專利名稱：玉米草的雜交不親和性特征及其在玉米中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及玉米草雜交障礙特征。含有所述特征的植株具有雜交不親和性表型。本發明還涉及含有玉米草雜交障礙特征的新型雜交不親和植株，包括純種、雜種、單倍體、無性生殖和/或遺傳工程植株。含有本發明所述玉米草雜交障礙特征的雜交不親和植株能用于商業領域以防止這些植株與非所需植株系如遺傳工程植株發生非選擇性雜交。
玉米能通過自花授粉或異花授粉繁殖。在相同植株上玉米有分開的雄花序(稱為雄花穗)和雌花序(稱為雌花穗)。當風將花粉從雄花穗吹到從發育穗的頂部突出的玉米須上時，玉米就自然授粉。
大多數玉米產自雜交種子。雜交玉米種子的生產要求消除或滅活源自母本的花粉。花粉的不完全去除或滅活提供了潛在的自花授粉。這種自花授粉種子可能與雜交種子在無意中一起收割并包裝。現已開發出數種方法用于控制雄性生育力，并因此防止自花授粉。這些方法包括手工或機械去雄(通常稱為去穗)、細胞質雄性不育、遺傳雄性不育、殺配子劑等。
雜交玉米種子最常見通過手工或機械去雄生產。該方法操作如下。通常，將兩個純種玉米按壟交替種植在田地里，然后在花粉脫落前，將攜帶花粉的雄花穗從純種中去除以便用作雌性植株。只要與外源玉米花粉分開足夠的距離，去雄純種的穗只能與雄性純種受精，由此產生的種子為雜種。
去雄帶來的問題之一是費工費力(因而費用高)，而且有時還不可靠。一種去雄方法包含使用細胞質雄性不育(CMS)純種。細胞質雄性不育是由母體胞質內導致不育的因子控制的。細胞質雄性不育通過與能育花粉(即來自不是細胞質雄性不育的植株)受精能用于雌性再生。
另一去雄方法包含采用遺傳雄性不育。遺傳雄性不育是由導致不育以及抑制花藥和花粉正常發育的核因子控制的。遺傳雄性不育按孟德爾定律遺傳，其中不育等位基因(ms)對于花粉生育力(MS)等位基因是隱性的。有許多方法可賦與遺傳雄性不育。例如，美國專利4,654,465和4,727,219公開了在基因組內分開位置使用多個突變基因以便提供雄性不育。美國專利3,861,709和3,710,511描述了使用染色體易位產生遺傳雄性不育。其他方法包含將編碼與雄性組織特異啟動子相連的細胞毒性物質的基因或反義系統傳遞到植株中，在所述反義系統中，鑒定對生育力至關重要的基因并且將該基因的反義基因插入到植株中(參見EP329308和WO90/08828)。
另一去雄方法為應用某些稱為殺配子劑、花粉抑制劑或化學雜交劑的化學藥品。這些化學藥品能阻斷或殺死可生育花粉的形成并由此產生短暫的雄性不育。然而，有許多因素會影響這些化學藥品的用途，如化學藥品的費用、基因型的特異性以及使用時間。
玉米雜種的生產需要純合自交玉米系。純合自交系能通過譜系繁殖產生，其中將兩個玉米純種系雜交，各系擁有不同組別的所需特征。選擇含有目的特征的優良植株，然后自交多代以便使該系更加純種。這種不斷自交和選擇的方法持續5代或更多代。此繁殖的結果產生了遺傳上純合或純種的系。通常，采用這種方法純種系的發育周期至少需要5年甚至更長的時間。
當發育純種系時，一條更快或更完全達到同質性的途徑是通過使用單倍體植株。單倍體為只含有體細胞一半染色體數的植株，這些體細胞不是單倍體細胞。已知一些玉米植株可自發產生單倍體。例如，已知具有不定配子體(ig)基因的植株可生成單倍體。另外，已知‘原種6(Stock 6)’系(參見，Birchler，J.A.，“Practical Aspects of HaploidProduction”，The Maize Handbook，Freeling and Walbot(eds).pp.386-388(1996))具有生成單倍體的傾向。雜交中使用ig或‘原種6’將導致子代中產生一些單倍體植株。
或者，單倍體植株能采用本領域已知技術生成。一種這樣的技術為花藥培養。花藥培養是一種方法，通過該方法大量單倍體能直接從體外花藥中產生。一般而言，花藥培養包含從植株中分離不成熟的花藥，并將它們放到能誘導花藥內細胞的培養基上，通常其注定成為花粉粒，開始分裂并形成細胞培養物，從中能再生出單倍體植株。許多實施花藥的技術在本領域中是已知的，并公開在J.M.Dunwell，“Anther and Ovary Culture”，SWJ Bright和MGK Jones(編輯)，CerealTissue and Cell Culture，Martinus Nijhoff Publisher，1985，Dordrecht，第1-44頁以及美國專利5,306,864、5,322,789、5,445,961和5,602,310中。另一種能用于生成單倍體的方法是小孢子培養。除了使用小孢子而非花藥產生單倍體植株以外，小孢子培養與花藥培養類似(參見，Coumans等，Plant Cell Reports 7618-621(1989)；Pescitelli等，Plant CellReports，7673-676(1989))。花藥或小孢子培養的優勢在于這使得測試大量新突變和基因組合并從中篩選所需特征成為可能。
無論是自發獲得的單倍體還是從花藥或小孢子培養中獲得的單倍體都是不育的。為了彌補這種不育，可將單倍體的染色體數可加倍。有時染色體加倍能自然發生。但是，多數情況下必須使用藥劑才能實現染色體加倍。能產生染色體加倍的藥劑包括但不限于秋水仙堿或有絲分裂紡錘體抑制劑。染色體數的加倍導致完全能育和純種的雙單倍體植株。因為這些雙單倍體植株繁殖可靠，這使得用于選擇所需特征的方法更有效率。具有所需特征或特性的這些雙倍的單倍體植株能用在譜系繁殖中以生成商業上有價值的雜種。
有許多不同方法可用于將所需特征或特性導入靶玉米種質源中，不管這種玉米種質源是純種還是雜種植株。
一種方法中使用回交將所需特征或特性引入靶玉米種質源(稱回歸親本)中，方法是將該回歸親本和表達某些目的特征如但不限于疾病抗性、高產率潛力、良好莖強度、合理的耐旱性等的供體植株(非回歸親本)雜交。盡管供體植株優選純種，其也能是與回歸親本雜交可育的任意植株品種。然后將源自這種雜交的子代與回歸親本回交，鑒定具有所需特征的子代，并且重復此過程。與回歸親本回交并篩選所需特征的過程重復5代或更多代。由該法所產生的子代對于控制被轉移特征的基因座是純合的，除此之外與回歸親本相似。然后將最終的回交代自交，從而為被轉移基因提供純種子代。
第二種方法是利用無融合生殖將所需特征或特性導入靶玉米種質源中。無融合生殖包括無需有性生殖生產雜交種子。無融合生殖在一些植物中為自然繁殖方法，其導致后代遺傳上與母體植株相同(即克隆)，從而使得改進的雜種純種。這將使得農場主和資源缺乏(resource-poor)的農民重復播種他們自產的種子，但是此策略對當前作物如玉米所提供的雜交品種不實用。在此引作參考的美國專利5,710,367描述了具有兩個未鑒定基因的單性生殖玉米，所述基因據信控制卵的單性生殖發育，還描述了制作單性生殖玉米的某些方法。
第三種方法是利用遺傳工程將所需特征或特性導入靶玉米種質源中。遺傳工程是指基因從一個生物轉移到另一受體生物的復雜人工技術。農業上可利用遺傳工程創造新的含有來自其他生物基因的植物品種，這些基因給受體植株提供了改良特征，如但不限于改進的產量、顏色、高度、耐寒性以及昆蟲或疾病抗性。然而，人們對遺傳工程植株在田間大環境下種植生長仍有許多憂慮。美國的農業部、食品與醫藥管理局和環境保護機構都對遺傳工程生物包括遺傳工程植株的使用實行管制。
涉及遺傳工程或遺傳修飾(下簡稱“GM”)作物最大的問題之一包括GM作物可能污染非GM作物。具體而言，人們擔心包含在GM作物內的轉基因將通過花粉或種子傳播到鄰近生長著非GM作物的田地里，并給非GM作物授粉。這種所謂的“花粉污染”或“非選擇性雜交”給種植了非GM作物的農民增添了高額費用。已經努力采用作物間隔距離、作物輪種和管理實踐來減輕“花粉污染”問題。例如在美國，生產種子建議GM和非GM玉米田地的間隔距離為203.1米(約0.126英里)。自然屏障的存在可縮短這種間隔距離。
于是，對于異花授粉的植物如玉米很明顯需要一種辦法用于防止非選擇性雜交，尤其是與GM植株的非選擇性雜交。盡管時間調配差異和間隔距離對繁殖分離有益，但生理屏障通常足夠防止雜交，尤其是在以風授粉的物種中。一種可能防止非選擇性雜交的辦法是雜交不親和性。然而，與自交不親和性相反，雜交不親和性(下簡稱“CI”)在遺傳和生理上都沒有被清楚地定性。
在馴化玉米中，CI范圍在程度上從花粉種類中創造出優選物種一直到防止產籽。由于花粉作用的效率受到影響，帶來這些效果的基因稱為配子體因子(下簡稱“Ga”)(參見Nelson，O.E.，The MaizeHandbook，M.Freeling和V.，Walbot編輯，Springer-Verlag(1993))。僅賦予花粉基因型優選性的Ga因子是隱性的，其影響連鎖基因的傳送以及花粉在混合物中的競爭能力。涉及花粉和穗絲中對應等位基因之間識別的例子為Ga2、Ga4、Ga8以及包含Gal的某些組合。導致產籽失敗的不親和性與Gal的強等位基因一起出現，具體而言，當Gal-s Gal-s植株用gal gal授粉時，該雜交用于從其他玉米植株的花粉中分離出商用爆花玉米。作為分離體系，Gal-s是有缺點的，由于一些玉米品系攜帶gal-s或另一等位基因Gal-m，這使得它們與含有gal和Gal-s的品系雜交。在這些品系中，障礙不復存在。
因此，本領域需要遺傳和生理上清楚定性的玉米的雜交-不親和性體系，其可防止玉米植株與非所需花粉源的非選擇性雜交。
本發明進一步涉及表現TCB特征的雜交不親和玉米植株，其中所述TCB特征衍生自W22-TCB。這種雜交不親和玉米植株在其基因組內可進一步含有基因簇，其中所述基因簇位于4號染色體的短臂上，介于圖單位40-85之間。該基因簇在其基因組內包含(1)Tcb基因座；和/或(2)至少一個修飾基因。本發明的雜交不親和玉米植株可以是純種、雜種、單倍體、無性生殖和/或遺傳工程植株。
本發明進一步涉及獲取第一純種玉米植株的方法，當其與第二純種玉米植株雜交，產生雜交玉米種子，在植物生長條件下種植和生長后，生成表現出雜交不親和性的TCB特征的雜交玉米植株。該方法的第一步包括從一雜交不親和并具有TCB特征的玉米植株群體中篩選出第一供體親本玉米植株。第二步包括將選擇的供體第一親本玉米植株與第二親本玉米植株雜交。所述第二親本玉米植株優選含有在雜交組合中編碼所需特征的基因。此外，第二親本玉米植株可能是或可能不是雜交不親和的并且含有TCB特征。第三步包括收集得到的玉米種子。第四步包括在植物生長條件下種植和生長所得的種子。第五步包括篩選所得植株群體是否存在經過第一步鑒定的TCB特征。最后一步包括從含有TCB特征的所述群體中篩選具有雜交不親和性的植株，以便進一步雜交和篩選，直至獲得對TCB特征是純合的玉米系，從而以純種提供該特征用于雜交組合中。作為該方法結果而產生的含有TCB特征的雜交不親和純種玉米植株也包括在本發明中。
本發明進一步涉及生產含有TCB特征的雜交不親和雜交玉米植株的方法。該方法第一步包括將含有雜交不親和性TCB特征的雜交不親和純種玉米植株與第二玉米純種系雜交以產生分離植株群。第二玉米純種系優選含有編碼所需基因型特征的基因。此外，第二玉米純種系可能是或可能不是雜交不親和的并且含有TCB特征。該方法第二步包括收集所得的雜交玉米種子。本發明還涉及作為該方法結果而產生的含有TCB特征的雜交不親和雜交玉米植株。
本發明進一步涉及篩選用于生產純種玉米植株的第一供體親本玉米植株的方法，其中該純種玉米植株如果與第二純種玉米植株雜交，則產生雜交不親和的并且含有TCB特征的雜交玉米植株。該方法包括分析一玉米植株群體中是否存在含有TCB特征的各個植株的步驟。該方法可進一步包括分析所述玉米群體中各植株的DNA是否存在基因組內基因簇的步驟，其中所述基因簇位于4號染色體的短臂上，介于圖單位40-85之間。另外，對玉米植株群各植株的DNA可進一步分析(1)位于4號染色體短臂上距離sugaryl基因約6個圖單位和距離Gal基因約40個圖單位的Tcb基因座；和/或(2)至少一個修飾基因。本發明還涉及作為該方法結果而產生的含有TCB特征的雜交不親和第一供體親本玉米植株。
本發明進一步涉及篩選含有TCB特征的雜交不親和雜交玉米植株的方法。該方法包括分析一玉米植株群體中各植株是否具有TCB特征的步驟。該方法可進一步包括分析玉米植株群中各植株DNA是否存在基因組內基因簇的步驟，其中所述基因簇位于4號染色體的短臂上，介于圖單位40-85之間。另外，玉米植株群中各植株的DNA可用于進一步分析(1)位于4號染色體短臂上距離sugaryl基因約6個圖單位和距離Gal基因約40個圖單位的Tcb基因座；和/或(2)至少一個修飾基因。本發明還涉及作為該方法結果而產生的含有TCB特征的雜交不親和第一供體親本玉米植株。
本發明進一步涉及控制田地和/或人工氣候室或溫室中的玉米植株雜交的方法。該方法包括在田地和/或人工氣候室或溫室中種植含有上述TCB特征的雜交不親和玉米植株的步驟。
本發明進一步涉及控制田地中用于雜交種子生產的純種玉米植株雜交的方法。該方法包括在用于雜交種子生產的田地和/或人工氣候室或溫室中種植含有上述TCB特征的雜交不親和玉米植株的步驟。
本發明的其他目的、優點和特征從下列說明書并結合圖將變得明晰。
附圖簡述
圖1為染色體(連鎖)圖，表示Tcb相對于Zea mays中的4號染色體短臂上側翼基因的位置。
圖2A-2F表示雜交的玉米穗，該雜交旨在辨別W22回交子代中分離的玉米草衍生的不親和性基因。將玉米粒無色、純育的TCB株的花粉與賦予玉米粒顏色的gal tcbl花粉混合，然后置于測試株中植株的穗絲上(參見圖2A和2D)。將各測試植株的花粉用于同Gal-s穗絲(圖2B和2E)和Tcbl(圖2C和2F)穗絲的雜交。出現了兩種類型的植株。第一類植株顯示在圖2A-圖2F中，這些植株的穗絲對有色示蹤花粉不會辨別，而且這些植株的花粉在兩個測試株中均不可接受。這些植株缺少Gal和Tcbl。第二類植株顯示在圖2D-2F中，這些植株的穗絲對示蹤花粉不可接受，并且這些植株自己的花粉在Gal-s測試株上接受差，但在Tcbl的測試株上可接受。這些植株缺少Gal但攜帶Tcbl。
圖3A表示F1雜合基因型，給出了親本和重組類型I、II和III用于定位Tcb。圖3B表示4號染色體遺傳圖，指示在短臂鄰近的區域中相對于可見標記和分子標記的tcbl位置。著絲粒用實心圓指示。
圖4表示玉米草不親和性(“TIC”)表型和本發明TCB特征之間的差異。
圖5A-5B表示Tcbl和Gal花粉的競爭。圖5A表示gal tcbl花粉(有色玉米粒株)在與gal Tcbl(無色玉米粒株)競爭中獲得成功。將該兩個株源的花粉混合，然后放置到雌株的穗絲上，所有雌株都能賦予無色玉米粒。圖5B表示gal tcbl花粉(有色玉米粒株)在與Gal-stcbl(無色玉米粒株)競爭中獲得成功。將該兩個種源的花粉混合，然后放置到相同組別的雌株的穗絲上，所有雌株都能賦予無色玉米粒。
導言本發明涉及玉米草雜交障礙(“TCB”)特征。含有該特征的植株具有雜交不親和性表型。本發明還涉及含有玉米草雜交障礙特征的新型雜交不親和植株，包括純種、雜種、單倍體、無性生殖和/或遺傳工程植株。含有本發明所述玉米草雜交障礙特征的雜交不親和植株能用于商業領域以防止這些植株與非所需植株系如遺傳工程植株發生非選擇性雜交。定義本發明所提供的標題不是對本發明各方面或實施方案的限制，其應參照說明書全文內容。相應地，下文緊接著定義的術語參照說明書全文內容可被更充分限定。
如本發明所用，術語“等位基因”表示任何一種或多種形式的基因，所有等位基因涉及一種特征或特性。在二倍體細胞或生物中，給定基因的兩個等位基因在一對同源染色體上占據對應的基因座。
如本發明所用，術語“玉米”(對應于英文單詞corn)表示Zea maysL.的任意種類、栽培品種或種群。
如本發明所用，術語“雜交不親和性”指兩個植株或物種間不能雜交和/或異花授粉。
如本發明所用，術語“原種”表示具有某些優良特征的植株或品種，例如但不限于，高產量、良好的谷粒質量以及疾病抗性。
如本發明所用，術語“已表達序列標志”或“EST”表示為基因提供序列標志的cDNA克隆的部分基因序列數據。
如本發明所用，術語“基因簇”指含有能表達所需特征的遺傳物質(如但不限于一個或多個基因或等位基因)并經鑒定的染色體區域。
如本發明所用，術語“雜合的”表示當不同等位基因位于同源染色體上對應的基因座時存在的遺傳條件。
如本發明所用，術語“純合的”表示當相同等位基因位于同源染色體上對應的基因座時存在的遺傳條件。
如本發明所用，術語“雜種”表示任意兩個遺傳不相似的個體間雜交的后代(Rieger，R.，A.Michaelis和M.M.Green，1968，A Glossaryof Genetics and Cytogenetics，Springer-Verlag，N.Y.)。
如本發明所用，術語“雜交”指不同或不相似親本間后代的形成。
如本發明所用，術語“純種”表示基本上純合的個體或物種。
如本發明所用，術語“基因滲入”(對應于英文單詞introgressed或introgressing)表示將基因或基因簇從一種植株進入或導入到另一種植株中。
如本發明所用，術語“同功酶”表示酶的可檢測的變體，所述變體催化相同反應，但例如在一級結構和/或電泳遷移率上相互區別。
如本發明所用，術語“基因座”表示連鎖圖內或染色體上的位點，其是特定特征的基因的位置。任意一個基因的等位基因可在該位點出現。
如本發明所用，術語“玉米”(對應于英文單詞maize)表示Zeamays L.的任意種類、栽培品種或種群。
如本發明所用，術語“圖單位”表示染色體圖(連鎖圖)中距離的單位，通常測定值以厘摩表示。具體而言，圖單位是兩個連鎖基因對間的距離，其中1％減數分裂產物是重組的。
如本發明所用，“微衛星”或“簡單序列重復(SSR)”或“二核苷酸重復”或“三核苷酸重復”或“四核苷酸重復”皆指由二、三、四或五核苷酸單元串聯重復組成的DNA延伸。SSR區域可短到兩個重復單元，但更通常超過8-10個重復單元。簡單序列重復基本上在所有研究的真核生物基因組中常見，并在基因的多態性研究中已被確定為有用的工具。
如本發明所用，術語“修飾基因”是指影響另一基因表型表達的基因。
如本發明所用，術語“分子標記”包括但不限于擴增片段長度多態性(AFLP)、已表達序列標志(EST)、限制片段長度多態性(RFLP)、微衛星(也稱為“簡單序列重復”(SSR))、單核苷酸多態性(SNP)或限定具體基因和染色體位置的同功酶標記。
如本發明所用，術語“植物”或“植株”包括植物細胞、植物原生質體、玉米植株能從中再生的植物細胞組織培養、植物愈傷組織、植物塊以及在植物或部分植物中完整的植物細胞，如胚芽、花粉、胚珠、花、谷粒、穗、穗軸、葉、種子、外殼、莖、根、根尖、花藥、穗絲等。
如本發明所用，術語“群體”表示衍生自共同遺傳植株的雜合集合。
如本發明所用，術語“限制片段長度多態性”或“RFLP”表示個體間在由特定限制酶切割的DNA片段大小上的變化。導致RFLP的多態性序列在物理圖和遺傳連鎖圖上用作標記。
如本發明所用，術語“單核苷酸多態性”或“SNP”是指在超過1％的群體中發生的點突變。
如本發明所用，術語“變種”或“栽培品種”表示一組相似的植株，其結構特征和性能在相同種內可與其他變種區分開來。發明詳述本發明涉及對雜交不親和性的玉米草雜交障礙特征(“TCB特征”)。含有TCB特征的雜交不親和性玉米植株(1)當與缺乏TCB特征的玉米植株的花粉授粉后不能產籽，但與攜帶TCB特征的植株授粉后則能產籽(參見實施例2中的第1-120行)和/或(2)保持有功能花粉并且自身授粉后能產籽或導致其他玉米植株與所述植株授粉后產籽。本發明的TCB特征可基因滲入到不含有這種特征的玉米植株中(如純種、雜種、單倍體、無性生殖和/或遺傳工程植株)，為了產生新的含有TCB特征的雜交不親和玉米植株(參見實施例2)。
本發明的TCB特征由基因簇組成，所述基因簇顯性表達，位于4號染色體的短臂上(通常稱為“S”)，介于圖單位40-85之間(顯示在
圖1中)。優選基因簇位于4號染色體短臂上介于圖單位40-80之間(顯示在
圖1和圖3B中)。最優選基因簇位于4號染色體短臂上介于圖單位66-75之間(參見圖3B)。
該基因簇優選含有位于上述染色體位置內的基因座，并在本發明中稱作“玉米草雜交障礙”或“Tcb”基因座。Tcb基因座位于4S染色體上距離sugaryl標記約6個圖單位(或厘摩)，距離Gal標記約40圖單位(或厘摩)。Tcb基因座含有控制花粉和穗絲親和性的基因。由至少一個包含Tcb基因座的基因編碼的一種特性在本發明中被稱為“穗絲效應”作用。更具體地，含有Tcb并且用作雌性親本時表現出穗絲效應的雜交不親和玉米植株(或純合或雜合)，當用不表現雜交不親和TCB特征的玉米植株的花粉授粉后不產籽，如但不限于dent(gal)系和pop(Gal-s)系。對Tcb基因座雜合并且表現出穗絲作用的玉米植株，在與通過純合Gal-s穗絲拒絕gal花粉相似的水平上拒絕gal和Gal-s花粉。然而，含有Tcb基因座并且當用作雌性親本時表現出穗絲效應的雜交不親和玉米植株，當與不含有Tcb基因座以及不表現穗絲效應的其他玉米植株的花粉授粉后不產籽，如dent(gal)或pop(Gal-s)玉米系，含有Tcb基因座并且當用作雌性親本時表現出穗絲效應的雜交不親和玉米植株，當被含有Tcb基因座表現穗絲效應的玉米植株授粉后接受花粉并產籽。作為雌性親本對雜交障礙的Tcb特性和作為花粉親本克服障礙的能力一起遺傳，并且可能是Tcb基因座的相同或不同基因的功用。
由至少一個包含Tcb基因座的基因編碼的第二特性在本發明中被稱為“花粉效應”。更具體地，含有Tcb基因座并且當用作雄性親本時表現出花粉效應的玉米植株，保持有功能花粉并能自我生殖，并且可使某些其他玉米植株，如dent(gal)系受精。含有Tcb基因座并且表現出穗絲和花粉效應的雜交不親和玉米植株，(a)用作雌性親本時拒絕dent(gal)系的花粉；以及(b)用作雄性親本時可自我授粉，也能對dent(gal)系授粉。
盡管本發明優選含有TCB特征和Tcb基因座的雜交不親和玉米植株具有至少一個編碼穗絲和花粉效應作用的基因，含有TCB特征和Tcb基因座并具有至少一個僅編碼穗絲效應或花粉效應作用的基因的玉米植株也包括在本發明中。
除了Tcb基因座以外，本發明所述的基因簇還含有至少一個修飾基因，其修飾Tcb基因座的效果。至此，本發明人認為至少一個修飾Tcb基因座效應的修飾基因位于Gall標記的方向距離Tcb基因座約6.5個圖單位或厘摩(參見
圖1)。其他修飾Tcb基因座的效果并位于(1)該基因簇內；(2)4號染色體上該基因簇的外邊；和/或(3)除了4號染色體外的一個或多個染色體上的修飾基因也在本發明預期內。此外，本發明所述的基因簇也可含有其他基因，因此這些基因也在本發明的預期范圍內。
現有技術具體為Kermicle，J.L.等，Maydica 35399-408(1990)與本發明的區別在于所述現有技術討論的是稱為玉米草不親和性或“TIC”的表型。而TIC表型與TCB特征是不同的。如圖4所顯示，Kermicle等中所討論的TIC表型包括TIC-CP1(Gal-m)(其與花粉效應作用Tcb相關)、TIC-CP2以及一些未定義的功能。TIC-CP2是TIC丟失花粉排斥的雌性功能后的稀缺變體。含有TIC-CP2的玉米植株用作雄性親本時，能夠給含有TIC和dent(gal)但不是pop(Gal-s)系的玉米植株授粉。相反，本發明涉及TCB特征。本發明的TCB特征包括Tcb基因座和一個或多個修飾Tcb基因座效果的修飾基因。本發明的Tcb基因座含有至少一個編碼穗絲效應和/或花粉效應作用的基因。在Kermicle等中一般性涉及的未定義的功能已經被本發明人發現，其涉及TCB特征并包含一個或多個修飾基因和至少一個編碼穗絲效應作用的基因。
含有雜交不親和性的TCB特征的玉米原種的例子是dent純種W22-TCB。雜交不親和純種W22-TCB含有本發明所述的基因簇。更具體地，該基因簇含有Tcb基因座、至少一個編碼穗絲和花粉效應作用的基因以及至少一個對Tcb基因座的修飾基因。另外，W22-TCB還含有TIC-CP1。2500個純種系W22-TCB種子已于2000年3月30日保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)，10801 University Blvd.，Manassas，Virginia，20110-2209，保藏編號PTA-1601。該保藏是按照布達佩斯條約要求做的。保藏期限為自保藏日起30年，或保藏中心自最后一次請求保藏后5年，或該申請授權成為美國專利后的有效期期間，無論怎樣期限會更長。這些種子將更新以免在保藏中心失活。
本發明進一步預期來自dent純種W22-TCB的TCB特征在雜交中的應用，以便開發出新的含有雜交不親和TCB特征和商業上所需特性的純種和雜種植株。采用本領域中公知的植物育種和分子生物學技術，能開發出這樣一些新的純種和雜種植株。例如，純種W22-TCB能用于新建雜交不親和的并含有TCB特征的第一純種dent系。含有TCB特征的該第一純種dent系能與第二純種dent系雜交以創造出合乎商業要求特征的雜交不親和dent雜種。此外，W22-TCB以及從其衍生的雜種能用于花藥組織的培養以創造出單倍體和雙倍體植株以及單性生殖玉米植株。另外，本發明進一步預期新型玉米雜交不親和的含有TCB特征的純種、雜種、單倍體、單性生殖和/或遺傳工程植株，其中TCB特征衍生自W22-TCB。
分子生物學技術能用于鑒定含有TCB特征的植株。例如，分子標記可用于鑒定本發明所述的基因簇。任何可用于鑒定與TCB特征有關的基因簇的分子標記預期在本發明保護范圍內。例如，介于
圖1所顯示的phi021和nc005之間包括這二者的標記以及介于圖3B中所顯示的umc1117和bnlg490之間包括這二者，尤其是mmc0471的標記都可用于鑒定基因簇。因此，在本發明所述保藏的dent純種W22-TCB和分子標記之間，含有本發明所述TCB特征和基因簇的其他來源的遺傳材料當然可以為本發明當前采用本領域公知的常規技術所能允許鑒定的這種材料。更具體而言，采用本領域中公知技術，本發明所述的TCB特征和基因簇可用于鑒定其他異花授粉的單子葉和雙子葉植物中所述TCB特征或類似特征以及類似基因、基因簇和/或分子標記，如但不限于油菜籽和黑麥。對和本發明所述在玉米中雜交不親和性體系相似的方式發揮作用的同源雜交不親和性體系的鑒定在油菜籽中特別重要。油菜籽為異花授粉物種(油菜籽含有自交不親和性體系可防止自花授粉)。遺憾地是，已知本領域報道了非GM油菜籽物種被GM油菜籽物種中轉基因所污染。與本發明所述雜交不親和玉米植株功用相似的雜交不親和的油菜籽的開發可有益于防止GM油菜籽物種造成非所需的和非選擇性的油菜籽雜交。
本發明所述的TCB特征采用本領域公知的植物育種技術可基因滲入到玉米植株中。具體而言，表現本發明TCB特征的玉米植株可作為花粉親本與含有編碼合乎商業要求的特征基因的其他供體玉米植株雜交以便新建含有上述TCB特征的雜交不親和的純種、雜種、單倍體、單性生殖和/或遺傳工程玉米植株。在其基因組內含有TCB特征的雜交不親和純種玉米系，當與第二純種玉米系雜交時，可產生雜交不親和的并具有TCB特征的雜種玉米植株。通過從一雜交不親和的并含有TCB特征的玉米植株群體中篩選第一供體親本玉米植株，可開發出這些雜交不親和的純種玉米植株。當含有TCB特征的合適供體親本玉米植株鑒定后，其與第二供體親本玉米植株雜交。第二供體親本植株可以是或不是雜交不親和的并且其含有TCB特征。此外，第二供體親本玉米植株在雜交組合中優選含有編碼合乎商業特征的基因。這些合乎商業的特征包括但不限于昆蟲抗性(如但不限于對蜘蛛(對應于英文單詞mite)、蚜蟲、甲蟲以及蜘蛛(對應于英文單詞spider)等的抗性)、線蟲抗性(如但不限于對粘蟲(Fall Armyworm)和食蟲(WesternRootworm)等的抗性)、疾病抗性(如但不限于對Northern葉枯病、Southern葉枯病、銹病、Stewart枯萎病、玉米壞死病(Corn LethalNecrosis)、絲黑穗病、玉米枯黃病矮小病毒、玉米枯黃病斑駁病毒、玉米矮小花葉病毒等的抗性)等。將所得的種子收集、種植并生長在植物生長條件下。然后從得到的植株群中篩選出那些含有上述TCB特征的植株。將這些植株篩選出來在自花授粉或近緣授粉條件下進一步雜交，直到獲得對TCB特征純合的純種系。然后把該雜交不親和的純種玉米系用于自交、回交、雜種生產、群體雜交等。
例如，含有合乎商業特征的純種玉米系(回歸親本)能與基因組內攜帶本發明所述的TCB特征的供體純種(非回歸親本)雜交。然后將該雜交的子代與回歸親本反向交配。從所得子代中篩選那些從非回歸親本中轉入了雜交不親和性的TCB特征的植株。在與回歸親本進行了3代，優選4代，或更優選5代或更多代選擇雜交不親和性的回交后，所述子代對于控制雜交不親和性的TCB特征的基因座將是雜合的，但是其大多數或幾乎所有其他基因將類似于回歸親本。
各種以實驗室為基礎的技術，如標記輔助的選擇以及本領域中其他已知技術，可用于回交以鑒定與回歸親本具有最高遺傳一致性程度的子代。這使得可以生產和鑒定與回歸親本具有至少90％，優選95％和更優選至少99％的遺傳一致性的純種玉米系。
本發明所述的雜交不親和的純種玉米系可用于額外的雜交以新建雜交不親和雜種植株。例如在其基因組中含有TCB特征的第一雜交不親和的純種玉米植株可作為花粉親本與第二純種玉米系雜交。優選地，第二純種玉米系擁有合乎商業特征，如但不限于昆蟲抗性(如但不限于對蜘蛛(對應于英文單詞mite)、蚜蟲、甲蟲以及蜘蛛(對應于英文單詞spider)等的抗性)、線蟲抗性(如但不限于對粘蟲(FallArmyworm)和食蟲(Western Rootworm)等的抗性)、疾病抗性(如但不限于對Northern葉枯病、Southern葉枯病、銹病、Stewart枯萎病、玉米壞死病(Corn Lethal Necrosis)、絲黑穗病、玉米枯黃病矮小病毒、玉米枯黃病斑駁病毒、玉米矮小花葉病毒等的抗性)等。此外，該第二純種玉米系可以含有或不含有對雜交不親和性的TCB特征。將所得的種子收集、種植并生長在植物生長條件下。然后從得到的植株群中篩選出含有對雜交不親和性的TCB特征的雜種植株。然后篩選出表現TCB特征的雜交不親和性雜種植株。
含有本發明所述TCB特征的雜交不親和的玉米植株為開發新純種或雜種玉米植株目的，可在田地和/或人工氣候室或溫室中用于控制雜交。具體而言，本發明的雜交不親和玉米植株可種植在田地和/或人工氣候室或溫室中，并用于創造新的含有某些合乎商業特征的純種和雜種玉米植株，而無需擔心這些玉米植株將被非所需玉米種源(如GM玉米植株)的花粉非選擇性雜交和污染，所述非所需玉米種源位于同一田地中或位于相鄰的田地中，或位于同一人工氣候室或溫室中。例如，在基因組內含有本發明所述TCB特征的雜交不親和的純種玉米植株可種植在用于自交種子生產的田地和/或人工氣候室或溫室中。這些雜交不親和的純種玉米植株可種植在含有GM玉米植株的同一或鄰近的田地，或同一人工氣候室或溫室中。然后將這些雜交不親和的玉米植株雜交以產生雜交種子。由于所述純種玉米植株是雜交不親和的，它們將不會被任何源自GM玉米植株的花粉致育。相反，這些植株將僅被源自含有本發明所述的TCB的雜交不親和的玉米植株的花粉致育。
以實施例方式而不是限制，本發明將給出下列實施例。實施例1玉米草雜交障礙基因座的鑒定和特征表1不親和性原種原種 不親和性基因源 區別特征gal tcbl dent玉米純種W22可接受所有花粉；不能致育Gal-s/Gal-s或TCB/-Gal-s tcbl白云爆花玉米(White 純合不接受但雜合以不同程Cloud Popcorn)雜種 度可接受gal花粉；不能致育TCB/-Gal-m tcbl中心高原玉米草48703可接受所有花粉；能致育(Central Plateau teosinte Gal-s/Gal-s但不能致育48703) TCB/-TCB單元型中心高原玉米草48703 TCB/-不接受tcbl；致育所有雌蕊基因型。TCB/TCB自交不親和性弱。
gal Tcbl 中心高原玉米草48703 Tcbl/-依據修飾基因構成不接受或部分接受tcbl；不能致育Gal-s/Gal-s
為了使遺傳背景標準化，將目的基因通過回交插入到中西部美國(Midwestern US)dent純種W22，其缺少已知的不親和性因子(galtcbl)。Gal-s配對系的開發首先由W22與白云雜種爆花用玉米雜交，然后自花授粉前將含有子代的Gal-s回交W22 5代以建立純合譜系。首先通過與如所提供的各種gal tcbl原種雜交5代，然后繼續與W22雜交，將中心高原玉米草集合48703的不親和性基因(Wilkes，“Teosintethe closest relative of maize.”The Bussey Institute of Harvard University，Cambridge，MA(1967))轉移到玉米中。篩選導致多因子單元型指定的TCB的強不親和性，在與W22雜交3代后為常規用途建立Tcbl試驗對象。在進行額外的回交代后從TIC中分離出Gal-m tcbl和gal Tcbl(在Kermicle等，Maydica 35399-408(1990)的表3中分別鑒定為B類和C類)。在將TCB摻入到純種W22背景前，采用衍生的原種進行實驗，包括首先用gal tcbl授粉，一天后用植株自己的花粉授粉。實施例1b繪制Tcbl遺傳圖將Tcbl的Tassel seed 5(Ts5)與4號染色體測試對象原種淡綠色17(vl7)、棕色中脈3(bm3)和含糖1(sul)(Maize Genetics CooperationStock Center)雜交，F1與隱性測試對象回交產生5點測交群體，用于對Tcbl相對于4個可見標記進行這位。由于降低的存活率和在含糖(sugary)類型內劃分淡綠色秧苗表型的困難，僅確定了非含糖谷粒類型的特征。將非含糖谷粒樣本田間播種，按表型類型分成vl7、bm3和ts5以鑒定交換體類型，然后與TCB/sul互相雜交以測定Tcbltcbl組成。額外的vl7-Su交換個體在溫室中種植鑒定為淡綠色秧苗，然后對田間移栽株根據成熟植株表型分類，確定為Tcbltcbl。從子代中建立5個vl7-Sul交換體，其中淡綠色表達為不完全外顯，因而不能測定有效的群體大小。在研究的遺留3個子代中，有15個vl7-Sul交換體存在于237個植株中，或6.3±1.6％，與前報道7.6±1.3％(Stinard，Maize Gen.Coop.Newsletter 7279(1998))比較。實施例lc簡單序列重復分析依據MaizeDB中的數據選擇已知或被懷疑定位于4號染色體短臂上的簡單序列重復(SSR)。采用Dellaporta在“Plant DNA miniprepand microprepversion 2.1-2.3”，The Maize Handbook，Freeling andWalbot(eds.)第522-525頁(1994)中所述的方案從樣品中抽提DNA。在PTC-200 Thermal Cycler(MJ Research)上進行PCR反應。擴增條件與Senior等Crop Sci，381088-1098(1998)中所述的“touchdown”方案(profile)除了用連續4℃循環終止前，最后循環重復30次而非20次以外均相同。將15μl反應混合液組成為各引物3 pmol、2.5mMMgCl2、各dNTP 100μM、10mM Tris pH 9、50mM KCl、0.1％TritonX-100、1mg/ml純化BSA(New England Biolabs)、0.6單位Taq DNA聚合酶(Promega)以及約30ng模板DNA。擴增完成后，每個樣品中加入3μl的加樣染料(30％甘油、0.25％溴酚藍和0.25％二甲苯腈藍)，各混合液取6μl在4％Metaphor(FMC Bioproducts)瓊脂糖凝膠上1×TBE中電泳(Sambrook等，Moleucular cloningA LaboratoryManual.Cold Spring Harbor Lab Press，New York 1989)。電泳后，將凝膠在0.5μg/ml的溴化乙啶中染色并在UV透射儀上測定。等位基因構成首先確定為vl7 bm3 sul多測試對象以及對所有SSR標記的Ts5Tcbl原種。然后對那些在兩親本型之間具有可檢測的多態性的片段，檢測Ts5和sul之間的重組體。
表2根據由Ts5 V17 Bm3 Sul(Tcbl)/ts5 vl7 bm3 sul(tcbl)雜合子與ts5 vl7 bm3 sul雌株的雜交所產生的測交群體，玉米草雜交障礙1(Tcbl)相對于4個可見標記在玉米染色體臂4S上的位置。對從非含糖谷粒生長的重組子代通過與TCB Sul/+sul的相互雜交以及與純合sul的雜交評價Tcbl重組類型植株數 以重組類型 以重組類型 在與sul/sul雌 Tcbltcbl作為雄株產 作為雌株含 株(植株數)構成籽率％ 糖谷粒％ 雜交株中的含糖谷粒％I.ts5-Vl7 6 70.8 3.8-21.9 54.5(4)TcblII.vl7-Bm3組A 4 66.3 4.2-19.2 57.8(3)Tcbl組B 5 0.0a28.1-35.350.3(4)tcblIII.bm3-Sul 11 0.0b24.9-34.050.5(7)tcbl
a0谷粒b共8谷粒根據單交換體類型歸納了回交數據，未發現多交換體。ts5和vl7重組的6個植株樣品(參見圖3A的區域I)保留了所有三個Tcbl特征。相反，11個bm3-Sul交換體(區域III)未保留任何特征。9個vl7-Bm3交換體(區域II)分成兩類4個保留所有Tcbl特征，而5個未保留任何特征。通常，3個特征的共分離定義了玉米草雜交障礙1基因座。大約在vl7和bm3中間，其在Neuffer等，Mutants ofMaize，Cold SpringHarbor Lab Press，New York(1997)的1995玉米遺傳圖上繪至于位置74(參見圖3B)。
多重測試株和Ts5 Tcbl親本之間多態性的簡單序列重復(SSR)標記對重組體在4個介于由可見標記及tcbl所定義的Ts5和Sul之間的區域中進行追溯測試(參見圖3B)。該數據將umc1117和phi074放置在Tcbl遠端、介于vl7和Ts5之間，將bnlg490放置于Tcbl和bm3中靠近Tcbl的位置，以及將nc005和bnlg1937放置于bm3和Sul之間，該群體中mmc0471未從Tcbl中分離。
上述連鎖研究中Tcbl/tcbl植株對tcbl花粉的排除是可變的。Ts5Tcbl親本類型的9個回交植株產自1.5-15.3％含糖谷粒而非孟德爾預期的25％。相似地，6個ts5-V17交換植株范圍為3.8-21.9％含糖。相比較而言，正反交中的范圍只有1.1-3.8％，例如，當將交換植株的花粉放到TCB Sul/+sul雌株上。這種較低值與將TCB Sul/+sul雄株的花粉放置到TCB Sul/+sul雌株上的情況下sul谷粒的范圍相同。考慮到介于tcbl和sul基因座之間有6％的重組，后者的結果與完全排除tcbl花粉一致。當回交植株為雌株時，對所觀察到的Tcbl衰減的類似解釋為一個或多個修飾基因在TCB的Ts5 Tcbl原種發育過程中丟失或者Ts5自身衰減了Tcbl作用。
第二衰減的Tcbl株在TCB重復與純種W22回交后鑒定。比較該衍生的Tcbl株與TCB/+和Gal-s/-基因型用gal tcbl風吹授粉后防止產籽的能力。在該測試條件下，Gal-s/Gal-s植株基本上不育，甚至Gal-s/gal雜合子的產籽率低于0.1％。47個TCB/+植株上沒有一個谷粒產籽。相反，在衰減Tcbl純合子中獲得了32％的產籽率，在雜合子中獲得了43％的產籽率。該結果顯示純種W22攜帶一個或多個修飾基因，這些基因降低了Tcbl在排斥Tcbl花粉中的有效性。
表3Galgal和Tcbltcbl構成不同的植株的平均產籽率。
允許用gal tcbl對去穗植株進行風吹授粉。
雌性親本基因型 植株數目 平均產籽率(％)gal tcbl/gal tcbl 71 98.3Gal-s tcbl/Gal-s tcbl 43 0.0aGal-s tcbl/gal tcbl 45 0.1gal Tcbl/gall Tcbl 42 31.9gal Tcbl/gal tcbl 45 42.9TCB/+ 47 0.0ba共2個谷粒b0個谷粒Tcbl與一起存在于TIC單元型中的Gal-m分離，提供適用于測試Gal-s和Tcbl不親和性體系之間相互作用的材料。為此目的，將galTcbl或Gal-s tcbl花粉與gal Tcbl混合，并施用到各種不親和性基因型的穗絲上。所用的gal tcbl株賦予有色谷粒，其他株則無色。因此，gal tcbl花粉可充當示蹤劑以測定各種雌性親本如何有效地辨別含有gal tcbl和Gal-s或Tcbl的花粉。
正如根據TCB與gal tcbl混合物所預期，gal Tcbl與gal tcbl花粉混合物在含有Tcbl穗親本上基本上生產全部產籽的谷粒(圖2D)。TCB/+雌株幾乎全部可辨別gal tcbl花粉，而衰減Tcbl純合子和雜合子(兩者皆純合的gal)有色谷粒平均大約20％，與親和的gal tcbl植株一樣多。(參見實施例1a校正混合物中兩類活花粉的比例。)Gal-m tcbl/gal Tcbl采用衰減的Tcbl基因型而非TCB/+基因型加倍了雜合子曲線的斜率。因此，TCB的強障礙不是由于Tcbl與Gal-m的如此組合，而是由于其他因子的增強。采用這種混合物授粉的純合Gal-s tcbl植株基本上是不育的。但是，與gal或Gal-m(兩者皆為純合tcbl)雜合的Gal-s植株部分產籽。其中只有完全親和的gal tcbl約一半的有色谷粒，這表明Tcbl的Gal-sl-雌蕊對tcbl花粉具有決定性的優先權。
Gal-s tcb與gal tcb花粉的混合物(圖5B)在Gal-s純合子和雜合子(都是tcbl/tcbl)產籽良好，幾乎完全辨別gal Tcbl花粉，這也在預料之中。用該混合物授粉的TCB/+雌株幾乎不育，而衰減的Tcbl/tcbl雜合子產穗基本良好。衰減Tcbl原種的純合或Gal-m的加入都不會導致不親和性的水平接近TCB/+的水平。Tcb/-雌株相對于galtcbl存在較少部分的有色谷粒，這再次表明在兩個不親和體系之間存在部分雜交識別。
Tcbl能在授粉前或后被表達。如果后合子，產籽率降低應伴隨變形的分離情況，如TCB/sul雜合子的F2群體中缺少含糖谷粒。在該情況下未觀察到產籽率下降，提供了反對后合子機理的證據。
然而可以想像地是，其他類型雜交后所觀察到的不育能反映后合子的致死率。為證明這種可能性，分離雜合TCB的回交子代中10個植株和標準tcbl/tcbl植株連續數天授粉。第一天施用顏色標記的galtcbl，第二天接著施用植株自己的花粉。6個產生全穗的植株多數為有色谷粒，這表明與gal具有親和性。4個植株產生大多數無色或僅產生無色以及弱有色的谷粒，其是TCB/+親本的特征，這表明盡管采用不親和的gal tcbl預先授粉，胚珠仍保持存活。實施例1fTcb作用的主要修飾基因的定位為了確定與tcb連鎖的任何修飾基因，將具有強Tcb作用的Gal-m Tcbl Sul株與gal Tcbl sul雜交兩次。在62個攜帶Tcbl的子代株中，當自花授粉時，除了4個以外全部生成7.0％或更少的含糖谷粒，這表明強Tcbl作用。剩余的4個穗攜帶了9.8-19.6％含糖，這表明位置距離Tcb大約6.5厘摩的修飾基因丟失。4個中有3個從gal tcbl sul親本中獲得gal，其修飾基因位于鄰近Tcbl，朝向gal的位置。當Ts5與Tcbl重組后該修飾基因明顯去除，從而生成用于繪制Tcbl遺傳圖的Ts5/Tcbl測試染色體。其缺少解釋了在所得原種中Tcbl作用的衰減，并且與表3中所報道的W22大量回交的植株同樣如此。實施例2玉米草雜交障礙特征轉移到商用原種雜種和純合系中表現TCB特征的玉米植株通過排斥花粉可防止與某些遺傳測試株原種雜交。該雜交障礙能用作從被非所需花粉源的污染中分離出含有TCB特征的品種。為了測試TCB能否防止被商用原種雜種和純合系授粉，在位于夏威夷群島的莫洛凱島上1999/2000冬季進行了雜交實驗。
如以下表4所示，將87個不同商用和測試雜種植株的花粉(參見1-110行)放置在dent純合W22-TCB雜合株的穗絲上。在對每個到此為止所能檢測到的雜種的一次嘗試性雜交中，74個潛在的穗不含谷粒，5個穗有一個谷粒，6個穗有二個谷粒，以及2個穗有3個谷粒。平行實驗中，將代表21個純合體系植株的花粉放置到W22-TCB純合株(含有Tcb基因座和至少一個編碼穗絲和花粉效應作用的基因，以及在兩種染色體中對Tcb基因座的修飾基因)中。該數據顯示玉米雜交障礙可有效地防止被商用原種純種和雜種雜交。
表4
1行號＝種植順序。
2選擇說明＝說明植株是否用作雄株或雌株。
3入號＝公司對雜種或純種的標號。
4授粉源 ＝采集雄性花粉的行號。
5谷粒數 ＝相互測試雜交穗上授粉的谷粒數。
6#植株號 ＝植株直立計數號。
7開花數據-雌株＝月中穗絲表達的天數，其中穗在穗中央有50％長大約3英寸。
8開花數據-雄株＝月中花粉表達的天數，其中雌蕊在穗中央有50％長大約3英寸。
9來源＝提供種子的個人和/或公司。
10nk ＝無谷粒11k ＝谷粒數12v.v. ＝胎生
＝授粉失敗所有文獻在此引作參考。
本發明通過以上描述和實施例進行了說明。對本領域那些專業技術人員來說，由于許多變化是明顯的，所以以上說明旨在非限制性描述。因此，所有這些變化都包括在本發明權利要求書保護的范圍和實質內。
針對在此所述的本發明方法的組成、操作和排列，在不背離如本發明權利要求所限定的內容和范圍的情況下，能作出許多變化。
權利要求
1.含有TCB特征的雜交不親和的玉米植株。
2.權利要求1的雜交不親和植株，其中所述植株被缺少TCB特征的植株授粉后不能產籽，但被攜帶TCB特征的植株授粉后能產籽。
3.權利要求1或2的雜交不親和植株，其中所述植株保持有功能花粉并且被自己授粉后能產籽，或者被所述植株授粉后導致其他玉米植株產籽。
4.權利要求1的雜交不親和玉米植株，其中所述玉米植株為純種植株。
5.權利要求1的雜交不親和玉米植株，其中所述玉米植株為雜種植株。
6.權利要求1的雜交不親和玉米植株，其中所述玉米植株為單倍體植株。
7.權利要求1的雜交不親和玉米植株，其中所述玉米植株為無性生殖玉米植株。
8.權利要求1、4、5、6或7的雜交不親和玉米植株，其中所述植株為遺傳工程植株。
9.權利要求9的雜交不親和玉米植株，在其基因組內進一步包含基因簇，其中所述基因簇位于4號染色體短臂上，介于圖單位40-85之間。
10.權利要求9的雜交不親和玉米植株，在其基因組內進一步包含Tcb基因座。
11.權利要求10的雜交不親和玉米植株，其中所述Tcb基因座位于4號染色體的短臂上，距離sugaryl基因約6個圖單位，以及距離Gal基因約40個圖單位。
12.權利要求10的雜交不親和玉米植株，其中所述Tcb基因座包含至少一個在所述植株中編碼穗絲效應作用的基因。
13.權利要求10或12的雜交不親和玉米植株，其中所述Tcb基因座包含至少一個在所述植株中編碼花粉效應作用的基因。
14.權利要求9、10、12或13的雜交不親和玉米植株，在其基因組內進一步包含至少一個修飾基因。
15.雜交不親和玉米植株，其包含TCB特征并且(1)被缺少TCB特征的植株授粉后不產籽，而被攜帶TCB特征的植株授粉后產籽；和(2)其保持有功能花粉并且被自己授粉后產籽或者被所述植株授粉后導致其他玉米植株產籽。
16.權利要求15的雜交不親和玉米植株，其中所述玉米植株為純種植株。
17.權利要求15的雜交不親和玉米植株，其中所述玉米植株為雜種植株。
18.權利要求15的雜交不親和玉米植株，其中所述玉米植株為單倍體植株。
19.權利要求15的雜交不親和玉米植株，其中所述玉米植株為無性繁殖玉米植株。
20.權利要求15、16、17、18或19的雜交不親和玉米植株，其中所述植株為遺傳工程植株。
21.權利要求15的雜交不親和玉米植株，在其基因組內進一步包含基因簇，其中所述基因簇位于4號染色體的短臂上，介于圖單位40-85之間。
22.權利要求21的雜交不親和玉米植株，在其基因組內進一步包含Tcb基因座。
23.權利要求22的雜交不親和玉米植株，其中所述Tcb基因座位于4號染色體的短臂上，距離sugaryl基因約6個圖單位，以及距離Gal基因大約40個圖單位。
24.權利要求22的雜交不親和玉米植株，其中所述Tcb基因座包含至少一個在所述植株中編碼穗絲效應作用的基因。
25.權利要求22或24的雜交不親和玉米植株，其中所述Tcb基因座包含至少一個在所述植株中編碼花粉效應作用的基因。
26.權利要求21、22、24或25的雜交不親和玉米植株，在其基因組內進一步包含至少一個修飾基因。
27.雜交不親和玉米植株，其包含TCB特征并且其中所述TCB特征衍生自保藏號為ATCC PTA-1601的植株W22-TCB。
28.權利要求27的雜交不親和玉米植株，在其基因組內進一步包含基因簇，其中所述基因簇位于4號染色體的短臂上，介于圖單位40-85之間。
29.權利要求28的雜交不親和玉米植株，在其基因組內進一步包含Tcb基因座。
30.權利要求29的雜交不親和玉米植株，其中所述Tcb基因座位于4號染色體的短臂上，距離sugaryl基因約6個圖單位，以及距離Gal基因大約40個圖單位。
31.權利要求29的雜交不親和玉米植株，其中所述Tcb基因座包含至少一個在所述植株中編碼穗絲效應作用的基因。
32.權利要求29或31的雜交不親和玉米植株，其中所述Tcb基因座包含至少一個在所述植中編碼花粉效應作用的基因。
33.權利要求28、29、31或32的雜交不親和玉米植株，在其基因組內進一步包含至少一個修飾基因。
34.權利要求27的雜交不親和玉米植株，其中所述玉米植株為純種植株。
35.權利要求27的雜交不親和玉米植株，其中所述玉米植株為雜種植株。
36.權利要求27的雜交不親和玉米植株，其中所述玉米植株為單倍體植株。
37.權利要求27的雜交不親和玉米植株，其中所述玉米植株為無性生殖玉米植株。
38.權利要求34、35、36或37的雜交不親和玉米植株，其中所述植株為遺傳工程植株。
39.獲得純種玉米植株的方法，當所獲純種玉米植株與第二純種玉米植株雜交后，產生雜交不親和并含有TCB特征的雜種玉米植株，該方法包含下列步驟(a)從一玉米植株群體中篩選第一供體親本植株，其中所述第一供體親本植株是雜交不親和的并含有TCB特征；(b)用含有有雜種組合中編碼所需特征基因的第二親本玉米植株與所篩選出的第一供體親本玉米植株雜交；(c)從步驟b)得到的雜交株中收集種子；(d)在植株生長條件下將步驟c)中收集的種子種植并生長；(e)篩選出具有步驟(a)中所鑒定的TCB特征的所得植株群體；以及(f)從具有雜交不親和性的TCB特征的所述群體中篩選植株，用于進一步雜交和篩選，直至獲得對雜交不親和性的TCB特征純合的系，從而提供這種純種特征用于雜種組合中。
40.權利要求39的方法，其中第一供體親本玉米植株在其基因組內進一步包含基因簇，其中所述基因簇位于4號染色體的短臂上，介于圖單位40-85之間。
41.權利要求40的方法，其中第一供體親本玉米植株進一步包括Tcb基因座。
42.權利要求41的方法，其中所述Tcb基因座位于4號染色體的短臂上，距離sugaryl基因約6個圖單位，以及距離Gal基因大約40個圖單位。
43.權利要求41的方法，其中所述Tcb基因座包含至少一個在所述植株中編碼穗絲效應作用的基因。
44.權利要求41或43的方法，其中所述Tcb基因座包含至少一個在所述植株中編碼花粉效應作用的基因。
45.權利要求40、41、43或44的方法，其中第一供體親本玉米植株進一步包含至少一個修飾基因。
46.權利要求39的方法，其中第二親本玉米植株是雜交不親和的并包含TCB特征。
47.雜交不親和的純種玉米植株，其包含權利要求39的方法所產生的TCB特征。
48.表現TCB特征的雜交不親和的雜種玉米植株的生產方法，該方法包括下列步驟(a)把權利要求39的純種玉米植株與第二玉米純種系雜交，所述第二玉米純種系包含編碼所需表型特征的基因，從而生成分離植株群體；以及(b)從步驟a)得到的雜交株中收集種子。
49.權利要求48的方法，其中第二玉米純種系是雜交不親和的并包含TCB特征。
50.雜交不親和的雜種玉米植株，其包含權利要求48的方法所產生的TCB特征。
51.篩選適用于生產純種玉米植株的第一供體親本玉米植株的方法，其中所述純種玉米植株如果與第二純種玉米植株雜交，則產生雜交不親和并含有TCB特征的雜種玉米植株，該方法包含下列步驟分析玉米植株群體中各植株是否存在TCB特征。
52.權利要求51的方法，其進一步包括分析所述群體中各植株DNA是否存在其基因組內基因簇的步驟，其中所述基因簇位于4號染色體的短臂上，介于圖單位40-85之間。
53.權利要求52的方法，其進一步包括分析所述群體中各植株的DNA是否存在所述Tcb基因座的步驟。
54.權利要求53的方法，其中所述Tcb基因座位于4號染色體的短臂上，距離sugaryl基因約6個圖單位，以及距離Gal基因約40個圖單位。
55.權利要求53的方法，其進一步包括分析所述群體中各植株DNA是否存在至少一個在所述植株中編碼穗絲效應作用的基因的步驟。
56.權利要求52、53或55的方法，其進一步包括分析所述群體中各植株DNA是否存在至少一個在所述植株中編碼花粉效應作用的基因的步驟。
57.權利要求52、53、55或56的方法，其進一步包括分析所述群體中各植株DNA是否存在至少一個修飾基因的步驟。
58.包含由權利要求1的方法生產的TCB特征的雜交不親和第一供體親本玉米植株。
59.含有TCB特征的雜交不親和的雜種玉米植株的篩選方法，該方法包含下列步驟分析雜種玉米植株群體中各植株是否具有TCB特征。
60.權利要求59的方法，其進一步包括分析所述群體中各植株DNA是否存在基因簇的步驟，所述基因簇位于4號染色體的短臂上，介于圖單位40-85之間。
61.權利要求60的方法，其進一步包括分析所述群體中各植株DNA是否存在Tcb基因座的步驟。
62.權利要求61的方法，其中所述Tcb基因座位于4號染色體的短臂上，距離sugaryl基因大約6個圖單位，以及距離Gal基因約40個圖單位。
63.權利要求61的方法，其進一步包括分析所述群體中各植株DNA是否存在至少一個在所述植株中編碼穗絲效應作用的基因的步驟。
64.權利要求61或63的方法，其進一步包括分析所述群體中各植株DNA是否存在至少一個在所述植株中編碼花粉效應作用的基因的步驟。
65.權利要求60、61、63或64的方法，其進一步包括分析所述群體中各植株DNA是否存在至少一個修飾基因的步驟。
66.包含由權利要求60方法產生的TCB特征的雜交不親和雜種玉米植株。
67.控制玉米植株田間雜交的方法，所述方法包括在田間種植權利要求1、4、5、7、8、15、16、17、19、20、27、34、35、37、38、47、50、58或66的雜交不親和玉米植株的步驟。
68.控制田間用于雜交種子生產的純種玉米植株雜交的方法，所述方法包括在田間種植用于雜交種子生產的權利要求4、8、16、20、34、38、47或58的雜交不親和純種玉米植株。
全文摘要
本發明涉及玉米草雜交障礙特征。含有所述特征的植株具有雜交不親和性表型。本發明還涉及含有玉米草雜交障礙特征并顯現合乎商業特性的新型雜交不親和植株，包括純種、雜種、單倍體、無性生殖和/或遺傳工程植株。
文檔編號A01H1/02GK1419407SQ01807101
公開日2003年5月21日 申請日期2001年3月30日 優先權日2000年3月30日
發明者杰里·L·克米科爾, 馬修·M·S·伊文思, 史蒂文·R·格里什 申請人:威斯康星校友研究基金會