專利名稱：生物活性食品復合物,制備生物活性食品復合產品的方法和用于控制疾病的方法
技術領域：
本發明涉及生物活性食品復合產品，制備生物復合產品的方法以及利用益生菌和群體數量感受性(quorum sensing)抑制劑如抑制性呋喃酮(furanone)和其它包含于生物活性食品復合產品連續相和分散相中的生物活性化合物來控制疾病的方法。
孵化和撫育操作通常依賴鮮活食用生物如魷魚、多毛蟲、Artemia生物質、Artemia幼蟲和微藻類的供應，來為培養和生產水產養殖物生產水產養殖種苗。這些食物通常攜帶大量的細菌，這些細菌可能包括病原體如弧菌屬細菌，并且可能是病毒疾病傳播的載體。鮮活食用生物的使用增加了孵化期感染疾病的危險性而且這些病原體可能會通過種苗被傳播到撫育和培養設備中。
在蝦養殖過程中主要由細菌，特別是弧菌屬菌，和病毒如白斑病毒(White Spot Virus)導致的疾病造成的巨大損失已經對許多國家如中國、泰國、印度尼西亞、印度、菲律賓、巴拿馬、厄瓜多爾等國家的該產業造成重創。孵化槽和孵化池中動物的高密度加劇了病原體的傳播。水生環境，由于經常加入富含蛋白的飼料而適于細菌生長，其中的許多細菌可能是致病的。這些問題由于微生物的相互作用而愈來愈嚴重，已經初步從臨床病理學角度來考慮密集型生產規模中的動物及其環境。當檢測到致病細菌或病毒時，養殖者就向飼料和水中加入抗微生物化合物；甚至當病原體不明顯時，許多養殖者也大量地使用抗生素來進行預防。這導致弧菌的增多，也可能是其它細菌的增多，這些菌具有多重抗生素抗性而且是毒性更強的病原體。病原體包括哈氏弧菌、副溶血弧菌、燦爛弧菌、最小弧菌、霍亂弧菌、解藻朊酸弧菌、鰻弧菌等。
利用有益微生物(益生菌)通過競爭過程和直接抑制來取代致病細菌是優于施用抗生素的補救辦法。益生菌可被用來控制由弧菌和其它革蘭氏陰性菌引起的疾病而且可用來控制包括由氣單胞菌和革蘭氏陽性病原體引起的其他魚和蝦疾病，所述革蘭氏陽性病包括鏈球菌、肉桿菌等。
目前這些被用于水產養殖業，但是它們的效率是不同的；許多產品不是針對水生養殖來設計的或者不是專用于目的動物或所要控制的病原體。換句話說，它們沒有滿足益生菌的定義自然存在的活微生物的培養物，該微生物被動物食用后有利于動物健康。
通常，將所使用的益生菌加到水中，或在某些情況下，使用前與飼料迅速混合起來。由于在干顆粒狀飼料的制備過程中采用了高溫而導致了活菌的死亡，因此益生菌不能在多種顆粒狀和大多數擠壓飼料的制備過程中加入。
WO9629392記載了通過利用呋喃酮(furanone)來抑制某些革蘭氏陰性菌，尤其是弧菌體內的高絲氨酸內酯調節的過程的方法；然而，還沒有人提出適于商業規模養殖的呋喃酮使用機制。
在孵化期，還不能通過食物和水有效控制微生物群體。生物包封(bioencapsulation)，即通過給活食用生物喂含有所需含量的化合物的懸浮液、乳濁液或其它制劑來豐富所述食用生物營養的方法已被用來增加和改善活食用生物如海水蝦，Artemia屬生物的營養物含量(Lavens等，水產養殖和魚業管理Aquaculture and FisheriesManagement)(1992))，其中所述化合物接下來被用來喂魚蝦幼體。該技術已被用來將生物活性化合物如抗生素(Dixon等，1995，Journalof Aquatic Animal Health742-45)和細菌(Gomez-Gil等.1998，Applied and Evironmental Microbiology64(6)2318-2322)傳遞給水產養殖品種。生物包封是提供用于將食用生物體內的營養成分和生物活性化合物傳遞給目的水產養殖品種的載體的有效方法。然而，生物包封給在商業孵化過程中飼養食用生物和目的品種的養殖過程增添了復雜性，所述養殖過程的勞動強度已經很高了。
商品幼體用干飼料已被作為魚和蝦幼體的活食物替代品或食物添加物來進行銷售，其中所述飼料包括蛋白-交聯的微膠囊、噴霧干燥的聚集物、凍干的顆粒和片狀物。然而，以這些不含活食用生物的幼體干飼料為食的魚蝦幼體的存活和/或生長的情況通常很差。因此，海魚和海蝦的孵化可以減少但不能取消應用活食用生物進行種苗生產。
對蝦和魚應用幼體干飼料的有關問題包括(a)在水中物理性質不穩定，即加入到培養槽后飼料顆粒快速分解；和(b)營養成分的高速瀝出，即水溶性的有機物質從完整的飼料顆粒/微膠囊中流失到槽水中。銷售的幼體飼料的物理分解和瀝出導致水質很差。水質差是對魚蝦幼體的壓力根源而且由于促進了病原體的生長而降低了孵化中的健康程度和存活率。
幼體飼料的分解和瀝出程度可以通過以下方式來降低(a)嚴格干燥法，該方法能夠增加飼料顆粒的硬度從而更難溶于水；(b)將飼料營養物包裹或包封在水不溶性的包衣或基質中；或(c)在幼體飼料制品中采用低水溶性的飼料成分。然而，這些方法改進水穩定性和降低瀝出程度的代價是損失了消化系統未發育良好的魚蝦幼體對營養成分的生物利用率，它們不能從這些飼料中獲得適當營養。
蛋白交聯微膠囊(英國專利79437454和2103568)作為干粉商品取代幼蝦食物中的活食用生物。然而，這些膠囊由于瀝出而失去了大量的可溶性營養物并且不能完全取代幼蝦養殖過程中的活藻類和Artemia。
WO87/01587記載了脂凝膠顆粒的形成，從而營養或藥學活性成分被包埋在脂質體中以及該脂質體被包封在水膠體基質中。所述質脂體可在磷脂微球中有效含有小分子的、水溶性的化合物而且所述水膠體基質能夠保護所述質脂體。然而，脂凝膠顆粒由于質脂體負荷容積小和較脆的磷脂膜而不可能含有足夠的營養成分來構成完全的幼體飼料，在與完全幼體飼料所需的其它飼料營養成分混合時，所述磷脂膜可能會破裂。
Villamar和Langdon(海洋生物學(Marine Biology)，115(4)635-642(1993))描述了復合微膠囊(CXM)，該微膠囊能夠顯著減少低分子量的水溶性化合物從幼體飼料中瀝出。通過將含有水溶液內容物質的脂壁微膠囊(LWM)包埋在較大的凝膠珠子中來制備CXM，所述凝膠大珠子含有飼料營養成分并且由藻酸鈉和與鈣進行離子交聯的明膠組成。LWM能將小的水溶性分子保留在CXM中，但是其負載體積小而且制備困難。
幼體飼料CXM用來解決物理學水穩定性以及由于瀝出而造成營養損失的問題，但是并不能傳遞生物活性化合物或控制疾病。生物包封用來提高活食用生物的營養價值并且能使生物活性化合物傳遞到目的品種中，但該技術又給已經非常復雜的魚和甲殼動物幼體的飼養業增添了復雜性和成本。
美國專利US5698246改進了由Villamar和Langdon發展的(海洋生物學(Marine Biology)，115(4)635-642(1993))CXM概念，通過由采用脂質如魚油包裹或包衣干營養飼料然后將所述的被包裹或被包衣的干營養飼料與作為內-益生菌的桿菌屬的細菌一起包封而形成LWM來消除復雜性簡化工藝過程。包衣的飼料和細菌的負載混合物被包封在一種水膠體基質如與鈣進行離子交聯的藻酸鈉中。然后通過懸浮在一種有助于保存的液體介質中來穩定被包封的復合物，所述介質含有作為“外益生菌”的益生細菌。在該液體中，幼體飼料的內益生菌被設計成能夠同營養成分一同進入目的蝦或魚的Gl道而且外益生菌被設計成能夠保留并生長于養殖蝦或魚的水中。
雖然，美國專利5,698,246通過發明新型液體飼料而對水產養殖的傳統飼料制品進行了明顯的改進，但是該專利既沒有提供控制疾病的方法也沒有發展制備CXM的技術，而是采用了簡單的包裹或包衣所含物質的方法來替代LWM并且提供傳遞益生細菌的方法而未描述用于水產養殖中控制疾病的方法。
美國專利US5,776,490涉及通過利用含在復合物、交聯蛋白微膠囊中而不是離子交聯的藻酸鈣和明膠的水膠體基質中的LWM對CXM進行了改進。在水產養殖過程中該發明已經被用于將營養物和藥傳遞給有鰭魚類幼體但沒有提供用于疾病控制的方法。
I期USDA/SBIR批準文號93-33610-8500(1993)記載了用于制備水穩定性水生動物飼料的方法，該飼料是在低于85℃的低溫下進行加工的從而優化了水生動物對營養成分的生物利用率。通過在水中混合含有飼料成分的漿液和藻酸鈉，然后將所述混合物冷擠壓或注入模具中來制備凝膠條，該凝膠條與氯化鈣進行交聯并在低溫下進行干燥，這樣就制成了所述的水穩定飼料。另外，該技術描述了采用真空鼓干燥所述的漿液從而制成與氯化鈣交聯的薄片。該技術利用低溫加工從而避免了加熱對營養物的破壞，該營養物是為水生動物而制備的，但是該技術沒有提到生物活性化合物的傳遞或疾病的控制。
WO95/28830記載了一種“環境溫度方法”即3-156℃，該方法包括混合藻酸鹽、飼料成分和水來制備漿液，該漿液與二價陽離子接觸從而形成水穩定性水生動物飼料顆粒。WO95/28830沒有涉及對組合物和方法進行任何改進的方法。
美國專利US6,024,983記載了在加強動物免疫應答的醫學應用中用于傳遞生物活性化合物的微膠囊組合物。該發明涉及一種混合物，該混合物的一級含生物活性物質的生物適應性微膠囊被包封在二級含生物活性物質的生物適應性微膠囊中。該發明對從感冒抗原到淋病抗原的動物或人類疾病抗原提供免疫應答。應用該發明的目的在于對具有成熟的免疫和恒溫系統的患病動物應用這種生物活性化合物。然而該發明沒有被用于蝦、具有非特異性免疫系統的動物，而且由于與生物醫學領域有關，沒有提供用于水產養殖當中控制疾病的方法。
在另外一種產業中，利用水膠體微膠囊的微囊包封被用來固定包括雜交瘤細胞(US5,116,747，US4,942,129)和胰島(US4,806,355)的生物學活性物質。所述細胞固定于凝膠珠子，用于生物醫學目的包括在生物反應器中大量培養來生產商業用量的生物制劑，或者用于通過醫療植入人或非水產養殖的動物體內進行疾病治療。
還有另外的產業應用中，為了制備用于乳品發酵的細胞生物質，利用藻酸鈣微囊包封來將生物學活性乳酸乳球菌乳脂亞種固定在凝膠珠子(Morin等.，Applied and Environmental Microbiology，58(2)545-550，(1992))。
在研究應用中，Chevalier和de la Noue(Enzyme Microb.Technol.，9；53-56，(1987))通過在氣升式發酵罐中將生物活性枯草桿菌固定于離子交聯的卡拉膠凝膠珠子而提高了α-淀粉酶的酶產量。
在動物飼養業中，乳酸桿菌屬、桿菌屬和其它屬的細菌是通常被作為直接食用的微生物而添加到飼料中的益生菌，該益生菌能夠通過酶作用來增強消化營養物的能力以及能夠在牲畜腸道中抑制潛在的致病微生物的生長，尤其是在壓力狀態下時。牲畜健康狀況的改善通常是由于分泌出抑制病原體在腸道中生長的抗菌物質以及由益生菌激活特異性和非特異性的免疫應答。
在水產養殖中，向水生生物，尤其是幼體形式傳遞如益生菌等的生物活性物質不能通過傳統飼料而順利實現，這些活性物質在水中迅速分解，具有很高的瀝出速率，或在制備過程中經歷了粗糙加工。盡管美國專利US5,698,246和US5,776,490代表水生生物飼料，尤其是魚蝦幼體飼料的技術領域的改進，但是這些仍屬Villamar和Langdon(海洋生物學(Marine Biology)，115(4)635-642(1993))所研究出的方法的變化步驟，沒有描述水產養殖過程中的疾病控制方法。
對海魚的研究結果表明自然存在于腸道內的幾種細菌產生抑制細菌病原體如鰻弧菌等的物質并且這些有益的細菌能夠粘附到魚的腸粘液中并在其中進行生長(Olsson等，Applied and EnvironmentalMicrobiology，58(2)551556，(1992))。
本文所記載的發明提供在Villamar和Langdon(MarineBiology)，115(4)635-642(1993)基礎上進行改進的物質組合物并且提供其他文獻沒有記載的用于控制細菌疾病的方法。
本發明的概述本發明提供用于水生生物的生物活性食品復合物的組合物，制備生物活性食品復合物的方法以及用所述生物活性食品復合物飼養水生生物的方法，所述水生生物包括但不限于甲殼動物、軟體動物和有鰭魚類幼體、后期幼體、幼年和成年形式，本發明還提供在水產養殖過程中控制細菌疾病的方法。
本發明提供將所選擇益生菌以芽孢形式在制備過程中加到飼料中并且同時提供當所述益生菌投喂動物或將加到池塘或槽水中時使這些益生菌激活并萌發的機制。而且，該方法結合了通過抑制調節致病基因活性的基因的表達來控制病原體的方法。這兩種方法的結合比每種單個方法更有效并且具有商業可行性。選擇生產酶的益生細菌，該酶既降解高絲氨酸內酯又降解由弧菌產生的酰基高絲氨酸內酯并且選擇益生菌產生抑制弧菌生長或殺死弧菌的抗生素。
本發明記載將抑制性呋喃酮傳遞給商業飼養的動物從而抑制革蘭氏陰性菌體內的，尤其是致病的弧菌體內的高絲氨酸內酯調控過程的實用方法。本發明將那些抑制性化合物在動物飼料和動物圈養系統中的傳遞與益生菌和其它生物活性化合物的傳遞結合了起來。
因此，本發明提供在水生動物中控制和/或預防疾病的方法，包括給水生動物投喂含有至少一種益生細菌和至少一種抑制性或調節性化合物的組合物。在這種方法中，細菌的致病性可以通過下列共同作用的三種機制的結合而得到抑制a.利用益生細菌如桿菌通過以下方法來控制病原體通過競爭性排除法如競爭食物和空間，并通過直接抑制如通過原位產生殺菌或抑菌物質如抗革蘭氏陰性和革蘭氏陽性病原體的抗生素來減少其數目從而抑制群體數量感受和抑制致病基因的表達；b.利用益生細菌如桿菌通過由益生菌分泌的酶降解病原體分泌的群體數量感受分子來抑制致病基因在革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性病原體中的表達。；c.施用抑制性或調節性化合物如呋喃酮以便在革蘭氏陰性病原菌如弧菌中抑制由高絲氨酸內酯和酰基高絲氨酸內酯調節的致病基因的表達。
在所述生物活性食品復合物的一個實施方案中，含脂溶性生物活性化合物如溶解在脂質中的抑制性呋喃酮組成的第一種油包固體的乳濁液與形成所述穩定乳濁液的分散相的干飼料成分和其它生物活性化合物如所選益生細菌一起形成連續相。所述穩定乳濁液，乳濁液-1在分散相和連續相中提供水生動物正常存活、生長和發育中所需的生物活性物質和必需的營養成分。乳濁液-1本身被水膠體聚合物乳化為分散相，然后水膠體聚合物進行離子膠化從而形成生物活性食品復合物。在下述公開內容中，水膠體是優選類型的聚合物而第二種乳濁液的其它形式的連續相可以包括交聯蛋白或其它形式的可生物降解的聚合物。所述生物活性食品復合物含有能夠提供必需營養物和/或生物活性化合物的細菌芽孢、細菌營養細胞、細菌細胞壁、酵母細胞、酵母抽提物、酵母細胞壁、藻類細胞、藥劑、酶、無脊椎生物胚或生物包封的無脊椎生物，所述必需營養物和/或生物活性化合物有利于促進營養成分的吸收和提高同化作用的效率，增強免疫應答和抑制水生動物的消化道和池塘或水槽或其它飼養水生生物的圈養系統內的致病微生物的生長。
所述生物活性食品復合物可以不需要干燥而以非液體的由微膠囊或珠子組成的半固體、濕糊狀物、或以濕條、顆粒、薄片等形式進行保存，或者通過采用防凍劑(cryopreservative)進行冷凍保存。所述生物活性食品復合物可被直接加到水產養殖動物圈養系統內以便被水生動物食用。在本發明的一個實施方案中，所述生物活性食品復合物或第一種生物活性食品復合物可作為顆粒狀或擠壓的水生生物飼料的表層涂層或包衣加到顆粒狀或擠壓的水生生物飼料中。
新型的雙-乳濁液方法制得所述的生物活性食品復合物。在一個實施方案中，乳濁液-1是由形成分散相的生物活性物質和粉狀營養飼料和形成連續相的含溶解的脂溶性生物活性化合物的食用油組成的油包固體乳濁液。乳濁液-2是一種聚合物包油的乳濁液，其中乳濁液-1作為分散相以及水膠體聚合物作為連續相。乳濁液-1含有分散在油中的飼料營養成分和生物活性物質而且它被水膠體聚合物所乳化從而形成乳濁液-2。在本發明的一個實施方案中，含有脂溶性抑制性呋喃酮的生物活性物質被混合到乳濁液-1的連續相中。在本發明的另一方面，在形成乳濁液-1的過程中可能破裂或損壞的生物活性物質如無脊椎生物或胚胎或益生細菌營養細胞可以通過輕度混合被直接包埋到乳濁液-2中。然后乳濁液-2被離子交聯或絡合成結合了乳濁液-1的生物活物質和營養成分和包埋在乳濁液-2中的完整生物活性物質的物理穩定的基質。在離子膠化方法中，所述生物活性食品復合物可以形成微膠囊或珠子、條狀物、顆粒、片狀物或其它幾何形狀。
被用作乳濁液-1的連續相的食用油可以是魚油、精煉魚油產品或魚油、魚油產品和植物油的混合物。
典型的油包括鯡魚油、鮭魚油、鳳尾魚油、沙丁魚油、金槍魚油、鯖魚油、細鱗胡瓜魚油、魷魚油、綠鱈魚油、鱈魚肝油、食用魚油添加劑如Promega(Warner-Lambert公司)，大豆油、紅花油、玉米油、棕櫚仁油和其它食用油。另外，所述油或油混合物已經添加抑制性呋喃酮、卵磷脂、膽固醇、乳化劑如Santone(Van Den BerghFood Ingr.)、抗氧化劑如乙氧喹、脂溶性維生素A、D、E和K、β胡羅卜素和蝦青素色素。
抑制性呋喃酮和其它脂溶性生物活性化合物、卵磷脂、膽固醇、乳化劑、抗氧化劑、脂溶性維生素和蝦青素被混合到油中后，干粉飼料成分被乳化到油混合物中從而形成乳濁液-1，該乳濁液是油包固體的乳濁液。在本發明的優選方面，固體對油的比例范圍從約0.01∶1至100∶1，優選地0.1∶1至3∶1。因此，取決于固體和油的相對濃度，乳濁液-1的組成可以從油包固體變化到固體包油。
兩種類型的乳濁液在本發明的保護范圍內。在下述公開內容中，當乳濁也被記載為油包固體乳濁液時，應當理解為所述描述也適用于固體包油乳濁液并且除非另有說明，應當理解為生物活性化合物既被包含在兩種類型乳濁液中的分散相中也被含在其連續相中。
在本發明的優選實施方案中，包括細菌細胞壁、細菌細胞或芽孢、酵母、酵母細胞壁、酵母抽提物、藻類細胞、藥劑或酶在內的生物活性物質包含于乳濁液-1的固相中。乳濁液-1的油相作為包含脂溶性生物活性化合物如抑制性呋喃酮、脂溶性激素、脂溶性化學誘引劑或化學刺激劑或其它脂溶性生物活性化合物的介質并且還作為粉狀飼料成分和生物活性物質的疏水性內層包衣。乳濁液-1還作為水生動物的營養源，提供必需脂肪酸、脂溶性營養物質和維生素和色素。
與脂質體、LWM或已知的被包裹的/被包衣的物質不同，本發明的乳濁液-1是在連續相和分散相都含有重要生物活性的油包固體或固體包油的新型乳濁液，其制備簡單，穩定，并能夠提供減少水溶性分子從粉狀營養物和從生物活性物質向水環境瀝出的屏障并且不會受到脂質體或LWM那樣的小負荷容積的限制。乳濁液-1在物理和化學方面不同于美國專利US5,698,246中記載的包裹或包衣的簡單方法，并且代表對Villamar和Langdon(Marine Biology，115(4)635-642(1993))所描述的絡合微膠囊(CXM)的改進。
含有脂溶性的和固體的生物活性物質和飼料成分的乳濁液-1本身被乳化成水膠體聚合物分散體從而形成乳濁液-2，聚合物包油或聚合物包固體的乳濁液。即，乳濁液-2的分散相由乳濁液-1組成以及乳濁液-2的連續相由水膠體聚合物組成。乳化作用可能破損的無脊椎生物胚胎或無脊椎生物、細菌營養細胞或其它物質可通過輕微的混合而被包埋在乳濁液-2中。然后乳濁液-2與用來離子交聯水膠體聚合物的離子接觸。離子凝膠化用來形成乳濁液-2的連續相的穩定基質，其包含乳濁液-2的分散相和被包埋的物質，形成生物活性食品復合物。
在一個實施方案中，所述生物活性食品復合物形成半固體的濕糊并且在有抗菌介質如氯化鈣或氯化鈉鹽水和霉菌抑制劑如甘油、丙二醇、丙酸(proprionic acid)或其它防腐劑存在下通過將水分(Aw)降到0.8來進行保存。另外，所述生物活性食品復合物可以通過采用防凍劑如二甲亞砜(DMSO)、甘油、丁化羥基甲苯(BHT)、蔗糖、棉子糖、甘露醇(manitol)、乙二醇、丙二醇、甲醇、1，2-丙二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁烯二醇來進行冷凍保存。
本發明的詳述在制備過程中將抑制性呋喃酮、益生菌如桿菌的芽孢和干的營養細胞整合到生物活性食品復合物中，其中選用產生特異抑制革蘭氏陰性病原體如弧菌的抗菌物質和酶的益生菌。然后將生物活性食品復合物直接加到水產養殖的水生生物品種的食物中或動物圈養系統中。所述生物活性食品復合物和生物活性食品復合物的乳濁液-1作為傳統動物飼料的外層包衣的活性成分被分別或共同添加，所述傳統動物飼料包括顆粒狀的或擠壓的水生生物飼料。
所述桿菌菌種以產生抑制或殺死致病細菌如弧菌的抗生素為基礎進行選擇。同種或不同的桿菌種類似它們能夠產生通過降解或消化信號分子如高絲氨酸內酯(HSL)和(酰基)高絲氨酸內酯(AHL)來抑制病原體如弧菌中的細胞間信號傳遞的酶為基礎選擇。
在本發明的一個實施方案中，所述降解或消化病原體的信號分子而發生的抑制作用聯合在蝦、魚、軟體動物和其它水生動物腸道內和它們的外表面如甲殼動物的外殼上、軟體動物的軟組織上的和魚的粘液層中競爭營養成分和結合位點，從而既抑制致病基因的表達又降低這些表面上的致病菌如弧菌的數量。
在所述生物活性食品復合物和常規動物飼料的制備過程中同時進行加熱和加壓足以啟動(激活)桿菌芽孢的萌發，只要制備溫度優選地維持在100℃以下。通過將微生物的可溶性內容物如酵母抽提物添加到顆粒中來提供在生物活性食品復合物或飼料發生水合作用以后能夠激活萌發的丙氨酸和其它氨基酸，進一步促進其發育。
在本發明的優選實施方案中，乳濁液-1中的或生物活性食品復合物中的桿菌菌種的芽孢和干營養細胞以及其它的生物活性化合物，尤其是信號分子如HSL和AHL調節的特定群體數量感知過程的抑制劑被作為外層包衣添加到水生生物或擠壓的飼料上。通過桿菌屬益生菌的競爭和抑制，減少了動物的腸道、體表和/或環境內的革蘭氏陰性和革蘭氏陽性病原體的數量從而抑制了病原菌的種群數量感知并由于病原體數量的減少而抑制了這些病原體的致病基因的激活。本發明防止病原體的群體密度超過激活致病基因的最低閾值。通過利用本發明的競爭營養、空間并直接殺死病原體的益生菌將病原體的數量保持在低水平來抑制群體感受的調節基因，使致病基因不進行表達從而不產生疾病。
由于本發明提供共同發揮作用最有效的組合方法或機制，所以本發明的方法不同于其它方法。例如如果單獨使用抑制性呋喃酮或者HSL和AHL調節分子受到破壞或被消化而沒有通過本發明的益生菌競爭性排除或直接抑制病原體，那么病原體的生長就得不到抑制，而只是抑制了致病基因的表達，因此，如果突然停止抑制性呋喃酮的供給，例如如果養殖者用完了經呋喃酮處理的飼料，則出現群體感受而且將分泌致病因子，結果導致疾病而造成動物死亡。桿菌具有兩方面的作用(1)由桿菌產生的酶將降解由病原體如弧菌產生的HSL和AHL并且抑制致病基因的表達；(2)病原體如弧菌的數量由于抑制作用和食物和其它資源的競爭而被減少，因此，低群體密度意味不存在特定數量的種群，即所述病原體的數量太低以致于HSL或AHL化合物的濃度太低而無效。結果是致病基因不能進行表達。不能導致疾病。
益生菌競爭營養，因此抑制病原體的快速生長。當病原體含有對由益生菌產生的抗生素由抗性的基因時，單獨使用所述益生菌沒有效。在本發明的一個較其它過程優選的實施方案中，當益生菌和特定種群數量感知機制一起使用時，較低數量的益生細菌就能有效，從而使得產品的制備簡單而成本低。而且，一種病原體更不可能對所有使用的桿菌屬菌產生的抗生素產生抗性，而且還避免降解病原體信號分子的酶的作用。
在優選的實施方案中，本發明的乳濁液-1是油包固體的乳濁液，該乳濁液由形成分散相的生物活性物質和粉狀的營養飼料以及形成連續相的溶有脂溶性生物活性化合物的食用油組成。在本發明的優選實施方案中，所述油相含有抑制性呋喃酮和其它的生物活性脂溶性化合物。所述油制劑是通過將下列一種或多種混合到食用油中來制備的重量百分含量約為0.0001-50％的脂溶性生物活性化合物如抑制性呋喃酮、重量百分含量約為0.5-5％的乳化劑如Santone(Van DenBergh Food Ingr.)、重量百分含量約為1-10％的卵磷脂、重量百分含量約為1-10％的膽固醇、重量百分含量約為0.01-0.05％的抗氧化劑如乙氧喹、每千克油約2000至8000IU的維生素A、每千克油約1000至4000IU的維生素D3、每千克油約2000至8000IU的維生素E(α-生育酚)、每千克油約20至80mg的維生素K(甲萘醌)、每千克油約2000至8000IU的β-胡蘿卜素和每千克油約500至2000mg的蝦青素。
典型的食用油包括精煉鯡魚油、鮭魚油、鳳尾魚油、沙丁魚油、金槍魚油、鯖魚油、細鱗胡瓜魚油、魷魚油、綠鱈魚油、鱈魚肝油、食用魚油添加劑如Promega(Warner-Lambert公司)，大豆油、紅花油、玉米油、棕櫚仁油和其它食用油。所述油制品含有總濃度大于約1％重量百分含量的ω-3脂肪酸、總濃度大于約0.1％重量百分含量的二十碳五烯酸(EPA)和總濃度大于約0.1％重量百分含量的二十二碳六烯酸(DHA)。為了制備乳濁液-1，在加入粉狀營養飼料和生物活性物質之前，將所述油混合物加熱到約25-40℃。
按需要，為提供不同水生生物品種、特定品種的不同生活周期階段或不同水產養殖應用如常規飼養或在不利時期如后幼體或魚苗從孵化處向養殖池塘運輸時增強對防御和免疫系統的刺激所需的必需食物成分、能量和生物活性物質，可以對乳濁液-1的固相組合物進行調整，所述固相組合物由粉狀營養飼料和生物活性物質組成。可以對下列乳濁液-1的固相組合物進行調整來實現更寬范圍地應用動物的生物活性食品復合物。
乳濁液-1的固相由下列成分中的一種或多種組成重量百分含量約為0.1-95％的細菌芽孢、細菌細胞壁、細菌細胞、包括但不限于乳酸桿菌、桿菌、鏈球菌、雙歧桿菌、明串珠菌(Leuconostor)和交替單胞菌(Alteromonad)；重量百分含量約為0.1-50％的酵母抽提物、酵母細胞壁、食用酵母、啤酒酵母、包括但不限于圓酵母和Phaffia酵母的酵母細胞；重量百分含量約為1-80％的藻類細胞制品、藻類細胞包括但不限于鞭毛藻、Schizochytrium、杜氏藻、角毛藻、Tetraselmis、骨條藻、Nannochloropsis、海鏈藻、褐指藻、等鞭金藻、Paylova；重量百分含量約為0.01-50％的包括但不限于抗生素如Sarafin，瑞吡司特，土霉素的藥劑；粉狀飼料，其濃度被調節用來滿足動物飲食需要，包括重量百分含量約為0-95％的動物蛋白產品；重量百分含量約為0-95％的植物蛋白產品；重量百分含量約為0-25％的禽蛋產品；約40-60mg/kg的維生素B12；約5-20mg/kg的D-生物素；約250-350mg/kg的D-泛酸；約10-30mg/kg的葉酸；約1000-4000mg/kg的L-抗壞血酸-2-多磷酸脂(STAY-C，維生素C的穩定形式)；約3000-4000mg/kg的肌醇；約600-800mg/kg的煙酸；約350-450mg/kg的對氨基苯甲酸；約40-60mg/kg的鹽酸吡哆素；約125-175mg/kg的核黃素；約50-80mg/kg的氯化硫胺；約6500-7500mg/kg的氯化膽堿。
通過將固體成分以約0.01∶1至100∶1，優選0.1∶1至3∶1的比例混合到油混合物中來制備乳濁液-1，該乳濁液-1取決于所述固體與油組分的相對濃度既可以是油包固體乳濁液也可以是固體包油如濁液。乳濁液-1是穩定的并且在20-25℃下保存至少3小時而不發生相的分離。
根據所述生物活性食品復合物的應用情況，以約5至65％的重量百分含量將乳濁液-1混合到水膠體聚合物中來制備乳濁液-2。對于幼蝦來說，優選的組成是水膠體聚合物中的乳濁液-1的重量百分含量約為35-45％。乳濁液-2的連續相由在45-85℃的去離子水中形成的重量百分含量約為0.5-4.0％藻酸鈉或κ卡拉膠聚合物組成。所述藻酸鹽或卡拉膠聚合物可以以約0.1-3.5％的重量百分含量與水中溶解或分散的明膠、玉米蛋白、多熔素、聚精氨酸、殼聚糖、阿拉伯膠或槐樹豆膠制品進行混合從而增加了用于水生生物進行蛋白水解消化的位點并且改進了凝膠基質的構型以及結合強度。所述藻酸鹽或卡拉膠相對多肽或蛋白質如明膠或其它水膠體或樹膠如槐樹豆膠或殼聚糖的比例約為2∶1至約10∶1。
當藻酸鈉被用作乳濁液-2的連續相時，將含水介質調節到約pH12以便保證藻酸鹽分子帶負電從而與鈣發生反應形成藻酸鈣基質。對于κ卡拉膠聚合物，鉀是優選離子，與該聚合物反應從而形成鉀卡拉膠復合物。當與鈣或鉀絡合時，含有乳濁液-2的連續相的聚合物或聚合物混合物用來包封或包埋乳濁液-1。
本發明的另一方面，在形成離子型凝膠基質之前，通過以1-50％的重量百分含量將易碎的物質輕輕混合到乳濁液-2中來而將較易碎的生物活性組分如無脊椎生物胚胎或無脊椎生物包埋在乳濁液-2中。所述易碎的物質可以包括任何適當的活的、冷凍的或凍干的后生動物、原生動物或其它微生物或植物或動物組織，條件是所述細胞結構保持相對完整從而含有細胞內的生物活性組分如球蛋白或其它水溶性化合物。優選的物質包括胚胎、幼體、新生動物或成年的枝角目動物如水蚤、輪蟲如臂尾輪蟲、去殼的Artemia cysts、線蟲、寡毛蟲、多毛蟲或昆蟲。
在優選實施方案的另一方面中，所述生物活性食品復合物的大小和形狀被制備得與目的水生動物品種的進食機制和行為特性相適應。例如，在幼體懸浮喂料器中，微膠囊或珠子可以通過用氮氣將乳濁液-2霧化到重量百分含量約為5-20％的氯化鈣的浸液中并收集尺寸范圍約為20-200mu的凝膠微膠囊來制得。對于以活獵物或腐質為食的幼體和后幼體動物來說，微膠囊可被制成約100-1000mu的尺寸。濕法篩選被用來收集所需尺寸的微膠囊或珠子。
對于以蟲為食的水生動物來說，可以制得類似于大小約0.2mm-20mm(周長)×0.1cm-25cm(長度)的線蟲、寡毛蟲或多毛蟲的蠕蟲狀或條形。通過將乳濁液-2擠壓到重量百分含量為5-20％的氯化鈣浸液中來制成條狀物。對于動物如海膽、蝸牛、鮑或其它以水生植物為食的動物來說，可以制成約0.1cm-1.0cm(厚度)×1.0-100cm(寬度)×1.0cm-100cm(長度)大小的片狀物。可以通過利用適當形狀的模具(例如不銹鋼的或塑料的)來制備凝膠從而制得片狀物，之后浸沒在重量百分含量為5-20％的氯化鈣中。
所述生物活性食品復合物能在重量百分含量約為10-25％的氯化鈣、氯化鈉、氯化鉀或其它鹽溶液中以半固體漿液進行保存而不需干燥。可以添加霉菌抑制劑如甘油、丙二醇或丙酸來保存濕產品。在本發明的另一方面，在-5℃或更低的溫度下對所述生物活性食品復合物進行冷凍之前，以占最終制品約1-50％的的重量百分含量使用防凍劑如二甲亞砜(DMSO)、甘油、丁基化羥基甲苯(BHT)、蔗糖、棉子糖、甘露醇、乙二醇、丙二醇、甲醇、1，2-丙二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁烯二醇。
所述生物活性食品復合物不需要冷凍而能以濕物質的形式保存在約25℃的標準室溫下，或者當需要保持缺乏保護性細胞壁或堅硬膜的軟體無脊椎生物、胚胎或其它生物活性細胞的結構完整性時，可以借助防凍劑進行冷凍保存。
在控制疾病的過程中，所述生物活性食品復合物釋放益生菌、用于降解或消化特定種群敏感分子的酶和抑制性呋喃酮化合物，作為水生動物飼料產品的一部分。所述生物活性食品復合物直接添加到水生生物品種的存放容器如蝦孵化處的幼體養殖槽中，所述生物活性食品復合物在該槽中被吞食。咀嚼和消化所述生物活性食品復合物時，益生菌的芽孢將變成水合形式并萌發為活化狀態。以干營養細胞形式傳遞的益生菌在飼料、腸內和糞便和假糞便中將會萌發得更快而且開始生長。同時，所述抑制性呋喃酮將被釋放到腸道內而隨后通過糞便和假糞便被釋放到圈養系統環境中。益生桿菌開始生長并在損害病原體的情況下競爭空間和食物并且通過原位產生抗生素來抑制病原體的生長。包含于本發明的其它桿菌菌株將產生降解或消化存在于微環境中的HSL和AHL信號分子的酶。呋喃酮將抑制受HSL和AHL調節的致病基因在病原體如弧菌體內的表達。
益生菌和抑制性呋喃酮的共同作用將在孵化環境和其它水生環境中提供最有效的控制疾病的方法。所述生物活性食品復合物為幼蝦正常生長和存活所需提供必需微量和大量營養物質從而消除了使用鮮活食物的需要。
應用于水產養殖培育和生長期的傳統飼料時，本發明的乳濁液-1或生物活性食品復合物可以包含于常規加工的水生生物飼料如顆粒的表層涂裹層或包衣中。以生物活性食品復合物作為表層制劑的活性成分時，將其混合到用作表層的食用油中，在油中形成懸浮液，然后在包裝前將所述懸浮液噴涂或涂裹在飼料顆粒上。或者，直接用乳濁液-1噴涂或包裹所述顆粒，而將乳濁液-1直接用作顆粒飼料的表層。
美國專利US4,352,883描述了在藻酸鈉中形成活細胞的懸浮液，然后將該懸浮液滴加到藻酸鈣的浸液中從而在藻酸鈣中形成固定化的細胞絡合物，該絡合物進一步與多熔素絡合形成比藻酸鈣絡合物更穩定的聚電解質絡合物。該專利的細胞固定化與本發明的主要區別在于(1)該專利中記載的物質不是兩相乳濁液系統而只涉及包埋前懸浮在水膠體聚合物中的活細胞；(2)該專利中記載的物質除了動物直接食用的生物活性物質外，不包括本發明配制的用于提供作為動物食品或飼料的營養成分的營養物質。
Sefton和Broughton Biochimica et Biophysica Acta，7171，473(1982)(聚合物科學和工程的百科全書(Encyclopedia ofPolymer Science and Engineering)，/第9卷，第2版(1987))置備了油包水乳濁液，該乳濁液具有分散于水相中的細胞和作為油相的鄰苯二甲酸二乙酯。該一級乳濁液被乳化在礦物油中，其中礦物油只是用來形成二級乳濁液。該過程與本發明的主要差別在于本發明中的食用油起的作用是(1)作為動物吸收的必需營養成分和生物活性物質的來源，(2)作為疏水性包衣從而防止有機物質流失到水生環境當中，和(3)作為乳濁液-1的連續相。
美國專利US5,776,490是利用被包含在復合的、交聯的蛋白微膠囊中的而不是離子型交聯的藻酸鈣和明膠的水膠體基質中的LWM對CXM概念的改變。乳濁液-1可被用來取代該發明的LWM。
實施例已經從總體上對本發明進行了描述，通過參照特定實施例可以獲得對本發明的進一步理解，除非另有說明，由本文提供的這些實施例只是為了說明目的而不是為了對本發明進行限制。
表1.生物活性食品復合產品的組成實例
實施例2乳濁液-1含有用作如通過造粒和擠壓所制備的傳統動物飼料的表層包衣的生物活性食品復合物，所述乳濁液-1通過混合2500克表2所列的含有魚油與脂溶性生物活性化合物如抑制性呋喃酮的脂類混合物制備。然后將脂類混合物與1000克的飼料混合物進行混合，所述混合物含有表2列出的益生細菌和/或其它生物活性化合物。充分混合物所述混合物從而形成乳濁液-1，該實施例中的乳濁液-1是油包固體乳濁液，其連續相為脂類混合物且分散相為飼料混合物。然后通過噴霧或包衣方法以每公噸動物飼料約1至300kg的油乳濁液的濃度來施用全部的乳濁液，優選地以每公噸動物飼料約10至80kg的油乳濁液的濃度進行施用。在該實施例中，將本發明的生物活性化合物用于傳統的顆粒或擠壓或其它飼料不需要第二種乳濁液，所述飼料已經被制得并且可以用乳濁液-1來包裹。在預防疾病過程中，采用已經被本發明的生物活性乳濁液包衣的傳統飼料飼養水生牲畜如蝦或魚。作為本發明飼料混合物的一部分使用的益生細菌在水中和蝦的Gl道中萌發并生長，其中一些所選菌株產生抗病原體如弧菌的抗生素并且與病原體競爭空間和營養，而本發明的其它所選菌株產生降解或消化病原體的特定種群敏感信號分子如HSL和AHL的酶。同時，通過本發明的乳濁液-1攜帶和傳遞的抑制性呋喃酮抑制由病原體的信號分子如HSL和AHL調控的特定種群敏感過程。通過施用本發明的生物活性化合物和應用本發明的這些不同機制，疾病得到了有效的預防。
表2.用作顆粒狀飼料的生物活性表層的乳濁液-1的組成實施
顯然，按照上述教導有可能對本發明作出多種改進和改變。因此應當理解為在所附的權利要求的范圍內，可以不按本文中的具體描述實施本發明。
權利要求
1.在水生動物中控制和/或預防疾病的方法，其包括給水生動物喂食含有至少一種益生細菌和至少一種抑制性或調節性化合物的組合物。
2.權利要求1的方法，其中所述益生細菌和抑制性或調節性化合物整合于動物飼料中，該飼料加入到含有水生動物的水中。
3.權利要求1的方法，其中所述益生細菌和抑制性或調節性化合物作為生物活性食品復合物的乳濁液-1整合于動物飼料中，所述乳濁液-1用作動物飼料的表層包衣。
4.權利要求1的方法，其中所述益生細菌和抑制性或調節性化合物通過加到生物活性食品復合物中而整合到水生動物的飼料當中，所述生物活性食品復合物用作完全飼料并直接加到水生動物的圈養系統如養魚池、槽、籠子、水道、池塘或其它圈養形式中。
5.權利要求1的方法，其中所述益生細菌和抑制性或調節性化合物作為生物活性食品復合物的乳濁液-1而應用于水生動物飼料，其中所述生物活性食品復合物用作水生動物飼料的表層包衣。
6.權利要求1的方法，其中所述益生細菌選自包括但不限于枯草芽孢桿菌、側孢芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、產氮芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌、浸麻類芽孢桿菌、交替單胞菌屬菌的細菌菌株。
7.權利要求1的方法，其中所述抑制性化合物是呋喃酮或其它的脂溶性生物活性化合物。
8.權利要求1的方法，其中被控制的病原體是包括但不限于哈氏弧菌、副溶血弧菌、燦爛弧菌、最小弧菌、霍亂弧菌、解藻朊酸弧菌、鰻弧菌、其它弧菌屬菌、氣單胞菌屬菌的革蘭氏陰性菌。
9.權利要求1的方法，其中被控制的病原體是包括但不限于鏈球菌、心桿菌、微球菌等的革蘭氏陽性菌。
10.權利要求1的方法，其中病原體的控制發生在動物消化道9中。
11.權利要求1的方法，其中病原體的控制發生在包括飼料容器、飼料盤、圍欄、廄、養魚池、槽、籠子、水道、池塘的動物的環境內，以及這些環境和其它圈養系統的水、表面和沉積物中。
12.制備生物活性食品復合物的方法，包括制備第一乳濁液(乳濁液-1)，該第一乳濁液含有油包固體或固體包油的乳濁液，該乳濁液由形成固相的生物活性物質和粉狀營養物和溶解在形成油相的食用油中的脂溶性生物活性化合物組成，以及制備第二種乳濁液，該第二種乳濁液含有聚合物包油或聚合物包固體的乳濁液，其中分散相含乳濁液-1且水膠體聚合物作為連續相，并且使所述水膠體聚合物暴露給離子，從而離子交聯所述聚合物而形成物理學穩定的凝膠基質，將乳濁液-1包埋在第二種乳濁液中，從而制得生物活性復合物。
13.權利要求12的方法，其中第一種乳濁液的油相選自魚油、精煉魚油和植物油并且含有脂溶性生物活性化合物。
14.權利要求13的方法，其中所述脂溶性生物活性化合物是抑制性呋喃酮(anfuranone)且所述油選自鯡魚油、鮭魚油、鳳尾魚油、沙丁魚油、金槍魚油、鯖魚油、細鱗胡瓜魚油、魷魚油、綠鱈魚油、鱈魚油、食用魚油添加劑、大豆油、紅花油、玉米油和棕櫚仁油。
15.權利要求12的方法，其中第二種乳濁液的連續相聚合物由重量百分含量約為0.5-4.0％的聚合物組成，所述聚合物選自藻酸鹽和卡拉膠聚合物。
16.權利要求12的方法，其中第二種乳濁液的連續相聚合物于45-85℃通過添加至少一種選自鈉、鉀和鈣離子的離子在去離子水中制得。
17.權利要求12的方法，其中所述聚合物以在水中約0.1-3.5％的重量百分含量與選自明膠、玉米蛋白、多熔素、聚精氨酸、殼聚糖、阿拉伯膠和槐樹豆膠制品的成分混合。
18.權利要求12的方法，其中所述固體與油的重量比例在約0.01∶1至100∶1之間，優選在0.1∶1至3∶1之間。
19.權利要求13的方法，其中向油中加入了至少一種選自卵磷脂、膽固醇、和乳化劑、抗氧化劑、脂溶性維生素和蝦青素的物質。
20.權利要求13的方法，其中所述油含有混合物，該混合物含有食用油、重量百分含量約為0.0001至50％的脂溶性生物活性化合物如抑制性呋喃酮、重量百分含量為0.5至5％的乳化劑、重量百分含量約為1至10％的卵磷脂、重量百分含量約為1至10％的膽固醇和重量百分含量約為0.01至0.5％的抗氧化劑。
21.權利要求20的方法，其中所述油含有每千克約2000至8000IU的維生素A、約1000至4000IU的維生素D3、約2000至8000IU的維生素E、約20至80mg的維生素K和約2000mg的蝦青素。
22.權利要求13的方法，其中所述油含有重量百分含量大于1％的ω-3脂肪酸、重量百分含量大于0.1％的二十碳五烯酸和重量百分含量大于0.1％的二十二碳六烯酸。
23.權利要求13的方法，其中在添加所述的生物活性物質和粉狀營養物前將所述油加熱到25至40℃。
24.權利要求12的方法，其中所述生物活性物質和粉狀營養物是選自細菌芽孢、細菌細胞壁、細菌細胞、酵母細胞壁、酵母抽提物、食用酵母、啤酒酵母、酵母細胞和藻類細胞中的至少一種。
25.權利要求24的方法，其中所述細菌細胞是至少一種選自桿菌、乳酸桿菌、鏈球菌、雙歧桿菌、明串珠菌和交替單胞菌的細菌。
26.權利要求12的方法，其中所述油相在加入粉狀營養物和生物活性物質之前含有總濃度大于約1％重量百分含量的ω-3脂肪酸、總濃度大于約0.1％重量百分含量的二十碳五烯酸(EPA)和總濃度大于約0.1％重量百分含量的二十二碳六烯酸(DHA)。
27.權利要求24的方法，其中所述藻類細胞是至少一種選自包括但不限于鞭毛藻、Schizochytrium、杜氏藻、角毛藻、Tetraselmis、骨條藻、Nannochloropsis、海鏈藻、褐指藻、等鞭金藻、Pavlova的藻類細胞
28.權利要求12的方法，其中所述第一種乳濁液的固相含有選自細菌物質、酵母物質、藻類物質、藥劑物質、動物蛋白產品、植物蛋白產品和禽蛋產品的固體物質。
29.權利要求12的方法，其中所述第一種乳濁液的固相含有選自細菌物質、酵母物質、藻類物質、藥劑、粉狀飼料、動物蛋白產品、植物蛋白產品、禽蛋產品、維生素B12、D-生物素、D-泛酸、葉酸、L-抗壞血酸-2-多磷酸脂、肌醇、煙酸、對氨基苯甲酸、鹽酸吡哆素、核黃素、氯化硫胺和氯化膽堿的固體物質，其中所述細菌物質選自細菌芽孢、細菌細胞壁和細菌細胞；所述酵母物質選自酵母細胞壁、酵母抽提物、食用酵母、啤酒酵母、酵母細胞。
30.權利要求29的方法，其中所述第一種乳濁液的固相含有選自乳酸桿菌、桿菌、鏈球菌、雙歧桿菌、明串珠菌和交替單胞菌的細菌物質。
31.權利要求30的方法，其中所述細菌物質以占固相的0.1-95％的重量百分含量存在。
32.權利要求28的方法，其中所述第一種乳濁液的固相含有重量百分含量約為0.1-50％的選自圓酵母和Phaffia的酵母物質。
33.權利要求28的方法，其中所述酵母物質以占固相的0.1-50％的重量百分含量存在。
34.權利要求28的方法，其中所述第一種乳濁液的固相含有選自鞭毛藻、Schizochytrium、杜氏藻、角毛藻、Tetraselmis、骨條藻、Nannochloropsis、海鏈藻、褐指藻、等鞭金藻和Pavlova的藻類物質。
35.權利要求34的方法，其中所述酵母物質以占固相的1-80％的重量百分含量存在。
36.權利要求31的方法，其中所述第一種乳濁液的固相含有選自Sarafin，瑞吡司特和土霉素的抗生素。
37.權利要求36的方法，其中所述抗生素以占固相的0.01-50％的重量百分含量存在。
38.權利要求31的方法，其中所述第一種乳濁液的固相以占固相的0-95％的重量百分含量含有動物蛋白產品。
39.權利要求31的方法，其中所述第一種乳濁液的固相以占固相的0-95％的重量百分含量含有植物蛋白產品。
40.權利要求31的方法，其中所述第一種乳濁液的固相以占固相的0-25％的重量百分含量含有禽蛋產品。
41.權利要求29的方法，其中所述第一種乳濁液的固相含有約40-60mg/kg的維生素B12；約5-20mg/kg的D-生物素；約250-350mg/kg的D-泛酸；約10-30mg/kg的葉酸；約1000-4000mg/kg的L-抗壞血酸-2-多磷酸脂(STAY-C，維生素C的穩定形式)；約3000-4000mg/kg的肌醇；約600-800mg/kg的煙酸；約350-450mg/kg的對氨基苯甲酸；約40-60mg/kg的鹽酸吡哆素；約125-175mg/kg的核黃素；約50-80mg/kg的氯化硫胺和約6500-7500mg/kg的氯化膽堿。
42.權利要求12的方法，其中將較易碎的生物活性組分包埋在第二種乳濁液中。
43.權利要求42的方法，其中所述較易碎的生物活性組分選自無脊椎生物胚胎和無脊椎生物。
44.權利要求42的方法，其中所述較易碎的生物活性組分選自活的后生動物、冷凍的后生動物、凍干的后生動物、活的原生動物、冷凍的原生動物、凍干的原生動物、活的植物或動物組織、冷凍的植物或動物組織和凍干的植物或動物組織。
45.權利要求42的方法，其中所述較易碎的生物活性組分選自枝角動物的胚胎、幼體、新生兒和成年體。
46.權利要求41的方法，其中所述較易碎的生物活性組分選自水蚤、輪蟲、去殼的Artemia cysts、線蟲、寡毛蟲、多毛蟲和昆蟲。
47.權利要求46的方法，其中所述輪蟲是臂尾輪蟲。
48.用于飼養水生動物的生物活性食品復合物，由以下成分組成第一種乳濁液(乳濁液-1)，為油包固體或固體包油的乳濁液，其生物活性物質和粉狀營養物形成固相而脂溶性生物活性化合物溶解于形成油相的食用油；以及第二種乳濁液，由聚合物包油或聚合物包固體的乳濁液組成，其中由乳濁液-1組成分散相而水膠體聚合物作為連續相；將該復合物暴露于離子，從而使得水膠體聚合物離子交聯形成物理學穩定的凝膠基質，乳濁液-1包埋于第二種乳濁液中，從而構成生物活性復合物。
49.權利要求48的生物活性食品復合物，其中所述第二乳濁液的連續相聚合物由重量百分含量約為0.5-4.0％的聚合物組成，該聚合物選自藻酸鹽和卡拉膠聚合物而且其中所述聚合物通過添加選自鈉、鉀和鈣的離子而交聯。
50.權利要求48的生物活性食品復合物，其中所述第一種乳濁液的油相選自魚油、精煉魚油和植物油。
51.權利要求48的生物活性食品復合物，其中所述油相選自鯡魚油、鮭魚油、鳳尾魚油、沙丁魚油、金槍魚油、鯖魚油、細鱗胡瓜魚油、魷魚油、綠鱈魚油、鱈魚油、食用魚油添加劑、大豆油、紅花油、玉米油和棕櫚仁油。
52.權利要求48的生物活性食品復合物，其中所述固體與油的重量比例在約0.01∶1至100∶1之間，優選0.1∶1至3∶1。
53.權利要求52的生物活性食品復合物，其中向油中加入至少一種選自卵磷脂、膽固醇、乳化劑、抗氧化劑、脂溶性維生素和蝦青素的物質。
54.權利要求48的生物活性食品復合物，其中構成所述油的混合物包括食用油、重量百分含量約為0.5至5％的乳化劑、重量百分含量約為1至10％的卵磷脂、重量百分含量約為1至10％的膽固醇和重量百分含量約為0.01至0.5％的抗氧化劑。
55.權利要求48的生物活性食品復合物，其中所述油含有每千克約2000至8000IU的維生素A、約1000至4000IU的維生素D3、約2000至8000IU的維生素E、約20至80mg的維生素K和約2000mg的蝦青素。
56.權利要求48的生物活性食品復合物，其中所述油含有重量百分含量大于1％的ω-3脂肪酸、重量百分含量大于0.1％的二十碳五烯酸和重量百分含量大于0.1％的二十二碳六烯酸。
57.權利要求48的生物活性食品復合物，其中在添加所述的生物活性物質和粉狀營養物前將所述油加熱到25至40℃。
58.權利要求48的生物活性食品復合物，其中所述生物活性物質是選自細菌芽孢、細菌細胞壁、細菌細胞、酵母細胞壁、酵母抽提物、食用酵母、啤酒酵母、酵母細胞和藻類細胞的至少一種物質。
59.權利要求58的生物活性食品復合物，其中所述細菌細胞含有至少一種選自乳酸桿菌、桿菌、鏈球菌、雙歧桿菌、明串珠菌和交替單胞菌的細菌。
60.權利要求58的生物活性食品復合物，其中所述生物活性物質含有總濃度大于約1％重量百分含量的ω-3脂肪酸、總濃度大于約0.1％重量百分含量的二十碳五烯酸(EPA)和總濃度大于約0.1％重量百分含量的二十二碳六烯酸(DHA)。
61.權利要求58的生物活性食品復合物，其中所述藻類細胞含有至少一種選自包括但不限于鞭毛藻、Schizochytrium、杜氏藻、角毛藻、Tetraselmis、骨條藻、Nannochloropsis、海鏈藻、褐指藻、等鞭金藻、Pavlova的藻類細胞
62.權利要求48的生物活性食品復合物，其中所述第一種乳濁液的固相含有選自細菌物質、酵母物質、藻類物質、藥劑物質、動物蛋白產品、植物蛋白產品和禽蛋產品的固體物質
63.權利要求48的生物活性食品復合物，其中所述第一種乳濁液的固相含有選自細菌物質、酵母物質、藻類物質、藥劑、粉狀飼料的固體物質，其中所述細菌物質選自細菌芽孢、細菌細胞壁和細菌細胞；所述酵母物質選自酵母細胞壁、酵母抽提物、食用酵母、啤酒酵母、酵母細胞；所述藻類物質選自藻類細胞制品；所述粉狀飼料選自動物蛋白產品、植物蛋白產品、禽蛋產品、維生素B12、D-生物素、D-泛酸、葉酸、L-抗壞血酸-2-多磷酸脂、肌醇、煙酸、對氨基苯甲酸、鹽酸吡哆素、核黃素、氯代硫胺和氯化膽堿。
64.權利要求48的生物活性食品復合物，其中所述第一種乳濁液的固相含有選自乳酸桿菌、桿菌、鏈球菌、雙歧桿菌、明串珠菌和交替單胞菌的細菌物質。
65.權利要求64的生物活性食品復合物，其中所述細菌物質以占固相的0.1-95％的重量百分含量存在。
66.權利要求48的生物活性食品復合物，其中所述第一種乳濁液的固相含有重量百分含量約為0.1-50％的選自圓酵母和Phaffia的酵母物質。
67.權利要求66的生物活性食品復合物，其中所述酵母物質以占固相的0.1-50％的重量百分含量存在。
68.權利要求48的生物活性食品復合物，其中所述第一種乳濁液的固相含有選自鞭毛藻、Schizochytrium、杜氏藻、角毛藻、Tetraselmis、骨條藻、Nannochloropsis、海鏈藻、褐指藻、等鞭金藻和Pavlova的藻類物質。
69.權利要求67的生物活性食品復合物，其中所述以占固相的1-80％的重量百分含量存在。
70.權利要求68的生物活性食品復合物，其中所述第一種乳濁液的固相含有選自Sarafin，瑞吡司特和土霉素的抗生素。
71.權利要求69的生物活性食品復合物，其中所述抗生素以占固相的0.01-50％的重量百分含量存在。
72.權利要求62的生物活性食品復合物，其中所述第一種乳濁液的固相以占固相的0-95％的重量百分含量含有動物蛋白產品。
73.權利要求62的生物活性食品復合物，其中所述第一種乳濁液的固相以占固相的0-95％的重量百分含量含有植物蛋白產品。
74.權利要求62的生物活性食品復合物，其中所述第一種乳濁液的固相以占固相的0-25％的重量百分含量含有禽蛋產品。
75.權利要求62的生物活性食品復合物，其中所述第一種乳濁液的固相含有約40-60mg/kg的維生素B12；約5-20mg/kg的D-生物素；約250-350mg/kg的D-泛酸；約10-30mg/kg的葉酸；約1000-4000mg/kg的L-抗壞血酸-2-多磷酸脂(STAY-C，維生素C的穩定形式)；約3000-4000mg/kg的肌醇；約600-800mg/kg的煙酸；約350-450mg/kg的對氨基苯甲酸；約40-60mg/kg的鹽酸吡哆素；約125-175mg/kg的核黃素；約50-80mg/kg的氯代硫胺和約6500-7500mg/kg的氯化膽堿。
76.權利要求48的生物活性食品復合物，其中將較易碎的生物活性組分包埋在第二種乳濁液中。
77.權利要求76的生物活性食品復合物，其中所述較易碎的生物活性組分選自無脊椎生物胚胎和無脊椎生物。
78.權利要求76所述的生物活性食品復合物，其中所述較易碎的生物活性組分選自活的后生動物、冷凍的后生動物、凍干的后生動物、活的原生動物、冷凍的原生動物、凍干的原生動物、活的植物或動物組織、冷凍的動物或植物組織和凍干的植物或動物組織。
79.權利要求76的生物活性食品復合物，其中所述較易碎的生物活性組分選自枝角目動物的胚胎、幼體、新生兒和成年體。
80.權利要求76的生物活性食品復合物，其中所述較易碎的生物活性組分選自水蚤、輪蟲、去殼的Artemia cysts、線蟲、寡毛蟲、多毛蟲和昆蟲中的一種。
81.權利要求80的生物活性食品復合物，其中所述輪蟲是臂尾輪蟲。
82.用于飼養水生動物的生物活性食品復合物，該復合物含有第一種乳濁液(乳濁液-1)，為油包固體或固體包油的乳濁液，其生物活性物質和粉狀營養物形成固相而食用油形成油相，所述油選自魚油、精煉魚油和植物油，所述固體與油的重量比例在約0.01∶1至100∶1之間，優選0.1∶1至3∶1；和第二種乳濁液，含有分散在水膠體中的乳濁液-l，所述乳濁液-1分散在所述的第二種乳濁液中，所述水膠體聚合物作為連續相，所述水膠體聚合物離子交聯形成物理學穩定的基質，所述水膠體連續相包括分散的無脊椎生物。
83.權利要求82所述的生物活性食品復合物，其中所述油相選自鯡魚油、鮭魚油、鳳尾魚油、沙丁魚油、金槍魚油、鯖魚油、細鱗胡瓜魚油、魷魚油、綠鱈魚油、鱈魚油、食用魚油添加劑、大豆油、紅花油、玉米油和棕櫚仁油。
84.權利要求83的生物活性食品復合物，其中向油中加入至少一種選自卵磷脂、膽固醇、乳化劑、抗氧化劑、脂溶性維生素和蝦青素的物質。
85.權利要求82的生物活性食品復合物，其中構成所述油的混合物含有食用油、重量百分含量約為0.0001至50％的脂溶性生物活性化合物如抑制性呋喃酮、重量百分含量約為0.5至5％的乳化劑、重量百分含量約為1至10％的卵磷脂、重量百分含量約為1至10％的膽固醇和重量百分含量約為0.01至0.5％的抗氧化劑。
86.權利要求82的生物活性食品復合物，其中所述生物活性物質含有至少一種選自細菌芽孢、細菌細胞壁、細菌細胞、酵母細胞壁、酵母抽提物、食用酵母、啤酒酵母、酵母細胞和藻類細胞的物質。
87.權利要求86的生物活性食品復合物，其中所述細菌細胞含有至少一種選自乳酸桿菌、桿菌、鏈球菌、雙歧桿菌、明串珠菌和交替單胞菌的細菌。
88.權利要求86的生物活性食品復合物，其中所述生物活性物質含有總濃度大于約1％重量百分含量的ω-3脂肪酸、總濃度大于約0.1％重量百分含量的二十碳五烯酸(EPA)和總濃度大于約0.1％重量百分含量的二十二碳六烯酸(DHA)。
89.權利要求86的生物活性食品復合物，其中所述藻類細胞含有至少一種選自包括但不限于鞭毛藻、Schizochytrium、杜氏藻、角毛藻、Tetraselmis、骨條藻、Nannochloropsis、海鏈藻、褐指藻、等鞭金藻、Pavlova的藻類細胞。
90.權利要求82的生物活性食品復合物，其中所述第一種乳濁液的固相含有選自細菌物質、酵母物質、藻類物質、藥劑物質、動物蛋白產品、植物蛋白產品和禽蛋產品的固體物質。
91.權利要求82的生物活性食品復合物，其中所述第一種乳濁液的固相含有選自細菌物質、酵母物質、藻類物質、藥劑、粉狀飼料的固體物質，其中所述細菌物質選自細菌芽孢、細菌細胞壁和細菌細胞；所述酵母物質選自酵母細胞壁、酵母抽提物、食用酵母、啤酒酵母、酵母細胞；所述藻類物質選自藻類細胞制品；所述粉狀飼料選自動物蛋白產品、植物蛋白產品、禽蛋產品、維生素B12、D-生物素、D-泛酸、葉酸、L-抗壞血酸-2-多磷酸脂、肌醇、煙酸、對氨基苯甲酸、鹽酸吡哆素、核黃素、氯化硫胺和氯化膽堿。
92.權利要求91的生物活性食品復合物，其中水膠體連續相進一步含有分散的無脊椎生物。
全文摘要
本發明涉及生物活性食品復合產品，制備生物復合產品的方法以及利用益生菌和群體數量感受性(quorumsensing)抑制劑如抑制性呋喃酮和其它包含于生物活性食品復合物產品連續相和分散相中的生物活性化合物控制疾病的方法。所述產品含形成第一種乳濁液的油包固體或固體包油的乳濁液，該第一種乳濁液本身被聚合物乳化從而形成聚合物包油或聚合物包固體的乳濁液復合物。所述生物活性復合物由兩種乳濁液形成，其中第一種乳濁液作為分散相而水膠體聚合物作為連續相。然后第二種乳濁液復合物交聯形成物理學穩定的基質。然后，所述生物活性食品復合物或該生物活性食品復合物的第一種乳濁液將包括益生細菌和群體數量感知性抑制劑分子在內的不同生物活性組分傳遞到動物如蝦或魚或其它商業飼養的動物的消化道和環境中從而通過包括競爭性排除、直接抑制、消化致病細菌細胞間信號分子和直接抑致高絲氨酸內酯和(酰基)高絲氨酸內酯調控的過程在內的機制的新型組合機制有效地控制了細菌疾病。因此，通過所述新型組合地傳遞和應用益生細菌和群體數量感受抑制性呋喃酮實現對疾病的有效預防和控制。
文檔編號A23K1/16GK1454058SQ01812813
公開日2003年11月5日 申請日期2001年6月22日 優先權日2000年6月23日
發明者D·F·維拉馬, D·J·W·莫里亞蒂 申請人:阿夸比奧泰克有限責任公司