專利名稱：生產自由游動的鹵蟲無節幼體的方法以及用于該方法的包裝孢囊的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種從一定量鹵蟲孢囊(包括滯育孢囊)生產自由游動的無節幼體的方法，具體方法為，在孵化培養基中孵化孢囊，其密度包括最大5g干物質孢囊/L孵化培養基，孵化時間預設定，孵化條件為在該預定的孵化時間內允許至少一部分孢囊能夠孵化并產生自由游動的無節幼體的孵化條件。在該方法中孢囊與過氧化氫相混合，以打破至少一部分滯育孢囊的滯育狀態，為的是在所述的預定孵化時間里使它們產生自由游動的無節幼體，以便使孵化百分數從全部孢囊的X％(此時孢囊不與過氧化氫相接觸)增長到高于X％的孵化百分數(此時孢囊與所述過氧化氫相接觸)。
鹵蟲無節幼體一般用作水產養殖的活體飼料生物，尤其是作為海魚、海蝦幼蟲階段早期的活體飼料。市場上沒有鹵蟲無節幼體這樣的活體飼料，但是有鹵蟲孢囊，無節幼體就是從鹵蟲孢囊中孵化的。孢囊的孵化可以通過在孵化培養基中完成，孵化時間一般小于24小時，以便每天使用同一孵化設備可以供應新的自由游動的無節幼體。
在被囊的胚胎或鹵蟲的孢囊中，動物胚胎發育過程在原腸胚期停止(或進入滯育)。這樣，雌性個體把這些滯育或休眠胚胎釋放到水環境中，這些滯育或休眠胚胎不能進一步發育成自由游動的無節幼體，除非處于促進孵化的環境條件下。當外界條件刺激使滯育控制機制失靈時它們才會重新啟動發育過程。自然環境下，已知冷休克(休眠)以及脫水可以終止滯育作用。如果孵化條件允許，如此活化的(或休眠的)胚胎能夠恢復發育。
與休眠孢囊一樣，滯育孢囊可以經受長時間的脫水、無氧以及極端溫度和壓力的條件。在自然環境中，這些抵抗力是物種的生存策略，因為孢囊通常只是動物在某一生存環境中短暫的生存階段。在孢囊的自然環境外，當孢囊充分脫水并適當保存即在干燥環境，優選的是在低溫無氧無光照的條件下，孢囊可以存活相當長的時間(幾年)。延長的存儲能力和由此而產生的全年現貨供應的有效性以及產生自由游動的無節幼體的短時性使得它們成為水產養殖的最便利的最少勞動力強度的活體飼料來源。
常規的孢囊孵化方法中，孵化培養基的非生物參數有孵化的鹽度、PH、氧氣濃度以及水溫。Van Stappen(1996)討論了上述的每一個參數，并提供了保證休眠孢囊最佳孵化(即自由游動的無節幼體的最大產量)的參數范圍鹽度5-35g溶解的鹽/LPH＞8氧氣濃度＞2g/L優選的是＞5g/L溫度25-28℃為了促進孵化時胚胎發育的恢復，水面的光照強度應不小于2000勒克司。Van Stappen(1996)進一步指出，孵化罐帶有錐形底并且孢囊密度不超過2g孢囊/L時，可獲得最佳結果。
用于以后水產養殖的鹵蟲孢囊是從自然環境中收集的。在這些收獲的粗產品中，存在不同比例的休眠孢囊和滯育孢囊。干燥的易于使用的商品化產品是在經過一系列加工和條件作用程序后獲得的。在加工過程中，粗產品經純化(去除碎渣)，洗滌(去除鹽分)以及最后的干燥處理。標準的條件處理技術一般試圖模擬休眠的自然條件(保存在冷室中)和/或干燥(熱空氣干燥作為加工過程中的一些步驟)，大多數情況下導致幾乎所有個體孢囊的滯育機制失靈。
一給定的孢囊樣本的總的質量是通過許多特性來判定的。最經常用于樣本質量評估的參數為，孢囊的純度(例如，裂殼孢囊的份數，雜質如空殼、殼碎片、沙粒和/或其它殘渣)的百分數；孢囊和無節幼體的生物計量學(孢囊的直徑，無節幼體的長寬)；無節幼體對幼魚幼蝦的營養價值(例如，HUFA’s濃度)；毒性物質例如重金屬和殺蟲劑對孢囊和無節幼體的污染；以及孢囊的可孵化能力。從經濟學角度來講，最后面的特征是最受重視的，因為，它直接表明了在最佳孵育條件下，可以從一定數量的孢囊中獲得的活體飼料(無節幼體)的數量。可以用一些普遍接受的方法(參見Van Stappen 1996)來表示孵化百分數(H％從100個完整孢囊中孵化出的自由游動的無節幼體的個數)，孵化效率(Heff一克孢囊產品孵化的自由游動的無節幼體的個數)，孵化產量(Houtput一克孢囊產品孵化的自由游動的無節幼體的重量)。當每一樣品在同一實驗條件確定孵化參數時，基于這些孵化參數對孢囊樣本間進行的分類與比較才有效。這些條件必須包括于許多Van Stappen(1996)討論到的關鍵的非生物參數的最佳范圍中。
只有在允許的環境條件下和休眠孢囊中孵化才能出現。實際上，這是一系列復雜而有機組合事件的結果，普遍認為這些事件分為三個不同的階段(Clegg和Conte，1980)。
孵化過程的第一階段就是所謂的前發期發育(pre-emergencydevelopment)(PED)。PED取決于孵化條件，持續約6-18小時(Clegg和Conte，1980)。PED期以孢囊殼破裂為結束，通過破裂的殼壁可以部分看到將來要發育成無節幼體的部分(Hofmann和Hand，1990a)。這一孢囊孵化階段稱為E1期(Nakanishi等，1962，Clegg和Conte，1980)。在PED期間細胞數量不增加(Nakanishi等，1962)，也沒有證據表明DNA合成(Nakanishi等，1963)。胚胎發育的改變處于亞細胞水平，除了其它方面還包括線粒體的成熟，卵黃小板的結構、數量和質量的改變，一些酶系統的活化以及部分儲存能量的消耗(Hofmann 和Hand，1990a；Hofmann 和Hand，1990b；Hand，1993；Clegg，1997)。
在孵化過程的第二階段，E1期胚胎不斷從囊殼中進一步伸出來，一直到PED期完成后2小時(Clegg和Conte，1980)，E1期胚胎變得完全可見。此時，胚胎發育期稱為E2期或傘形期。E2期胚胎由孵化膜包裹，孵化膜提供了胚胎與此時空囊殼的最后連接。
緊接著的2-4小時的孵化過程后，孵化膜破裂，完全發育的無節幼體幼蟲(N1期或第一期無節幼體)釋放到周圍的培養基中(整個孵化階段的實際孵化期或第三期)，Clegg和Conte(1980)。
孵化能力(用H％，Heff或Houtput來測量)需要考慮孵化過程的最終結果，即自由游動的無節幼體。在釋放自由游動的無節幼體之前，表明沒有不同的孵化階段。因此孵化能力不一定表明被囊的胚胎的生存力。E1期胚胎(＝PED期全部完成后)有時不能進行到自由游動的無節幼體期的原因最可能與不完備的孵化條件有關。然而，孢囊的內在因素也可以產生這個問題(例如，能量儲備不足)。進一步來講，在某些鹵蟲株中或在同一株的不同批次之間或多或少的胚胎，盡管有活力，但是不能起始PED，因此不能達到E1期。對這些株和批次來講，目前所用的加工和/或條件處理技術顯然不能使所有單個孢囊的滯育作用失靈，為了獲得最大量的自由游動的無節幼體需要使用額外的更加特異的滯育失活方法(Van Stappen 1996)。所述的方法包括，延長干燥孢囊的冷凍存放時間，重復吸水-脫水循環，在特殊化學物質(如過氧化氫)溶液短時間孵化。這些技術都是株和批特異的，而且，孢囊經常以錯誤的方式應答。當不恰當地使用這些技術時，會得到甚至相反的結果(例如，在化學溶液中以不充分的時間劑量組合孵化)。這些技術應該在目前已經使用的加工技術之后附加使用，即由孢囊的使用者使用。這些技術需要一大堆工作，熟練技術和足夠的鹵蟲的一般背景知識以及待處理株和批的特定信息。沒有這些就會造成錯誤和/或不想要的結果。使用者不熟悉這些特殊的補充的滯育失活技術的特點就會使鹵蟲孢囊的水產養殖的隨時可用的活體飼料源的這一主要優點大打折扣。
例如Van Stappen等人(1998)已公開發表使用過氧化氫來增加鹵蟲孢囊，包括滯育孢囊，孵化百分數的方法。在公開的方法中，孢囊在自來水中預吸水，時間30-180分鐘，接著用過氧化氫溶液處理，其中過氧化氫溶液用去離子水稀釋成1，5，10，20或27％(w/w)的濃度。處理1，5，10，20或30分鐘后，用篩子收集孢囊，用自來水洗滌去除殘存的過氧化氫，接著，在Sorgeloos等人(1986)列出的標準孵化條件下，用海水孵化。在去處過氧化氫后的用海水對孢囊的再孵化是該方法中必不可少的一步，因為，正如作者所述，所用的過氧化氫濃度對任何動物的細胞來講，一般認為是致死的。
所述方法的缺點就是，為得到理想的結果，必須嚴格控制處理時間以及所用過氧化氫的濃度。作者進一步發現，對不同鹵蟲株或同一株不同批次之間，使用所述方法并不能得到同等程度的滯育失活作用。因此，作者告誡統一化使用該方法是比較危險的。更進一步的缺點是，孢囊必須從水化培養基轉移到過氧化氫溶液和隨后的孵化培養基中，這一過程包括許多額外的加工步驟，而且這些步驟必須適時進行。
因此，本發明的目標之一就是能夠提供一個不用進行常規孵化過程所需的很多必要步驟和控制，就可以使孵化百分數增加的使用過氧化氫處理孢囊的新方法。
最后，引入孵化培養基的所述過氧化氫是在0.5-30mg/L孵化培養基范圍中選擇的，其中為了使孵化百分數從X％增加到高于X％的數值，孵化培養基中孢囊的最大孵化密度為5g干物質孢囊/L。
本發明者發現，孵化培養基中如此少量的過氧化氫的引入能夠打破滯育孢囊的滯育作用，因此能增加孵化百分數。使用如此少量的過氧化氫的重要優點就是，不用在某一處理時間之后重新更換孵化培養基，也不用在這一處理時間之后采用一些步驟中和過氧化氫。的確發現，當簡單的把過氧化氫留在含孢囊的孵化培養基中時，其濃度會因為過氧化氫與孢囊發生了化學反應而降低到對無節幼體無害的水平。
Bogatova和Erofeeva(1985)單獨已經知道向孵化培養基中加入過氧化氫的方法。在本論文所述的實驗中，干燥孢囊以8，10和15g/L的密度孵化，以及所加過氧化氫的量為23，33，66，99，132和247mg/L。所得結果表明，33，66和99mg/L的H2O2可以使孵化百分數得到相當大量的增加。然而，根據作者，23mg/L的過氧化氫是不足的，而132和247mg/L過氧化氫會造成無節幼體的大量死亡。
Bogatova和Erofeeva(1985)所述的方法的一個很重要的缺點是，當應用于較大規模的孵化系統時，其實際重要性有限根據VanStappen(1996)，孢囊密度對小體積(＜20L)可以高達5g/L，但是對于大體積來講，孢囊密度應降低到最大2g/L才能使對無節幼體的機械損傷降低到最低以及避免亞最佳水分條件。由于這個原因，在Bogatova和Erofeeva(1985)實驗中的高孢囊密度會在實際條件下產生很多問題，尤其是不能夠獲得一個穩定可靠的無節幼體產量。而且，在Bogatova和Erofeeva(1985)所測定的最佳過氧化氫濃度條件下孢囊要孵化48小時，但在實際應用中孢囊應該孵化24小時，以便每天都可以使用同一孵化設備生產新鮮的無節幼體。由于Bogatova和Erofeeva(1985)研究的目標之一是減少打破滯育孢囊的滯育作用所需的過氧化氫量，(與當時已知的方法相比，在那些方法中在孵化前用1kg過氧化氫每kg干燥孢囊的量來活化)，因此高密度的孢囊似乎不僅用于減少生產表面積，而且也用于減少活化孢囊所需的過氧化氫量。不僅在Bogatova和Erofeeva的論文中而且在他們的專利申請SU-A-935044中都描述這一目的。在這一專利申請所述的實驗中，孵化百分數是在48小時孵化后測定的，實驗所用的孵化密度為10g孢囊/L，過氧化氫濃度在33-99ppm之間。沒有使用較小濃度的過氧化氫，因為，在較小濃度條件下，孢囊不能完全活化。
然而，根據本發明發現，當使用較低孢囊密度，尤其是孢囊密度為5g干物質孢囊/L或優選的更低密度時，Bogatova和Erofeeva(1985)建議的獲得孵化百分數理想增加的過氧化氫用量不能再提供孵化百分數增加，反而會使孵化百分數降低。進一步令人驚奇的發現，Bogatova和Erofeeva(1985I)所述的不足以打破滯育作用的過氧化氫用量在根據本發明的方法中反而足以有效的打破滯育孢囊的滯育作用。因此，根據本發明的方法的一重要優點就是，盡管為使本方法在實際條件下有效，孢囊在較大量的孵化培養基中孵化，但是，不需要大量的過氧化氫以獲得其在孵化培養基中的所需濃度。實際上，滯育孢囊似乎吸收必要量的過氧化氫以打破滯育作用，不管這些過氧化氫是加入到相對小體積或大體積的孵化培養基中，因此，每克孢囊需要基本同樣量的過氧化氫，而不取決于孵化培養基的體積。
在SU-A-1472011中也公布了過氧化氫加入到孵化培養基以活化鹵蟲孢囊的方法。在這一已知方法中，孢囊的孵化密度為10g/L孵化培養基，對于每Kg孢囊，須向孵化培養基中加入10g過氧化氫。據此量，可以算出引入到每L孵化培養基中的過氧化氫為100mg。再者，這一現有技術方法中使用了更高的孢囊密度和更高的過氧化氫濃度。
在根據本發明方法的優選實施方案中，所選過氧化氫的量低于20mg/L以及更優選的是低于15mg/L，并且高于1mg/L，尤其是高于2mg/L，以及更優的是高于3mg/L。
本發明進一步涉及在孵化培養基中孵化以產生自由游動的無節幼體的鹵蟲孢囊。當該孢囊在無過氧化氫的孵化培養基中孵化時，孢囊顯示出占總的完整孢囊X％的孵化百分數。本發明的孢囊其特征在于，孢囊和一定量的過氧化氫和/或一定量的至少一種在加入到孵化培養基中可以產生過氧化氫的化合物組合在一起，所述一定量足以在孵化培養基中引入一定量的過氧化氫，當這些過氧化氫引入到孵化培養基中后，可以把孢囊的孵化百分數從X％增加到高于X％的孵化百分數。
與單獨的孢囊，尤其是含有滯育和休眠孢囊的孢囊相比，根據本發明的孢囊與過氧化氫和/或產過氧化氫化合物的組合有以下優點通過向孵化培養基中加入過氧化氫和/或產過氧化氫化合物，可以獲得更高的孵化百分數。由于過氧化氫和/或產過氧化氫化合物與孢囊組合使用，可以避免對使用者的后勤方面的不便，這些不便例如單獨買取和保存將在孵化方法中使用的單個成分。優選的是孢囊和過氧化氫和/或產過氧化氫化合物是一起包裝的。過氧化氫和/或產過氧化氫化合物可以分開包裝，但是，優選的是過氧化氫和/或產過氧化氫化合物混合于或粘貼或包裹在孢囊上。
在根據本發明包裝孢囊的優選實施方案中，所述量的所述過氧化氫和/或產過氧化氫化合物按這樣一種方式決定當向要用來孵化孢囊的培養基中加入一定量的過氧化氫和/或產過氧化氫化合物時，孢囊孵化百分數從X％增加到高于X％的所述孵化百分數。
這個優選的實施方案消除了現有專家向某一給定的孢囊批次中準確及時定量的加入添加劑的必要性。由于最佳劑量可能在孢囊不同株間變化，或同一株孢囊不同批間變化，因此，孢囊與所需量的過氧化氫和/或產過氧化氫化合物的組合可以避免亞最佳和甚至相反孵化結果的危險，如超大劑量的過氧化氫和/或產過氧化氫化合物會嚴重降低孵化量，而少量的超劑量導致遲延孵化。
通過對根據本發明的孵化方法和包裝孢囊的一些特定實施方案的描述，本發明的其它特性和優點會變得清楚明顯。在此描述中，可以參見附圖
圖1是一張表示在鹵蟲孢囊(包括滯育孢囊)孵化開始后向孵化培養基中加入5mg/L過氧化氫的時間(小時)對這些鹵蟲孢囊孵化的作用效果圖；圖2是一張表示向孵化培養基中加入過氧化氫對孵化鹵蟲孢囊(包括滯育孢囊)的劑量相關作用效果圖；圖3是一張表示取決于其中的孢囊密度的孵化培養基中過氧化氫濃度降低圖，孵化培養基中加入了約8.5mg/L的過氧化氫；圖4表示，在與圖3中相同的孵化培養基中(其中加入了約8.5mg/L過氧化氫)，這些孢囊的密度對孵化的相應作用；圖5是一張同圖3相似的圖，并且基于相同的孵化培養基(其中加入了相同量的約8.5mg/L過氧化氫)，只是對于另一包括少量的滯育孢囊的鹵蟲孢囊批次；以及圖6同圖4相似，不過基于圖5中所用的孢囊。
本發明一般涉及從含有一定量滯育孢囊的鹵蟲孢囊開始產生自由游動的鹵蟲無節幼體的方法。正與通常孵化方法相同，孢囊在孵化培養基中孵化，在能允許孢囊孵化并在預定的孵化時間內釋放自由游動的無節幼體的條件下，孵化時間通常在一天(24小時)內。在這一孵化時間(約24小時或小于24小時)，48小時內可孵化的孢囊的至少90％可在這一孵化時間內優先孵化。當干燥的孢囊或鹽水中保存的孢囊(濕孢囊)加入到至少含水的孵化培養基中時，即，孢囊開始吸水時，孵化階段開始。由于孵化培養基的組成和最佳的孵化條件通常對本領域中的技術人員是熟知的，并在文獻中，尤其是在以上提及的Van Stappen(1996)中描述過，因此，對于配方和孵化條件不必作進一步的描述。然而，需要注明的是，孢囊可以在與最佳條件有所不同的條件下孵化。比如，孢囊可以在28℃以上如30℃或在含有35g以上溶解鹽的孵化培養基中孵化。盡管在實際條件下，優選約2g/L或更少的孢囊密度，孢囊密度也可以高于2g/L，但是根據本發明不能高于約5g/L。
根據本發明的方法必要特征之一，進一步講就是，在孵化培養基中加入預定量的過氧化氫，更具體的數量在0.5到30mg/L之間，這個量是用這樣一種方法在這個范圍內挑選出來的，即它可以在至少一些滯育鹵蟲孢囊中有效的打破滯育，以使這些滯育孢囊在孵化期間產生自由游動的無節幼體。當孢囊含有一定比例的滯育孢囊時，孵化百分數可以從在無過氧化氫引入的孵化培養基中產生的占總的完整孢囊的X％增加到高于X％(其中孢囊在含有過氧化氫的孵化培養基中孵化)的孵化百分數。很明顯在本發明的方法中，至少一部分滯育孢囊會孵化，但并不是加入到孵化培養基中的所有滯育孢囊都被孵化，盡管，優選的是盡可能多的滯育孢囊會孵化。
目前本領域的現有方法中，在孵化前，使用重量百分比為1％或更多的過氧化氫來處理干燥的孢囊以增加孵化百分數。與此方法相反，根據本發明的方法，通過在孵化培養基中提供相對少量的低濃度的過氧化氫可以獲得提高的孵化百分數，更為特別的是，這種濃度的過氧化氫不必洗去，因為，當達到E1期時，過氧化氫的濃度降低到對無節幼體無害的程度。因此，本發明的方法優點之一就是，過氧化氫預處理后，孵化培養基不用更換，或此類處理后，過氧化氫不必去除或中和。這尤其要歸功于孢囊對過氧化氫的吸收，以及向孵化培養基中引入與孢囊數量相比相對少量的過氧化氫。可選擇的，可以在處理之后向孵化培養基中引入能促進中和過氧化氫的化合物，尤其是在PED期完成之后，或更換培養基。然而，根據本發明的方法中，這種中和作用或更換培養基不是必要的。
根據本發明的方法中，過氧化氫可以在孵化階段開始時引入到孵化培養基中，尤其是在向孵化培養基中引入孢囊之時引入過氧化氫。如下文所述，這就是當產生過氧化氫化合物與干燥的孢囊相混合的情況。同樣，過氧化氫可以在向孵化培養基加入孢囊之前加入到孵化培養基中。在這種情況下，向孵化培養基中引入過氧化氫的量應該被理解成當加入孢囊時其中實際存在的過氧化氫數量，因為，在加入過氧化氫之后，其中一定量的過氧化氫可能已經被反應掉。可代替的是，不用將過氧化氫引入到全部孵化培養基中，過氧化氫可以在開始時引入到一部分孵化培養基中，這部分培養基可以隨后稀釋到最終體積的孵化培養基。在這種情況下，加入或引入到孵化培養基中的過氧化氫的數量以mg/L終濃度孵化培養基表示，其中孢囊的孵化密度最大約5g干物質孢囊/L。在過氧化氫最初引入的孵化培養基部分可以得到高濃度水平的過氧化氫，然而，這個水平對孢囊并不是致死的。因此，孢囊可以加入到這一部分孵化培養基中。隨著孵化過程，在孢囊變得對過氧化氫敏感之前，如加入孢囊1小時后，這一份孵化培養基必需通過加入孵化培養基稀釋得到最終的孵化培養基，其中，孢囊的孵化最大密度約5g干物質孢囊/L。需要指出的是第一份孵化培養基不一定與最終的孵化培養基有相同的組成，可以包括，比如像海水(例如，自來水)一樣的低鹽濃度的水。當過氧化氫不是與孢囊同時加入到孵化培養基中時，在孵化階段開始之后，過氧化氫優選的引入時間是10小時以內，最優選的時間是8小時以內。獲得對孵化百分數提高的最好作用是在孵化開始階段6小時以內，尤其是在5小時以內。很明顯，全部量的過氧化氫不一定一次性引入到孵化培養基，可以分幾次引入。
圖1說明了在向孵化培養基加入5mg/L過氧化氫的時間對孵化百分數(H％)的影響。在本實施例中，使用過濾海水(35ppt)在一系列1升圓錐體孵化2g同一批的鹵蟲孢囊，包括滯育孢囊(濕度7.5％)。圓錐體中的水溫保持穩定在30℃左右，水要持續通氣和光照。對于不同的過氧化氫處理作用，在孢囊孵化開始后的不同時間(0-10小時)，向孵化培養基加入5mg過氧化氫。每一處理進行兩次，處理結果取平均值。
圖1表明，在這個實施例中在開始孵化后約4小時過氧化氫的引入產生了24小時后測量的孵化百分數的最大增長。
根據本發明引入孵化培養基以獲得最大孵化百分數的過氧化氫的量取決于孢囊的不同株或不同批次。通常，過氧化氫的數量低于30mg/L，特別低于20mg/L，更特別地低于15mg/L，而高于1mg/L，特別地高于2mg/L，更特別地高于3mg/L，對于孵化培養基中相同的孢囊密度而言，除了取決于其它因素之外，它還取決于滯育孢囊的數量，特別是滯育作用的程度，即滯育階段。
為增加孵化百分數而向孵化培養基中引入的過氧化氫，尤其是提供一個最大的孵化百分數M％所引入過氧化氫的最佳量，可以通過以下方式來決定選取一系列的孢囊樣本，在引入每單位體積過氧化氫量互不相同的孵化培養基中，在基本相同的條件(相同溫度，鹽濃度，孢囊密度等)下孵化這些樣本。隨后，可以確定不同量的過氧化氫產生的不同孵化百分數，可以選擇產生理想增加的孵化百分數的過氧化氫量，尤其是可以產生最大孵化百分數M％的最佳過氧化氫量。不僅可以選出產生最大孵化百分數M％，也可以選出產生較少量的孵化百分數的過氧化氫量，尤其是至少等于X％+0.4*(M-X)％(X％代表無過氧化氫加入時的孵化百分數)的孵化百分數，而且更優的是至少等于X％+0.6*(M-X)％。與產生所述最大孵化百分數M％基本相一致的過氧化氫量是最優選的。
圖2說明了過氧化氫對含有滯育孢囊的一批鹵蟲孢囊孵化百分數(H％)的劑量相關的影響作用。在這一實施例中，2g濕度為8.3％的鹵蟲孢囊孵化在一系列1升的圓錐體中，孵化條件與上述
圖1實施例中的所述相同(海水，溫度約30℃，持續通氣和光照)。在孢囊開始孵化后馬上加入過氧化氫。對于不同圓錐體加入從0-30g/L不同量的過氧化氫。每一處理進行兩次，處理結果取平均值。
從圖2可推斷出，對所用批次的鹵蟲孢囊，過氧化氫的最佳量約為12mg/L(＝百萬分之一)，這一量可以使孵化百分數從約22％(＝X％)增加到約76％(＝M％)。在該濃度以上，過氧化氫對鹵蟲無節幼體產生毒性作用，再次造成孵化百分數的減少。
除了在孢囊不同株或不同批次之間的共有區別外，根據本發明也發現，為獲得最大的孵化百分數向孵化培養基中引入的最佳的過氧化氫量也取決于孵化培養基中的孢囊密度。尤其是發現，孢囊密度越高，向每單位體積孵化培養基中加入的過氧化氫的量越大。根據本發明的方法中，孢囊的濃度最多等于約5g干物質孢囊/L，但是，優選的是小于4g干物質孢囊/L，更優選的是小于3g干物質孢囊/L，最優選的是等于約2g干物質孢囊/L或更少。本發明者發現，孢囊密度越高，向每單位體積孵化培養基中加入的過氧化氫的量越大，并且孢囊吸收的過氧化氫的量也越大。
在下一個實施例中，一系列1升圓錐體孵化不同量的孢囊，包括滯育孢囊(孢囊濕度等于8％)，其相應密度為0.5，1，2，3以及4g干物質孢囊/L。對每一個被測孢囊密度，一組圓錐體不含有過氧化物，而另一組圓錐體中在孵化開始階段加入約8.5mg/L過氧化氫。孢囊密度和過氧化氫的每一組合都進行雙份試驗。除了以上的全部20個圓錐體(試驗處理組)外，還設立了補充的圓錐體(對照處理組)，對照處理組只包括孵化培養基和約8.5mg/L過氧化氫。在所有圓錐體中使用的是過濾的35ppt的海水。在實驗過程中，水應該持續通氣和光照，并保持在約30℃恒溫。在本實施例中，每圓錐體的過氧化氫的濃度每30分鐘時間間隔測定一次直到孵化開始后4.5小時。圖3的數據代表每一個試驗處理組中，在測定時剩余過氧化氫的數量，該數據是通過用雙份試驗的平均值減去兩個對照組的平均值來獲得的。試驗處理組孵化的結果是孵化開始24小時測出來的(圖4)，處理結果是雙份試驗的平均值。圖3清楚表明，過氧化氫的減少依賴于孢囊的密度。8.5mg/L的過氧化氫的量對于4g/L的孢囊密度顯得太低，因為4.5小時后，過氧化氫已經基本消失殆盡。并發現這種情況優選發生在約8小時后。因為對于密度為2g孢囊/L也會發生這種情況，所以，可以預想，對于處理2g孢囊/L過氧化氫的最佳量為8.5mg/L，而對較低濃度孢囊來說，8.5mg/L的過氧化氫會太高。
圖4顯示過氧化氫處理對孢囊孵化的影響作用。孵化結果用孵化百分數(H％從100個完整的孢囊中生出的自由無節幼體的個數)或效率百分數(E％100個完整的孢囊產生的全部自由游動的無節幼體、E1和E2階段胚胎)表示。圖4表示沒有過氧化氫處理批次的孢囊孵化百分數約是20％。對于2g/L孢囊密度來講，當8.5mg過氧化氫加入到每升孵化培養基中時，孵化百分數可以達到約70％。在低密度時，E1和E2階段胚胎不會進一步發育，因為殘留在孵化培養基的過氧化物濃度太高了。當E％基本上高于H％時，使用過量的過氧化氫。在高密度時，8.5mg/L的過氧化氫并不足以獲得最佳孵化效果。
圖5與圖3類似，表明在一個不同的批次中，孵化培養基中孢囊密度依賴性的過氧化氫的減少情況。圖6與圖4類似，表明這一不同批次中不同密度的孵化百分數和效率百分數，孢囊在與前述實施例中相同條件下孵化，加入的可比較量的過氧化氫的量約是8.5mg/L孵化培養基。從圖5中可以看出，孢囊造成孵化培養基中過氧化氫濃度相當小的降低，而且當E1無節幼體在孵化時，孵化培養基中過氧化氫殘余量太高。圖6表示對于這一批孢囊，正常的孵化百分數(H％)約為65％，以致這一批孢囊比前述實施例中的孢囊含有相當少的滯育孢囊。顯然，滯育孢囊比休眠胞囊吸收更多的過氧化氫。從圖6看出，即使對4g/L孢囊密度而言，過氧化氫的量還是太高，因為產生自由游動的無節幼體(＝N1期)的孢囊百分數比無過氧化氫加入情況下要少。由于E1期，E2期和N1期全部量反而增加，可以通過使用較少量的過氧化氫來獲得提高的孵化百分數。
可以通過向孵化培養基加入過氧化氫溶液來向孵化培養基中引入所需量的過氧化氫。然而，根據本發明的方法中，也可以使用當加入到孵化培養基能產生過氧化氫的化合物，尤其是可產生過氧化氫的含有過氧化鍵的化合物，如過氧化物，過硼酸鹽，過硫酸鹽，過乙酸鹽。最優選的產生過氧化氫的化合物是過氧化鎂尤其是過氧化鈣。這些化合物可以固體形式獲得，其通常包括重量為50％到70％之間的活性產物。固體產品的優點之一就是，在包裝孢囊之前尤其進行罐裝之前，它們可以和干燥的孢囊相混合。與其它固體產品相比，過氧化鎂和過氧化鈣有更進一步的優勢，它們比過硼酸鹽或過硫酸鹽(鉀或鈉)更穩定，因此，即使在實際使用階段，包裝罐儲存在相對高溫下時，當加入到孵化培養基中后，這些鎂和鈣的化合物產生所需量的過氧化氫的能力基本上不減小，而且也不會有大量氧氣釋放，否則，這些氧氣會降低包裝孢囊的儲存壽命。
在以上所述的決定向孵化培養基中引入以獲得最大的孵化百分數的最佳過氧化氫量的實施例中，通過向孵化培養基中直接加入過氧化氫溶液來引入過氧化氫。實踐中，在孵化培養基使用其它產生過氧化氫化合物或產品時，所需要的該種化合物或產品的量可以通過計算或簡單滴定來決定，例如，通過高錳酸鉀與過氧化氫在孵化培養基中按照以下方程反應
或者，可以直接用該種化合物進行實驗來決定產生過氧化氫的產品或化合物的用量，這樣不需要任何轉化。
根據本發明的方法所用的孢囊優選的保存在包裝中，尤其是罐中，并且與一些過氧化氫和/或至少一種在加入到孵化培養基中時產生過氧化氫的化合物相結合。上文給出了這些化合物的例子。當向孵化培養基中加入包裝的孢囊時(孢囊密度最大為約5g干物質孢囊/L)，過氧化氫和/或其它產過氧化氫化合物的量至少足以向孵化培養基中引入上述量的過氧化氫。優選的是，與孢囊組合在一起的過氧化氫和/或產過氧化氫化合物的量是通過這樣一種方式確定的當向要孵化包裝孢囊的孵化培養基中加入該量時，所需量的過氧化氫就可以引入到孵化培養基中。采用這種方法，全部量的過氧化氫和/或產過氧化氫化合物可以簡單地和孢囊一起加入到孵化培養基中，不用再計算其量。
更具體的，過氧化氫和/或產過氧化氫化合物是用這樣一種方式來決定的當向欲孵化包裝好的孢囊的孵化培養基中加入該量時，0.5-30mg/L之間的一定量的過氧化氫引入到孵化培養基中。正如上文所述，更具體的講，在這個范圍選擇這個過氧化氫量以便使孵化百分數從全部孢囊的X％(此時孢囊孵化在無過氧化氫的孵化培養基中)增長到孵化百分數高于X％(此時孢囊孵化在有該量的過氧化氫的孵化培養基中)。優選的是，過氧化氫和/或產過氧化氫化合物的量是這樣決定的當孢囊孵化在引入了一定量的過氧化氫(由前述數量產生)的孵化培養基中時，孵化百分數至少等于X％+0.4*(M-X)％而且優選的是至少等于X％+0.6*(M-X)％，最優選的是基本上等于M％。正如上文中早已說明的，M％是最大的孵化百分數，其可以在所用的孵化條件下當向孵化培養基引入最佳量的過氧化氫時獲得。
根據本發明，發現孵化培養基中最佳量的過氧化氫強烈取決于孢囊的密度。從發明人進行的實驗可以看出，令人驚訝的是，孢囊，尤其是滯育孢囊，吸收所需量的過氧化氫幾乎獨立于孵化培養基中過氧化氫的濃度。這意味著，不必使用高密度的孢囊來節省過氧化氫，因為在較低孢囊密度下，即當使用較大體積的孵化培養基時，必須獲得較低濃度的過氧化氫。取決于滯育孢囊的數目，孢囊的滯育程度和其它批與批之間，株與株之間的不同，過氧化氫和/或產過氧化氫化合物的量包括和/或產生大于約0.5mg，優選的是大于約1mg以及最優的是大于約1.5mg過氧化氫每g孢囊干物質，但是小于約15mg，優選的是小于約10mg以及最優的是低于7.5mg過氧化氫每g孢囊干物質。實際上，孢囊并不是絕對干燥，因此，取決于孢囊中的含水量(一般小于10％)，每g實際孢囊中相應的過氧化氫量有所減少。
過氧化氫和/或產過氧化氫化合物的量可以進一步地以包裝的形式保存，這一包裝將過氧化氫和/或產過氧化氫化合物與孢囊分開，并且這一組合可以以這種形式出售。優選的是，過氧化氫和/或產過氧化氫化合物與孢囊聯合包裝，例如，固定在孢囊包裝外邊。進一步的包裝可以形成一個與包裝孢囊可拆分的裝置。但是，優選的是，在其包裝袋里與孢囊一起保存。當使用液體過氧化氫溶液時，過氧化氫可以保存在例如玻璃或塑料小瓶中，并且和孢囊包裝在一個罐內。當使用產生過氧化氫的固體化合物時，該化合物可以以粉末、或顆粒、或藥片或其他固體形式和孢囊直接相混合。當然，也可以與孢囊混合保存在例如膠囊中。或者，產過氧化氫化合物可以進一步粘貼在孢囊上，也就是說，裹在孢囊上。
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權利要求
1.從一定量的包括滯育孢囊的鹵蟲孢囊生產自由游動的鹵蟲無節幼體的方法，具體為在孵化培養基中孵化孢囊，孢囊密度包括最大約5g干物質孢囊/L孵化培養基，孵化時間為一預定的時間，孵化條件為能允許至少一部分孢囊在此預定時間內孵化和釋放自由游動的無節幼體的條件，本方法中，孢囊與過氧化氫相接觸以打破至少一部分所述的滯育孢囊的滯育，以便使孢囊在該預定時間內產生自由游動的無節幼體，從而使孵化孢囊占總的完整孢囊的孵化百分數從不與所述過氧化氫接觸時為X％增加到與所述過氧化氫接觸時的高于X％的孵化百分數，其特征在于，所述的過氧化氫以一個選自0.5-30mg/L孵化培養基的量引入到孵化培養基中，其中孢囊以最大約5g干物質孢囊/L的密度孵化以使孵化百分數從X％增加到高于X％的數值。
2.根據權利要求1的方法，其特征在于，所選擇的過氧化氫的量低于20mg/L以及更加特別的低于15mg/L，并且高于1mg/L，尤其是高于2mg/L，以及更特別的是高于3mg/L。
3.根據權利要求1或2的方法，其特征在于，孢囊在所述孵化培養基中孵化，其密度小于4g干物質孢囊/L，尤其是低于3g干物質孢囊/L，以及更優的是約2g干物質孢囊/L或更少。
4.根據權利要求1-3中的任何一項的方法，其特征在于，所述孢囊包括如此量的滯育孢囊以致通過向孵化培養基中引入最佳量的過氧化氫，其孵化百分數可以從X％增加到M％的最大孵化百分數，并且在所述范圍內選擇所述量的過氧化氫來增加孵化百分數，使其從X％增加到至少等于X％+0.4*(M-X)％的孵化百分數，優選的是增加到至少等于X％+0.6*(M-X)％的孵化百分數。
5.根據權利要求4的方法，其特征在于，所述最大孵化百分數是通過以下方式來決定的選取一些孢囊樣品，將這些樣品在孵化培養基中孵化，這些孵化培養基因每體積單位內引入了不同量的過氧化氫和過氧化氫維持在所述范圍內而互不相同，決定不同過氧化氫量的孵化百分數，以及在所得的孵化百分數中選擇最高的孵化百分數。
6.根據權利要求1-3中的任何一項的方法，其特征在于，為了選擇所述量的過氧化氫，取出一些孢囊樣本，將這些樣本在孵化培養基中孵化，這些孵化培養基因每體積單位內引入了不同量的過氧化氫和過氧化氫維持在所述范圍內而互不相同，確定不同量的過氧化氫的孵化百分數和這些孵化百分數中最大的孵化百分數M％，然后選擇可以使孵化百分數從X％增加到高于X％的數值的過氧化氫量，尤其是產生M％的最大孵化百分數的過氧化氫量，或產生至少等于X％+0.4*(M-X)％的孵化百分數，優選的是產生至少等于X％+0.6*(M-X)％的孵化百分數的過氧化氫量，與所述的產生所述最大孵化百分數M％的過氧化氫量基本相對應的過氧化氫量是最優選的。
7.根據權利要求1-6中任何一項的方法，其特征在于，通過向孵化培養基中加入過氧化氫和/或至少一種能在孵化培養基中產生過氧化氫的化合物來向孵化培養基中引入所述的過氧化氫，優選的將過氧化氫引入到孵化培養基中的方法是向孵化培養基中加入至少一種含有過氧化鍵的產過氧化氫化合物，并且所述化合物更特別地選自包括過氧化物，過硼酸鹽，過硫酸鹽，過乙酸鹽，或其組合的組，優選的產過氧化氫化合物是固體化合物，最優選的含有過氧化鎂和/或過氧化鈣。
8.根據權利要求1-7中任一項的方法，其特征在于，向孵化培養基中加入所述過氧化氫的時間在孢囊孵化開始后10小時以內，優選的是8小時以內，更優選的是6小時以內，最優選的是5小時以內。
9.根據權利要求8的方法，其特征在于，所述過氧化氫基本上是與孢囊同時引入到孵化培養基，尤其是與孢囊混合在一起和/或粘貼或包裹在孢囊上。
10根據權利要求1-9中任一項的方法，其特征在于，所述的預定的孵化時間是約24小時或更少，并且48小時孵化時間內孵化的孢囊的至少90％在此預定期間孵化出來。
11.用于在孵化培養基中孵育以產生自由游動的無節幼體的鹵蟲孢囊，當其孵化在無過氧化氫的孵化培養基中時，該孢囊顯示出占全部完整孢囊X％的孵化百分數，其特征在于鹵蟲孢囊與一定量的過氧化氫和/或至少一種在加入到孵化培養基中時能產生過氧化氫的化合物相組合，所述一定量足以向孵化培養基中引入一定量的過氧化氫，而當這些過氧化氫引入到孵化培養基中時就將孢囊孵化百分數從X％增加到高于X％的水平。
12.根據權利要求11的方法，其特征在于，所述量的所述過氧化氫和/或所述產過氧化氫化合物是采用這樣一種方式來決定的，即當其加入到用于孵化孢囊的孵化培養基中時，孢囊的孵化百分數能從X％增加到所述的高于X％的水平。
13.根據權利要求11或12的方法，其特征在于，所述量的所述過氧化氫和/或所述產過氧化氫化合物是采用這樣一種方式來決定的，即當其加入到用于孵化孢囊的孵化培養基中時，向其中引入的過氧化氫量在0.5-30mg/L之間。
14.根據權利要求11-13的任一項的鹵蟲孢囊，其特征在于，它們在孵化培養基中孵化的預定密度為約5g干物質孢囊/L或更少。
15.根據權利要求11-14的任一項的鹵蟲孢囊，其特征在于，所述的孢囊包括如此量的滯育孢囊以致通過向孵化培養基中引入最優量的過氧化氫，其孵化百分數可以從X％增加到M％的最大孵化百分數，并且所述量的過氧化氫是這樣的以致當孢囊在含有該量過氧化氫的孵化培養基中孵化時，其孵化百分數至少等于X％+0.4*(M-X)％，優選的至少等于X％+0.6*(M-X)％。
16.根據權利要求11-15的任一項的鹵蟲孢囊，其特征在于，鹵蟲孢囊要和至少一種在加入孵化培養基時產生過氧化氫的化合物相組合，所述產過氧化氫化合物優選含有過氧化鍵，并且更特別地選自包括過氧化物，過硼酸鹽，過硫酸鹽，過乙酸鹽，或其組合的組，優選的產過氧化氫化合物是固體化合物，最優選的含有過氧化鎂和/或過氧化鈣。
17.根據權利要求11-16的任一項的鹵蟲孢囊，其特征在于，所述量的所述過氧化氫和/或所述化合物包括和/或產生小于約15mg并且大于約0.5mg，優選的是大于約1mg以及最優的是大于約1.5mg過氧化氫每g孢囊干物質，優選的是，所述量與孢囊混合在一起和/或粘貼或包裹在孢囊上。
18.根據權利要求17的孢囊，其特征在于，所述量的所述過氧化氫和/或所述化合物包括和/或產生小于約10mg，優選的是小于約7.5mg過氧化氫每g孢囊干物質。
19.根據權利要求11-18的任一項的鹵蟲孢囊，其特征在于，孢囊是與所述量的過氧化氫和/或至少一種在加入孵化培養基時能產生過氧化氫的化合物包裝在一起的。
20.根據權利要求19的鹵蟲孢囊，其特征在于，所述量的所述過氧化氫和/或所述產過氧化氫化合物進一步包裝，從而使該過氧化氫和/或該化合物與孢囊分開。
21.根據權利要求19或20的鹵蟲孢囊，其特征在于，所述量的所述過氧化氫和/或所述化合物與孢囊包裝在一起，特別的是，與孢囊混合在一起和/或粘貼或包裹在孢囊上。
全文摘要
從一定數量的鹵蟲孢囊，包括滯育孢囊，中生產自由游動的鹵蟲無節幼體的方法，通過在孵化培養基中孵化，其密度包括最大約5g干物質孢囊/L培養基。為了打破滯育孢囊的滯育狀態，增加孵化百分數，通過加入過氧化氫溶液或像過氧化鎂或過氧化鈣之類的在加入到孵化培養基中時產生過氧化氫的化合物來向孵化培養基中引入一定量的過氧化氫，過氧化氫的所述一定量的選擇范圍在0.5－30mg/L之間。這些固態產過氧化氫化合物的優點之一就是它們可以和孢囊以一定量混合，并與孢囊一起加入到孵化培養基中。
文檔編號A01K61/00GK1471357SQ01817979
公開日2004年1月28日 申請日期2001年10月4日 優先權日2000年10月5日
發明者E·內森斯, W·特拉克爾特, L·范尼烏文霍夫, H·W·紐曼, G·梅謝, E 內森斯, 崳諼幕舴, 碩, 紐曼 申請人:Inve技術股份有限公司