC 35904。
根據本發明另一個具體的實施例，所述方法在于使用上述制備所述提取物的方法分離依據本發明的細菌提取物，然后將在所述方法的步驟(e)中產生的上清液摻入飼料組合物。
根據本發明另一個實施例，所述方法在于使用上述生產所述植酸酶的方法之一生產依據本發明的植酸酶。然后將生產的所述植酸酶摻入飼料組合物。
本發明還涉及增加包含于單胃動物以植物為基礎的飼料的植酸酶中無機磷酸鹽的同化的方法，其特征在于依據本發明的植酸酶或酶組合物摻入所述動物的營養物中。較佳地，所述方法特征在于用依據本發明的飼料組合物飼喂所述單胃動物。
本發明還涉及減少單胃動物營養物中磷添加的方法，其特征在于用依據本發明的飼料組合物飼喂所述動物。
本發明還涉及降低來自單胃動物營養物消耗的方法，其特征在于用依據本發明的飼料組合物飼喂所述動物。
以下實施例可說明本發明，而不限定本發明的范圍。
實施例1培養酸孢菌屬的細菌酸孢菌屬的細菌是革蘭氏陰性嗜酸細菌，該細菌在酸性pH的培養基中生長。通過實施例，菌株解氨酸孢菌ATCC 51361和速生酸孢菌ATCC 35904的細菌可用于實施本發明。這些細菌可依據相似的方法培養。具體地說，它們培養于含有蛋白胨和葡萄糖的培養基中，在30℃和pH4的有氧條件下培養。一種標準的培養基是，例如，描述于Kishimoto和Tano(1987，J.Gen.Appl.Microbiol.33，11-25)。用于表達植酸酶的培養基不含無機磷酸鹽并添加了植酸(0.4％)和CaCl2(2.2g/l)。
實施例2植酸酶活性的測定在液體培養基中測定植酸酶活性。它在細菌培養物的樣品上或依據本發明的細菌提取物上，或依據本發明的植酸酶上進行。它基于Shimizu的方法(1992，Biosci.Biotech.Biochem.56(8)，1266-1269)。該方法的原理是測定在植酸酶與其底物(1％植酸鈉溶液)酶促反應的過程中釋放的無機磷酸鹽的量。通過其與顯色試劑(1體積的10.8％硫酸鐵與4體積的0.012M鉬酸銨H2SO4即時混合)的反應測定釋放的無機磷酸鹽的量。在高度酸性的培養基中，該反應導致染色的磷鉬酸鹽復合物的形成(Fe2+存在時)，形成復合物的量在分光光度計上定量測定，染色的溶液在700nm處產生吸光率。
兩種不同的反應使之可以測定活性第一次測定是在樣品與底物接觸時(時間T0)進行，第二次測定是在培養60分鐘后(時間T60)進行。時間T0和T60之間的吸光率的變化(比較由緩沖液代替樣品組成的各自的空白試驗)與酶促反應過程中釋放的無機磷酸鹽的量成比例。
通過在具有250μl的TCA的所需緩沖液中，以0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、4mM的濃度混合250μl的KH2PO4溶液并用450μl的顯色試劑顯示制備參考標準范圍。一個酶促單位定義為每分鐘釋放1微摩爾無機磷酸鹽的酶量(在給定的溫度和pH下)。
實施例3含有植酸酶活性的細菌提取物的分離培養后，酸孢菌屬的細菌通過在5000g、4℃離心15分鐘進行濃縮。除去上清液，然后濃縮的細菌在pH3.5的甲酸鹽(100mM)-CaCl2(1mM)緩沖液中重懸浮，以使它們相對于在培養基中的初始濃度濃縮約100倍。然后使用“細胞破碎器”(Cell-d)裝置在2.5千巴的壓力下以一個流動中通過兩次的速率粉碎濃縮的細菌。然后粉碎的細菌物質以5000g、4℃離心15分鐘，回收構成細菌提取物的上清液，并測定其植酸酶活性。
實施例4依據本發明分離的植酸酶的特征4.1植酸酶活性作為溫度的函數在各種溫度下測定依據本發明的植酸酶的活性。給出細菌解氨酸孢菌ATCC 51361(
圖1)和速生酸孢菌ATCC 35904(圖3)的測定結果。對于細菌解氨酸孢菌ATCC 51361和速生酸孢菌ATCC 35904活性的最適溫度分別為70℃和60℃。
4.2植酸酶活性作為pH的函數在各種pH條件下測定依據本發明的植酸酶的活性。給出細菌解氨酸孢菌ATCC 51361(圖2)和速生酸孢菌ATCC 35904(圖4)的測定結果。對于細菌解氨酸孢菌ATCC 51361和速生酸孢菌ATCC 35904活性的最適pH分別為4和3.5。
實施例5依據本發明的植酸酶的純化5.1.粗提物的制備離心酸孢菌屬菌株的細胞，然后在pH6.5、含有1mM CaCl2的MES緩沖液(25mM)中洗滌3次以除去來自培養基的植酸和無機磷酸鹽(生長過程中累積的)。然后這樣得到的細胞懸浮液在“細胞破碎器”(1.5千巴)中破碎，接著其pH下降到5.5(通過加入3.7％的鹽酸)。
這樣得到的提取物以20,000g離心1小時。然后該上清液通過具有0.45μm孔隙度的膜過濾。
5.2.陰離子交換層析上清液通過POROS 20 HQ型層析柱(4.6/100mm1.7ml凝膠)。使用pH5.5、含有1mM CaCl2和1M NaCl的MES緩沖液(25mM)進行洗脫。
在死體積部分中發現植酸酶活性(注入活性的50％)。
5.3.疏水作用層析陰離子交換層析結束時回收的部分加入1.5M(NH4)2SO4。然后將該溶液裝載到用pH5.5、含有1mM CaCl2和1.5M(NH4)2SO4的MES緩沖液(25mM)預平衡的POROS 20 HP2型(HQ 4.6/100mm1.7ml凝膠)層析柱上。然后在20個柱體積中用1.5到0M的(NH4)2SO4梯度洗脫蛋白質。
在3個2ml的部分中以0.95M(NH4)2SO4洗脫植酸酶活性。合并這些部分，然后通過pH5.5、含有1mM CaCl2的5升MES緩沖液(20mM)4℃透析過夜。
5.4.陽離子交換層析透析的溶液注入用pH5.5、含有1mM CaCl2的MES緩沖液(20mM)預平衡的POROS 20 HS型(4.6/100mm1.7ml凝膠)層析柱上。在20個柱體積中用0到1M的NaCl梯度洗脫蛋白質。
以0.35M的NaCl濃度洗脫具有植酸酶活性的蛋白質。
5.5.凝膠過濾合并前面步驟中得到的部分，濃縮并裝載到用pH5.5、含有1M CaCl2和0.1M NaCl的MES緩沖液(25mM)預平衡的SUPEROSE 12hr 10/30層析柱(24mlPharmacia)上。用24ml的緩沖液以0.5ml/min的流速洗脫蛋白質。收集0.5ml部分。在14和15ml的洗脫緩沖液之間的3個部分中檢測到植酸酶活性(表1)。
表1凝膠過濾步驟后感興趣的部分中的活性
濃縮顯示植酸酶活性的3個部分并裝載到14.4％的凝膠上用于SDS-PAGE。該凝膠顯示了約63kDa的主帶。
實施例6內部肽的微量測序感興趣的帶(約63kDa)直接從聚丙烯酰胺凝膠上切去。在pH8.6的50％乙腈/50mM Tris-HCl中洗滌2次部分除去凝膠中含有的染料。聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質在400μl的50mM Tris-HCl緩沖液、pH8.6/0.03％SDS中，存在0.4μg內溶素-C的情況下，35℃消化18小時(測序組，來自Roche)。
通過HPLC在直徑為2.1mm的DEAE-C18聯機柱上分離得到的肽。分離梯度是具有2-45％的乙腈/0.1％TFA的梯度。
純化了4種肽，然后使用Applied Biosystems 473A測序儀通過Edman方法測序。
表2得到的內部肽的序列
實施例7編碼植酸酶的基因的克隆7.1.探針的確定在內部肽序列的基礎上，為了通過PCR擴增感興趣的基因片段，合成了幾個簡并的寡核苷酸。
寡核苷酸10ATDATDATNGCNGTRTTYTT寡核苷酸12TCRTCRTASGTGATGATGATSGCSGTRTTYTT寡核苷酸22AARATGGARGGNCARAAYATHGG寡核苷酸23ATGGAAGGCCAGAAYATCGGCGA寡核苷酸25ATCGGCGAYCTBCTBAAYGCCAA檢測了引物寡核苷酸10和寡核苷酸12與寡核苷酸22、23和25的3個引物的組合，引物對寡核苷酸12和寡核苷酸22使之可以分離來自酸孢菌屬菌株的基因組DNA的500bp的片段。純化后，測定該DNA片段的序列。
該序列的分析可以證實，在該片段中具有編碼肽1的核酸序列，表明有效測序的PCR產物與作為微量測序的對象感興趣的蛋白質一致。
基于從約500bp的PCR產物得到的序列，確定了進一步的引物寡核苷酸29和寡核苷酸30，以獲得對感興趣的基/因具有特異性的一組非簡并的引物。
寡核苷酸29TTCATGGGTGGCTTCGATC寡核苷酸30GCTGCCGCATCAGGAAGTTG
7.2.DNA印跡法通過引物寡核苷酸12和寡核苷酸22的擴增得到約500bp的PCR產物在DNA印跡試驗中用作探針。
為了標記探針，使用Q-BIOgeme標記試劑盒通過隨機引發標記10mg純化的PCR產物。
分別用Eco RI、Sac II或Bam HI消化10μg基因組DNA，然后裝載到1％的瓊脂糖凝膠上。遷移后，通過毛細作用將DNA轉移到尼龍膜上(BIODYNEPlus膜，Pall Gelman)。
用5×SSC、5×Denhardt’s、1％SDS和100μg/ml變性的魚DNA的緩沖液，在60℃進行預雜交4小時。
然后用含有10ml預雜交緩沖液和10ng的4.08×108cpm/μg的探針(在干燥閃爍計數器上計數，也就是在缺乏閃爍體時)的緩沖液，在60℃進行雜交16小時。
隨后進行幾次洗滌2次洗滌2×SCC+0.1％SDS在20℃進行3分鐘2次洗滌0.5×SCC+0.1％SDS在20℃進行3分鐘2次洗滌0.4×SCC+0.1％SDS在50℃進行15分鐘在-80℃暴露24小時后，在薄膜上顯示凝膠。
這些試驗可顯示Sac II在用作探針的基因部分切割，但是在這一序列中沒有Eco RI或Bam HI位點。Eco RI和Bam HI消化分別釋放約4kb的片段和大于9kb的片段，靶序列與這些片段雜交。
盡管根據生化研究已知感興趣的蛋白質應由約1.6kb的基因編碼，構建了具有完整Eco RI消化的基因組DNA文庫。
7.3.基因組文庫的構建用Eco RI消化酸孢菌屬菌株的約30μg基因組DNA。在0.7％的瓊脂糖凝膠上遷移后，使用QIAEX II凝膠提取試劑盒(Qiagen)純化3和4kb大小間的片段并脫鹽(microbio spin 6，Biorad)。還純化了大小在2.5和3kb間的片段以及大小在4和5kb間的片段。
使用T4 DNA連接酶(QBIOgene)將純化的片段插入載體pBlueScriptKS(II+)。用大小在3和4kb間的片段進行連接的產物用于通過電穿孔轉化大腸桿菌菌株MC 1061。轉化后，在添加了氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養基上生長之前，細胞溶解于SOC(2％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.05％NaCl、2.5mMKCl、10mM MgCl2、20mM葡萄糖)并在37℃放置1小時。然后培養皿在37℃培養過夜。
7.4.基因組文庫的篩選然后使用寡核苷酸29和寡核苷酸30的引物組通過PCR篩選383個不同的菌落。
在這些克隆中，4個可得到約400bp的PCR產物。允許期望大小的片段擴增的克隆中有2個用于準備質粒小量制備(使用Qiagen試劑盒)。
7.5.基因組插入片段的測序鑒定的兩個質粒用Eco RI和Eco RV消化。其插入片段的測序顯示這兩個質粒攜帶相同的插入片段。序列的分析可以證實1665pb的開放讀框相應于554個氨基酸的蛋白質。另外，在該讀框中發現實施例6中測序的編碼4個內部肽的序列。
實施例8鑒定的基因的亞克隆含有實施例7中在克隆的基因組插入片段中鑒定的開放讀框(稱做ORF281)的序列用寡核苷酸5’ORF281和3’ORF281通過PCR擴增。
5’ORF281 5’TAA CGA TAACAT ATGAAT ATC CGC CGG GCT CT 3’3’ORF281 5’ATA TCT GATAAG CTTTTA TTC GGC GTG CGC GGC 3’純化PCR產物并用Nde I和Hind III限制性內切酶消化，然后克隆入用相同的酶消化的載體pETCm中。得到的載體稱為pETCm281。ORF281插入片段進行測序以證實克隆的序列與從前面克隆的基因組插入片段測定的序列是相同的。
載體pETCm含有氯霉素抗性基因。因此使用氯霉素抗性作為選擇性標記，允許在大腸桿菌的卡那霉素抗性菌株中體內表達菌株BL21 appA(植酸酶-)。
實施例9大腸桿菌中基因亞克隆的表達9.1.重組大腸桿菌菌株的制備在大腸桿菌菌株BL21 appA中進行體內表達試驗。由于在編碼大腸桿菌植酸酶的appA基因中卡那霉素抗性基因的插入，該菌株不再表達內源性植酸酶。還用編碼大腸桿菌β-內酰胺酶的TEM基因制備控制載體。TEM基因也在載體pETCm中克隆，得到的載體稱為pETCmTEM。
用載體pETCmTEM或pETCm281轉化大腸桿菌菌株BL21 appA。分離的菌落在添加了60mg/L的卡那霉素和添加20mg/L的氯霉素的LB培養基上挑選。各個類型的一個菌落在添加卡那霉素和添加相同濃度的氯霉素的LB培養基中培養。這些培養物用于制備甘油(1體積的細胞/體積40％的甘油)，接種用于進行表達試驗的該原液培養物。這些甘油原液貯藏在-80℃。
9.2.表達試驗大腸桿菌菌株BL21 appA pETCm281培養于M98培養基中(修飾的Terrific肉湯培養基(用葡萄糖修飾)每升含有12g細菌用胰蛋白胨、24g酵母提取物、9.4g K2HPO4和2.2g KH2PO4、pH7.2、高壓滅菌，使用前每升培養基加入20mL的葡萄糖(50％))與大腸桿菌菌株BL 21 appA pETCmTEM平行。通過加入0.25mM的IPTG誘導表達，并在兩種溫度下進行30和37℃。
誘導3個小時后，離心培養物。測定重懸浮于甲酸鹽緩沖液中的各個沉淀的植酸酶活性以得到最終濃度為5mg/mL的干細胞。無論在怎樣的培養條件下，在含有pETCm281的菌株和含有pETCmTEM的菌株中都未發現植酸酶活性。
然后含有pETCm281的誘導和未誘導的培養物的等分試樣用超聲處理，接著離心。上清液代表可溶的蛋白質部分，沉淀代表不溶的蛋白質。這兩個部分裝載到變性的SDS-PAGE凝膠上。
MW 63 kDa的蛋白質帶在由IPTG誘導的大腸桿菌菌株BL21 appA pETCm281的不溶部分中非常明顯。在未誘導的負控制中沒有發現相應的帶。因此，ORF281在大腸桿菌中明顯表達。然而，相應的蛋白質是不溶解的，并在這種形式下可能無活性。
9.3.包含體的增溶和復性進行了一系列目的在于增溶和復性由ORF281編碼的蛋白質的步驟，以確定該蛋白質是否具有植酸酶活性。
大腸桿菌菌株BL21 appA pETCm281在M98培養基中培養，然后當600nm處的OD值達到0.4時用0.25mM的IPTG誘導。誘導3個小時后，離心培養物(最終的OD在區域1中)。沉淀以每100mL培養物中4mL的比例溶解于pH8.0的20mM Tris-HCl緩沖液中。細胞在4℃超聲處理以500W的功率超聲處理10秒4次。OD600從14下降到3。懸浮液以16,000g離心10分鐘，然后除去上清液。
每100ml的培養物的沉淀重懸浮于5ml的增溶緩沖液中20mM Tris-HCl，pH8、8M尿素、0.5M NaCl、1mM 2-巰基乙醇。懸浮液在500W的功率下以10秒4次的速率超聲處理，然后在室溫攪拌1小時。接著30ml的該懸浮液在4℃對3升的pH6.5、含有0.5M NaCl和1mM的巰基乙醇的25mM MES復性緩沖液透析16小時(切下10kDa)。對3升的pH5.5、含有0.5M NaCl和1mM巰基乙醇25mM的MES復性緩沖液進行第二次透析5小時(切下10kDa)。然后該懸浮液以16,000g離心10分鐘，酶活分析前在4℃貯存。
相同的培養、增溶和復性的方法應用于大腸桿菌菌株BL21 appA pETCmTEM。
9.4.包含體的活性由大腸桿菌菌株BL21 appA pETCm281和pETCmTEM產生的復性蛋白質的懸浮液在NanosepTM10K Omega(Pall)上濃縮10倍。根據標準方法測定這些濃縮溶液的植酸酶活性(在pH3.5)。該試驗重復進行。
僅在大腸桿菌菌株BL21 appA pETCm281中檢測到植酸酶活性。使用pMUF試驗證實該活性。使用該熒光方法在大腸桿菌菌株BL21 appA pETCmTEM中未檢測到活性，盡管這一方法比通常使用的比色法敏感5倍。
9.5.包含體的純化大腸桿菌菌株BL21 appA pETCm281的再增溶的包含體部分裝載到用pH5.5、含有1mM CaCl2的20mM MES緩沖液預平衡的POROS 20 HS層析柱(HQ4.6/100mm1.7ml凝膠)上。蛋白質在20個柱體積中以0到1M的NaCl梯度洗脫。
植酸酶活性以0.35M的NaCl濃度洗脫。該結果與實施例5.4中天然植酸酶得到的所有方面相同。
平行的，大腸桿菌菌株BL21 appA pETCmTEM的全部提取物(溶解的和不溶的蛋白質)裝載到相同的柱上，并在相同的條件下洗脫蛋白質。在0.15和0.45MNaCl間洗脫的部分中未能檢測到植酸酶活性。
9.6.SDS-PAGE凝膠從陽離子交換層析柱得到的顯示植酸酶活性的部分在NanosepTM上濃縮10倍后裝載到SDS-PAGE凝膠(10％丙烯酰胺)上。大腸桿菌BL21 appA pETCm281和大腸桿菌BL21 appA pETCmTEM的細胞的裂解物(由IPTG誘導的)也裝載到相同的凝膠上。
再一次清楚地顯示僅大腸桿菌BL21 appA pETCm281裂解物包含MW 63 kDa的帶。在顯示植酸酶活性的柱-純化的部分中存在MW 61-63 kDa的主帶。
因此這些結果顯示，在大腸桿菌BL21 appA中亞克隆后ORF281明顯地編碼植酸酶。
實施例10純化的重組植酸酶的特征10.1.植酸酶活性作為溫度的函數在各種溫度下測定在實施例5.5中純化并由ORF281編碼的部分中含有的植酸酶的活性。這些測定的結果在圖5中給出。測定活性的最適溫度是60℃。試驗在pH3進行。
10.2.植酸酶活性作為pH的函數在各種pH下也測定了在實施例5.5中純化并由ORF281編碼的部分中含有的植酸酶的活性。這些測定的結果在圖5中給出。活性的最適pH是3.5。試驗在60℃進行，使用如下演替的緩沖液甘氨酸-HCl(pH2-2.5)，甲酸鹽(pH2.5-4)，乙酸鹽(pH4-5)和MES(pH5-6)。
實施例11同源序列研究實施例7中在克隆的基因組片段中鑒定的含有開放讀框的序列用作探針以尋找酸孢菌和嗜酸菌(Acidiphilium)屬的微生物中的同源序列。
測試的菌株屬于解氨酸孢菌、速生酸孢菌、狹小嗜酸菌(Acidiphiliumangustrum)和多嗜嗜酸菌(Acidiphilium multivorum)。
使用Q-BIOgene標記試劑盒通過隨機引發標記10ng純化的PCR產物。分別用Eco RI或Eco RV消化測定的各個菌株的10μg基因組DNA，然后裝載到兩個1％瓊脂糖凝膠上。遷移后，通過毛細作用將DNA轉移到兩個尼龍膜(BIODYNEPlus膜，Pall Gelman)上。
用5×SSC、5×Denhardt’s、1％SDS和100μg/ml的變性的魚DNA的緩沖液在60℃進行預雜交4小時。
然后用含有10ml預雜交緩沖液和對于膜1(Eco RI)和膜2(Eco RV)分別為7×108和9×108cpm/μg的探針的10ng緩沖液在60℃進行雜交16小時(在干燥閃爍計數器上計數，也就是，在缺乏閃爍體時)。
隨后進行幾次洗滌2次洗滌2×SCC+0.1％SDS在20℃進行3分鐘2次洗滌0.5×SCC+0.1％SDS在20℃進行3分鐘2次洗滌0.4×SCC+0.1％SDS在50℃進行15分鐘在-80℃暴露65小時后，在薄膜上顯示膜。
兩個放射自顯影間沒有觀察到顯著差別。
該結果顯示在檢測的所有酸孢菌屬的菌株中，存在實施例7中鑒定的具有開放讀框的探針的選擇性雜交。該結果表明，在酸孢菌屬的細菌的基因和鑒定的編碼植酸酶的開放讀框之間存在重要的序列同源。另外，它們有力地表明這些基因也編碼植酸酶。
另一方面，用嗜酸菌屬的微生物中的探針沒有得到雜交。這一觀察結果與在這一屬的微生物中使用微生物方法沒有檢測到植酸酶的活性是一致的。
序列表<110>埃迪塞歐法國聯合股份有限公司(ADISSEO FRANCE S.A.S.)<120>新的細菌植酸酶及其生產方法<130>PM 00080<140>
<141>
<150>FR 0014448<151>2000-11-10<160>11<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1665<212>DNA<213>酸孢菌(g.Acidocella)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1665)<400>1atg aat atc cgc cgg gct ctt ttg tgc gcc tcc atg atg gtc tcg tcg 48Met Asn Ile Arg Arg Ala Leu Leu Cys Ala Ser Met Met Val Ser Ser1 5 10 15atc acc ccc gcg gcg gcg cag acc gcc agc ctc ggc gcc acc gcg ccc 96Ile Thr Pro Ala Ala Ala Gln Thr Ala Ser Leu Gly Ala Thr Ala Pro20 25 30gcc tcc gcc agc gcc gca gct tcc tac acc gac gcg ctg ccg acc gcg 144Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser Tyr Thr Asp Ala Leu Pro Thr Ala35 40 45acg ccg atc aag cat ctg gtc atc atc tat ggc gaa aac gtc tcc ttc 192Thr Pro Ile Lys His Leu Val Ile Ile Tyr Gly Glu Asn Val Ser Phe50 55 60gac cat tat ttc gcc acc tac ccg aag gcc acc aac ccg gcc ggt gag 240Asp His Tyr Phe Ala Thr Tyr Pro Lys Ala Thr Asn Pro Ala Gly Glu65 70 75 80ccg gcc ttc cat ggc agc ctg cat ggc cag aaa atc gat aac ctg gtc 288
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165 170 175Asp Gly Asn Thr Val Thr Ala Leu Trp Asn Tyr Ala Gln Gly Tyr Ala180 185 190Met Ser Asp Asn Ala Trp Thr Asp Thr Tyr Gly Pro Ser Thr Pro Gly195 200 205Ala Leu Ala Val Val Ser Gly Gln Thr Asn Gly Ala Val Pro Val Leu210 215 220Gly Thr Ser Pro Asn Leu Asn Pro Asp Gly Gln Gly Gly Phe Thr Asp225 230 235 240Asp Gly Asp Ile Asp Pro Ala Tyr Asp Val Cys Ser Ser Lys Lys Val245 250 255Thr Phe Lys Met Glu Gly Gln Asn Ile Gly Asp Leu Leu Asn Ala Lys260 265 270Lys Val Thr Trp Gly Gly Phe Met Gly Gly Phe Asp Leu Gly Leu Thr275280 285Asn Pro Asn Gly Thr Thr Gly Cys Lys Arg Ser Ser Phe Ala Thr Ala290 295 300Val Asp Ala Pro Thr Ala Asp Tyr Ile Pro His His Asn Trp Phe Gln305 310 315 320Tyr Tyr Ala Ser Thr Ala Asn Tyr Thr His Ala Arg Pro Ala Ala Leu325 330 335Asp Asp Ile Gly Tyr Ser Phe Ala Pro Ser Gly Ala Ala Asp Pro Ala340 345 350Asn His Glu Tyr Asp Leu Lys Asp Phe Glu Ala Ala Val Ser Lys Gly355 360 365Val Tyr Pro Ala Val Ser Tyr Leu Lys Leu Ile Ala Ala Gln Asp Ala370 375 380His Ala Gly Tyr Ser Asp Pro Leu Asp Glu Gln Glu Gly Val Val Lys385 390 395 400Val Ile Asn Phe Leu Met Arg Gln Pro Asp Trp Lys Asn Thr Ala Ile405 410 415Ile Ile Thr Tyr Asp Asp Ser Asp Gly Trp Tyr Asp His Ala Phe Val420 425 430Thr Pro Thr Thr Ser Ser Phe Ser Pro Met Asp Ala Leu Asn Gly Lys435 440 445Gly Val Cys Gly Ala Gly Thr Glu Pro Met Gly Leu Ala Gly Lys Pro450 455 460Val His Gly Leu Cys Gly Pro Gly Thr Arg Ile Pro Phe Met Val Ile465 470 475 480Ser Pro Tyr Ala Lys Lys Gly Phe Ile Ala His Thr Leu Ile Ser Gln485 490 495Ala Ser Val Val Lys Phe Ile Glu Asp Asn Trp Leu Gly Gly Ala Arg500 505 510Leu Gly Gly Gly Ser Phe Asp Ala Asn Ala Gly Ser Ile Met Asp Met515 520 525Phe Asp Phe Lys Thr Ala Pro Lys Gly Arg Asp Val Met Leu Leu Asp530 535 540Ala Asp Thr Gly Thr Ala Ala His Ala Glu545 550
<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述<400>3atdatdatng cngtrttytt 20<210>4<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Oligo12<400>4tcrtcrtasg tgatgatgat sgcsgtrtty tt32<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Oligo22<400>5aaratggarg gncaraayat hgg 23<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Oligo23<400>6atggaaggcc agaayatcgg cga 23
<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Oligo25<400>7atcggcgayc tbctbaaygc caa 23<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Oligo29<400>8ttcatgggtg gcttcgatc 19<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述Oligo30<400>9gctgccgcat caggaagttg 20<210>10<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述5’ORF281<400>10taacgataac atatgaatat ccgccgggct ct32
<210>11<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述3’ORF281<400>11atatctgata agcttttatt cggcgtgcgc ggc3權利要求
1.一種編碼植酸酶的分離的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸選自(a)一種編碼由序列標識SEQ ID NO2描述的植酸酶的分離的多核苷酸，(b)一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸與如(a)所述的多核苷酸雜交(c)一種與如(a)所述多核苷酸同源的分離的多核苷酸(d)如(a)、(b)或(c)所述多核苷酸的片段。
2.如權利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，它以序列標識SEQ ID NO1表示。
3.如權利要求1或2所述的多核苷酸，其特征在于，它源自酸孢菌屬的細菌。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，它編碼活性的最適pH小于或等于4的植酸酶。
5.一種含有如權利要求1-4任一所述多核苷酸的分離的多核苷酸。
6.一種植酸酶，其特征在于，它由如權利要求1-5之一所述多核苷酸編碼。
7.如權利要求6所述的植酸酶，其特征在于，它選自(a)由序列標識SEQ ID NO2表示的植酸酶(b)與如(a)所述植酸酶50％同源的植酸酶(c)如(a)或(b)所述植酸酶的片段
8.如權利要求6或7所述的植酸酶，其特征在于，它源自酸孢菌屬的細菌。
9.如權利要求8所述的植酸酶，其特征在于，其活性的最適pH小于或等于4。
10.一種嵌合基因，其特征在于，它至少包括功能上相互連接的(a)在宿主生物中發揮作用的啟動子(b)如權利要求1-5之一所述的多核苷酸(c)在宿主生物中發揮作用的終止子元件
11.如權利要求10所述的嵌合基因，其特征在于，它還包括在所述宿主生物中發揮作用的信號肽或轉運肽。
12.一種含有如權利要求10或11所述的嵌合基因的表達或轉化載體。
13.如權利要求12所述的載體，其特征在于，它是質粒、噬菌體或病毒。
14.一種含有如權利要求10或11所述的嵌合基因的轉化的宿主生物。
15.如權利要求14所述的宿主生物，其特征在于，它是微生物。
16.如權利要求15所述的宿主生物，其特征在于，所述微生物選自細菌、真菌、酵母和病毒。
17.如權利要求16所述的宿主生物，其特征在于，所述微生物選自棒桿菌屬、鏈霉菌屬和埃希氏菌屬，具體是大腸桿菌。
18.如權利要求16所述的宿主生物，其特征在于，所述微生物選自青霉屬、曲霉屬、金孢子菌屬或木霉屬的真菌。
19.如權利要求16所述的宿主生物，其特征在于，所述微生物選自酵母菌屬、克魯維酵母菌屬和畢赤酵母菌屬的酵母。
20.如權利要求14所述的宿主生物，其特征在于，它是植物細胞、植物或植物的一部分。
21.一種含有至少一種植酸酶活性的細菌提取物，其特征在于，它源自酸孢菌屬的細菌。
22.如權利要求21所述的細菌提取物，其特征在于，所述植酸酶活性的活性最適pH小于或等于4。
23.如權利要求21或22所述的細菌提取物，其特征在于，所述植酸酶活性具有如下特性(a)最適溫度＝65℃(b)最適pH＝3.5。
24.如權利要求21或22所述的細菌提取物，其特征在于，所述植酸酶活性具有如下特性(a)最適溫度＝70℃(b)最適pH＝4。
25.如權利要求21或22所述的細菌提取物，其特征在于，所述植酸酶活性具有如下特性(a)最適溫度＝60℃(b)最適pH＝3.5。
26.一種制備如權利要求21-25之一所述的細菌提取物的方法，其特征在于，它包括如下步驟(a)培養酸孢菌屬的菌株(b)濃縮步驟(a)中培養的細菌(c)粉碎步驟(b)中分離的細菌(d)離心步驟(c)中得到的粉碎的物質(e)回收步驟(d)中得到的具有植酸酶活性的上清液。
27.一種生產如權利要求6-9之一所述的植酸酶的方法，其特征在于，它包括如下步驟(a)培養酸孢菌屬的菌株(b)濃縮步驟(a)中培養的細菌(c)粉碎步驟(b)中分離的細菌(d)離心步驟(c)中得到的粉碎的物質(e)回收步驟(d)中得到的具有植酸酶活性的上清液(f)純化步驟(e)中回收的上清液中的植酸酶。
28.一種生產如權利要求6-9之一所述的植酸酶的方法，其特征在于，它包括如下步驟(a)培養酸孢菌屬的菌株(b)通過除去細菌回收培養基(c)純化步驟(b)中回收的培養基中的植酸酶。
29.一種生產如權利要求6-9之一所述的植酸酶的方法，其特征在于，它包括如下步驟(a)培養如權利要求14-20之一所述的轉化的宿主生物(b)濃縮步驟(a)中培養的轉化的宿主生物(c)粉碎步驟(b)中分離的轉化的宿主生物(d)離心步驟(c)中得到的粉碎的物質(e)回收步驟(d)中得到的具有植酸酶活性的上清液(f)純化步驟(e)中回收的上清液中的植酸酶。
30.一種生產如權利要求6-9之一所述的植酸酶的方法，其特征在于，它包括如下步驟(a)培養如權利要求14-20之一所述的轉化的宿主生物(b)通過除去所述轉化的宿主生物回收培養基(c)純化步驟(b)中回收的培養基中的植酸酶。
31.一種酶組合物，其特征在于，它含有至少一種如權利要求21-25之一所述的細菌提取物。
32.一種酶組合物，其特征在于，它含有至少一種如權利要求6-9之一所述的植酸酶。
33.一種飼料組合物，其特征在于，它含有至少一種如權利要求14-20之一所述的轉化的宿主生物。
34.一種飼料組合物，其特征在于，它含有至少一種酸孢菌屬的細菌。
35.如權利要求34所述的飼料組合物，其特征在于，所述細菌選自解氨酸孢菌和速生酸孢菌。
36.一種飼料組合物，其特征在于，它含有至少一種如權利要求21-25之一所述的細菌提取物。
37.一種飼料組合物，其特征在于，它含有至少一種如權利要求6-9之一所述的植酸酶。
38.如權利要求33-37之一所述的飼料組合物在單胃動物營養物中的應用。
39.如權利要求38所述的飼料組合物的應用，其特征在于，它用于豬的營養物。
40.如權利要求38所述的飼料組合物的應用，其特征在于，它用于家禽的營養物。
41.一種生產如權利要求33所述的飼料組合物的方法，其特征在于，它包括如下步驟(a)培養如權利要求14-20之一所述的宿主生物(b)濃縮步驟(a)中培養的宿主生物(c)將步驟(b)中分離的宿主生物摻入所述飼料組合物。
42.一種生產如權利要求34或35所述的飼料組合物的方法，其特征在于，它包括如下步驟(a)培養酸孢菌屬的菌株(b)縮步驟(a)中培養的細菌(c)將步驟(b)中分離的細菌摻入所述飼料組合物。
43.一種生產如權利要求36所述的飼料組合物的方法，其特征在于，它包括如下步驟(a)培養酸孢菌屬的菌株(b)濃縮步驟(a)中培養的細菌(c)粉碎步驟(b)中分離的細菌(d)離心步驟(c)中得到的粉碎的物質(e)回收從步驟(d)得到的具有植酸酶活性的上清液(f)步驟(e)中回收的上清液摻入所述飼料組合物
44.一種生產如權利要求37所述的飼料組合物的方法，其特征在于，它包括如下步驟(a)培養酸孢菌屬的菌株(b)濃縮步驟(a)中培養的細菌(c)粉碎步驟(b)中分離的細菌(d)離心步驟(c)中得到的粉碎的物質(e)回收從步驟(d)得到的具有植酸酶活性的上清液(f)純化步驟(e)中回收的上清液中的植酸酶(g)將步驟(f)中純化的植酸酶摻入所述飼料組合物
45.一種生產如權利要求37所述的飼料組合物的方法，其特征在于，它包括如下步驟(a)培養酸孢菌屬的菌株(b)通過除去細菌回收培養基(c)純化步驟(b)中回收的培養基中的植酸酶(d)將步驟(c)中純化的植酸酶摻入所述飼料組合物。
46.一種生產如權利要求37所述的飼料組合物的方法，其特征在于，它包括如下步驟(a)培養如權利要求14-20之一所述的轉化的宿主生物(b)濃縮步驟(a)中培養的轉化的宿主生物(c)粉碎步驟(b)中分離的轉化的宿主生物(d)離心步驟(c)中得到的粉碎的物質(e)回收從步驟(d)得到的具有植酸酶活性的上清液(f)純化步驟(e)中回收的上清液中的植酸酶(g)將步驟(f)中純化的植酸酶摻入所述飼料組合物。
47.一種生產如權利要求37所述的飼料組合物的方法，其特征在于，它包括如下步驟(a)培養如權利要求14-20之一所述的轉化的宿主生物(b)通過除去所述轉化的宿主生物回收培養基(c)純化步驟(b)中回收的培養基中的植酸酶(d)將步驟(c)中純化的植酸酶摻入所述飼料組合物。
48.一種提高單胃動物植物基飼料的植酸酶中所含無機磷酸鹽同化作用的方法，其特征在于，將如權利要求6-9之一所述的植酸酶或如權利要求31或32所述的酶組合物摻入所述動物的營養物中。
49.如權利要求48所述的方法，其特征在于，用如權利要求33-37之一所述的飼料組合物飼喂所述單胃動物。
50.一種減少單胃動物營養物中磷添加量的方法，其特征在于，用如權利要求33-37之一所述的飼料組合物飼喂所述動物。
51.一種降低單胃動物營養物中磷消耗的方法，其特征在于，用如權利要求33-37之一所述的飼料組合物飼喂所述動物。
全文摘要
本發明涉及新的細菌植酸酶，以及有關的生產方法。更具體地說，本發明涉及從酸孢菌(Acidocella)屬的細菌獲得的新植酸酶，以及編碼所述植酸酶的多核苷酸。本發明還涉及含有所述多核苷酸的載體，以及在其組織中表達所述植酸酶的轉化的宿主生物。本發明進一步涉及含有至少一種植酸酶活性的新細菌提取物。
文檔編號A01H5/00GK1529755SQ01820656
公開日2004年9月15日 申請日期2001年11月12日 優先權日2000年11月10日
發明者G·拉沃特, G 拉沃特 申請人:埃迪塞歐法國聯合股份有限公司