專利名稱：克服水稻兩用不育系不育臨界溫度升高的選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)作物新品種選育方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及兩系法雜交水稻所用的雄性不育系的育性穩(wěn)定性選擇技術(shù)。
雜種優(yōu)勢(shì)利用是水稻增產(chǎn)的重要途徑，以水稻兩用不育系(光、溫敏感型不育系)為基礎(chǔ)的兩系法雜交水稻技術(shù)使我國(guó)雜交稻技術(shù)繼續(xù)領(lǐng)先世界水平，也是下一步我國(guó)實(shí)現(xiàn)超級(jí)雜交稻育種計(jì)劃的主要途徑之一。近年來兩系雜交稻優(yōu)勢(shì)組合選育與應(yīng)用取得較大進(jìn)展，至2000年底已累計(jì)推廣5565萬(wàn)畝，每畝比當(dāng)?shù)刂髟云贩N平均增產(chǎn)50kg以上，增加社會(huì)產(chǎn)值近30億元(《863計(jì)劃生物技術(shù)領(lǐng)域十五周年成果》，2001年3月)。
光敏不育系的雄性育性受光照長(zhǎng)度和溫度高低共同控制，溫敏不育系的育性只受溫度高低控制。不育臨界溫度也稱不育起點(diǎn)溫度，即誘導(dǎo)不育系開始表現(xiàn)不育時(shí)的溫度。優(yōu)良實(shí)用型的光、溫敏不育系必需具有較低的不育臨界溫度，才能保證不育系有穩(wěn)定不育期。如果一個(gè)不育系的不育臨界溫度較高，當(dāng)在夏季長(zhǎng)日條件下進(jìn)行制種時(shí)，若遇上低于不育起點(diǎn)溫度的盛夏低溫則會(huì)發(fā)生育性恢復(fù)而自交結(jié)實(shí)，從而使制種的純度降低，這種不育系具有較大的應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)性。為克服這種風(fēng)險(xiǎn)，根據(jù)長(zhǎng)江中下游稻區(qū)歷年氣溫資料分析，確定安全的不育系的臨界溫度應(yīng)低于24℃，才能保證不育系在長(zhǎng)江流域或以南稻區(qū)盛夏自然光溫條件下有穩(wěn)定不育期。
在認(rèn)識(shí)到溫度因子對(duì)不育系育性有重要影響后，育種家們注重了對(duì)不育臨界溫度性狀的選擇，采取利用異地自然溫度差異的“穿梭育種”法或人工低溫條件增加選擇壓力進(jìn)行，育成了一批不育臨界溫度達(dá)到實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)的不育系。但這些不育系在應(yīng)用中經(jīng)過幾代的繁殖后，其后代群體的臨界溫度發(fā)生升高現(xiàn)象，致使不育系群體在遇到高于24℃的溫度時(shí)也出現(xiàn)可育，從而使合格的不育系降為不合格的不育系。如大面積應(yīng)用的培矮64S于1992年鑒定時(shí)不育臨界溫度低于24℃，1995年本發(fā)明人測(cè)定其群體表現(xiàn)不育的溫度已達(dá)26℃，少量單株要在28℃才不育。同樣，粳型不育系如N5088S也存在后代不育溫度升高現(xiàn)象。
針對(duì)不育系的不育臨界溫度隨自交世代數(shù)升高的問題，袁隆平(袁隆平，水稻光溫敏不育系的提純和原種生產(chǎn)雜交水稻，1994(6)1～3)最早提出了對(duì)不育系生產(chǎn)用種進(jìn)行低溫鑒定，選出低溫不育株進(jìn)行不育系核心種子生產(chǎn)，用核心種子繁殖原原種、原種和生產(chǎn)用種的循環(huán)利用方法程序，鄧啟云等(鄧啟云，符習(xí)勤.光溫敏核不育水稻育性穩(wěn)定性研究，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，24(1)8～13)提出了核心種子鑒定選擇具體操作技術(shù)；廖伏明等(廖伏明等，水稻實(shí)用光溫敏核不育系培矮64S不育性穩(wěn)定化研究，中國(guó)水稻科學(xué)，2001，15(1)1～6)在1997～1999年間用22.0～23.0℃低溫處理篩選培矮64S的低溫不育株，獲得不育臨界溫度為22.5℃的3個(gè)穩(wěn)定株系9862、103-1和103-2，證明對(duì)高世代不育系進(jìn)行低溫選擇是有效的。
但上述措施并未使不育系從根本上擺脫臨界溫度逐代變化的困境，許多經(jīng)一次低溫處理選出的不育系后代還是分離出了高臨界溫度的單株。不育系潛在的不育性不穩(wěn)定性仍是阻礙兩系雜交稻大面積推廣應(yīng)用的重要因素。
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)不足，提出一種克服水稻兩用不育系不育臨界溫度升高的選育方法，以提高兩系法雜交水稻所用的雄性不育系的育性穩(wěn)定性，從而提高兩系水稻的育種效率。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種克服水稻兩用不育系不育臨界溫度升高的選育方法，所述的方法包括，通過連續(xù)3代低溫育性鑒定選擇低溫不育株，用不育系間雜交改造遺傳背景，分子標(biāo)記輔助選擇低不育臨界溫度性狀的材料，建立無(wú)性繁殖圃及配套方法來克服不育系不育臨界溫度不穩(wěn)定性。
所述的選育方法是用至少3代連續(xù)低溫單株育性鑒定對(duì)控制低臨界不育溫度的基因純合，利用與低不育臨界溫度密切相關(guān)的分子標(biāo)記進(jìn)行不育系單株選擇使遺傳位點(diǎn)純合，進(jìn)而對(duì)核心不育單株進(jìn)行無(wú)性擴(kuò)大繁殖，在中國(guó)熱帶—亞熱帶地區(qū)建立永久無(wú)性繁殖核心種子采種圃，經(jīng)3代擴(kuò)繁提供生產(chǎn)用種。
詳細(xì)的技術(shù)方案如下所述1、連續(xù)三代低溫選擇進(jìn)行不育系基因型純化進(jìn)行連續(xù)3代或多代低溫選擇，獲得純合單株，純合不育系基因型。此方法克服了原有只進(jìn)行一次低溫選擇方法的不足，能使中選單株后代控制低不育臨界溫度的顯性基因純合。具體方法是在較高世代(F4～F5)選出的不育株再進(jìn)行連續(xù)3代23℃人工光溫系統(tǒng)選擇鑒定，決選出后代無(wú)低溫育性分離的株系。
2、不育系育種的親本選配在不育系選育的親本選配上，采取主效不育基因等位的不育系間相互雜交，使主效不育基因以外的遺傳背景因子重組，聚合低不育臨界溫度的基因，結(jié)合在高世代進(jìn)行連續(xù)多代單株低溫鑒定，獲得主效不育基因與低臨界不育基因同時(shí)純合的株系。具體方法選取以農(nóng)墾58S作為光敏核不育基因供體的不育系相互雜交，選育低臨界不育溫度的光敏不育系；以溫敏不育系安農(nóng)S-1或5460S為不育基因源的不育系之間雜交，獲得不育臨界溫度低的溫敏不育系。
3、與低不育臨界溫度相關(guān)的分子標(biāo)記用于輔助選擇利用與低臨界溫度性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記輔助選擇體系，是快速地不依賴嚴(yán)格生態(tài)條件的實(shí)驗(yàn)室鑒定技術(shù)，從遺傳位點(diǎn)上選擇低不育臨界溫度的遺傳純合基因型單株，從根本上克服不育系遺傳異質(zhì)性。本發(fā)明提供的分子標(biāo)記為0PEROAX1、X19、B20和B14。用這些引物對(duì)不育系高世代混合群體單株進(jìn)行DNA擴(kuò)增，帶有X19、X1、B20標(biāo)記株為低溫不育株，有B14擴(kuò)增標(biāo)記株為低溫可育株。
4、用無(wú)性繁殖群體作為核心種子永久采種圃無(wú)性繁殖避開了有性的基因重組過程，可避免雜合基因型單株的分離，保持群體穩(wěn)定的低不育臨界溫度水平。對(duì)重復(fù)鑒定過的低溫不育株通過無(wú)性擴(kuò)繁，形成較大規(guī)模的無(wú)性群體，利用中國(guó)海南或華南的短日溫?zé)嶙匀粭l件多年保存，進(jìn)行多次分蔸與高肥水栽培技術(shù)，使群體在秋末、春季短光照適宜可育的光溫條件下多抽穗，一年中多次收取自交種子，獲得較大的繁殖系數(shù)。該種子經(jīng)3代擴(kuò)繁，可獲大量生產(chǎn)用種，生產(chǎn)用種不再作繁殖用種，每年更新。
上幾種方法任用其一均可克服不育系不育臨界溫度的不穩(wěn)定性。
本發(fā)明所提方案的理論依據(jù)為了弄清楚不育臨界溫度的遺傳規(guī)律，以指導(dǎo)穩(wěn)定的低臨界溫度兩用不育系的選育，本發(fā)明利用培矮64S的不同起點(diǎn)溫度的近等基因系開展了有關(guān)的遺傳研究。得出低臨界溫度性狀對(duì)高臨界溫度性狀為顯性，有兩對(duì)主效基因控制著低臨界溫度的遺傳的結(jié)論。1996年，發(fā)明人又在粳型光敏不育系N5088S后代中分離得到臨界溫度分別為30℃和23.5℃的穩(wěn)定株系H5088S、L5088S，以這兩份不育系為親本進(jìn)行不育臨界溫度高低的遺傳研究，結(jié)果與秈型不育系培矮64S研究結(jié)論一致。
對(duì)臨界溫度性狀進(jìn)行分子標(biāo)記，目前國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。由于發(fā)明人所用的近等基因系間分子多態(tài)性較低，本發(fā)明對(duì)不育臨界溫度分別為23℃、26℃的培矮64S組成的F2中分離出的23.5℃不育群和27.5℃可育群DNA采用大量引物篩選AFLP、RFLP、RADP等標(biāo)記方法，只在進(jìn)行大量隨機(jī)引物進(jìn)行RAPD標(biāo)記篩選中獲得有多態(tài)性的引物為X1、F18、F19、X19、A6、B14、Z10(0PEROA)，經(jīng)三次重復(fù)X1、X19(附
圖1)、B20和B14(附圖2)較為穩(wěn)定，對(duì)F2各單株用B14標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，獲得了較好的分辨結(jié)果(附圖3)。同樣，對(duì)L5088S×H5088S組合F2低溫不育與可育群進(jìn)行115對(duì)AFLP引物進(jìn)行多態(tài)性分析獲得6對(duì)引物表現(xiàn)多態(tài)性，并獲得4個(gè)與低不育臨界溫度共分離的標(biāo)記。
附圖及其說明
圖1，是本發(fā)明的RAPD引物X19在不育株群表現(xiàn)為陽(yáng)性的情況；圖2，是本發(fā)明的RAPD引物B14在可育株群表現(xiàn)為陽(yáng)性的情況；圖3，是本發(fā)明的RAPD標(biāo)記B14在F2群體各單株中的分離情況，圖中上部為低溫不育株；下部為低溫可育株。
本發(fā)明的效果通過以下實(shí)施例體現(xiàn)實(shí)施例1經(jīng)本方案進(jìn)行多代育性鑒定的不育系，其不育臨界溫度性狀是穩(wěn)定的。農(nóng)墾58S在1988～2000年歷年低溫下的育性結(jié)果能保持多年重復(fù)，表明所選擇的不育株系沒有發(fā)生育性臨界溫度分離。
實(shí)施例2經(jīng)3代育性低溫鑒定選擇后的培矮64S、N5088S低溫不育株，再經(jīng)分子標(biāo)記選擇出核心單株(如圖3)，經(jīng)大田3代擴(kuò)大繁殖，從生產(chǎn)用種中取隨機(jī)樣品(第4代種子)進(jìn)行育性低溫跟蹤鑒定，結(jié)果表明其后代沒有發(fā)生育性溫度分離。
表1 培矮64S大群體自然混收繁殖第4代樣品的低溫育性鑒定(2000)樣品 總株數(shù) 平均敗育花粉率％平均結(jié)實(shí)率％不育株率％第4代 6099.25 0.00100隨機(jī)樣品實(shí)施例3不育系1103S、培矮64S和N5088S的無(wú)性繁殖后代株，經(jīng)7年(代)后仍保持原有低溫不育特性，沒有發(fā)生變異。
權(quán)利要求
1.一種克服水稻兩用不育系不育臨界溫度升高的選育方法，其特征在于所述的方法包括，進(jìn)行連續(xù)3代低溫育性鑒定選擇低溫不育株，采用不育系間雜交改造遺傳背景，分子標(biāo)記輔助選擇低不育臨界溫度性狀，建立無(wú)性繁殖圃及配套方法來克服不育系不育臨界溫度不穩(wěn)定性。
2.根椐權(quán)利要求1所述一種水稻兩用不育系的選育方法，其特征在于，所述的選育方法是用至少3代連續(xù)低溫單株育性鑒定純合基因型的選擇方法。
3.根椐權(quán)利要求1所述水稻兩用不育系選育的方法，其特征在于，所述的選育方法是利用與低不育臨界溫度密切相關(guān)的分子標(biāo)記進(jìn)行不育系單株選擇與純化。
4.根椐權(quán)利要求1所述的水稻兩用不育系選育方法，其特征在于，所述的選育方法是對(duì)核心不育單株進(jìn)行無(wú)性擴(kuò)大繁殖，在中國(guó)熱帶一亞熱帶地區(qū)建立永久無(wú)性繁殖核心種子采種圃，經(jīng)3代擴(kuò)繁提供生產(chǎn)用種。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)作物新品種選育新方法范疇,具體涉及兩系法雜交水稻所用雄性不育系的育性穩(wěn)定性選擇技術(shù)。其特征是,通過連續(xù)3代低溫育性鑒定選擇低溫不育株,改造主效不育基因等位的不育系間雜交遺傳背景,低不育臨界溫度分子標(biāo)記輔助選擇,建立無(wú)性繁殖圃及配套方法來克服兩系法雜交水稻不育系不育臨界溫度遺傳不穩(wěn)定性的問題。
文檔編號(hào)A01H1/04GK1337148SQ0114140
公開日2002年2月27日 申請(qǐng)日期2001年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月24日
發(fā)明者曾漢來, 張端品, 姚方印, 謝國(guó)生, 陶愛林, 張志玉 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)