用于在體外選擇對黑斑病損傷有抗性的馬鈴薯克隆的方法及由此生成的馬鈴薯的制作方法

專利名稱：用于在體外選擇對黑斑病損傷有抗性的馬鈴薯克隆的方法及由此生成的馬鈴薯的制作方法
技術領域：
一般而言，本發明涉及為了獲得期望特征而進行的植物組織培養。更具體的說，本發明涉及在體外選擇對黑斑損傷有抗性的Lemhi和Russet Burbank馬鈴薯克隆。
背景技術：
黑斑病是影響操作過程中受損傷的馬鈴薯塊莖的生理學(非傳染性)紊亂，也稱為青變、青斑、藍變、損傷、內部黑斑、內部損傷、內部灰斑、和莖端變黑。這種紊亂表現為在將受傷塊莖削皮或切片時可以看到的內部變色和變黑。變黑通常限于表皮與維管環之間塊莖組織的外部1/4”-1/2”。斑點的顏色可以變化，由淺灰色至藍灰色至強烈的煤黑色。斑點的大小和強度通常在受傷24小時內達到最大值，而且一旦形成，變黑區域將不會消失。
黑斑病通常是由操作、運輸、儲藏、或包裝過程中對塊莖的沖擊(碰撞、掉落、等)引起的，但也可能在不同程度上與其它物理損傷(諸如壓力擦傷和/或散落破裂)有關。起始黑斑病所需要的力量不必強烈，特別是對于易感栽培種而言。
1912年英國首次報告并描述了這種紊亂，此后它成為整個歐洲的嚴重問題。1940年美國鑒定了這種紊亂，而現在在這個國家的所有馬鈴薯種植區也都可以找到它。
雖然受影響的馬鈴薯仍可使用，但是因它們的外觀而使它們的商業價值受到限制。這種紊亂是特別嚴重的，因為受影響的塊莖可能不顯示外部損傷，甚至在清洗塊莖之后也如此。在鮮貨市場和加工馬鈴薯(包括切片和油炸食物)中，黑斑損傷常常導致嚴重的經濟損失。
塊莖易感性和足以破壞細胞的沖擊力度是對起始和形成黑斑病負有責任的兩個最重要的因素。這些條件激活了一系列即四步由酚類化合物(由酪氨酸開始)至醌綴合物的生化轉變。中間化合物包括咖啡酸和對香豆酸。由多酚氧化酶作用介導的該系列之后是醌聚合形成黑色素。在健康的、未受傷組織中，這些酚類化合物與多酚氧化酶通常是隔開的，不發生接觸。然而，細胞破裂引起內含物混和，并發生變黑反應。雖然酪氨酸和多酚氧化酶在黑斑形成中發揮主要作用，但是塊莖中存在的這些化合物的總量通常與塊莖易感性無關，不能解釋塊莖和栽培種之間黑斑反應的差異。關于黑斑現象的生物化學的最近工作指出細胞內游離酪氨酸庫的減小可增加塊莖對變黑的抗性(Corsini等人，Evidence for highly conserved tuber tyrosinelevels among potato genotypes and implications forblackspot resistance即關于馬鈴薯基因型間高度保守的塊莖酪氨酸水平的證據和黑斑抗性的含義，Am.Potato J.，66511-512，1989)。這些調查人員發現許多馬鈴薯栽培種的酪氨酸總含量顯著相似，盡管這些栽培種的黑斑病易感性差異很大。在那些對黑斑病具有最大抗性的栽培種中，發現大部分酪氨酸與蛋白質結合，只有很少的游離酪氨酸可用于形成黑色素。在易感的栽培種中發現了相反情況。
除了上文討論的生化因素，許多環境和栽培因素也可能促成這種紊亂的顯現。塊莖膨壓、溫度、比重、礦質營養、種植日期、土壤濕度、和土壤溫度都可以影響黑斑形成(Hiller等人，Physiologicaldisorders of potato tubers即馬鈴薯塊莖的生理學紊亂，PatatoPhysiology，389-455，Academic出版社，紐約，1985)。
甚至在考慮了所有誘病因素之后，馬鈴薯栽培種對沖擊損傷的反應仍舊差異顯著。有些栽培種可能對黑斑病具有高度抗性，而其它栽培種可能高度易感。來自單一植株的塊莖在變黑反應中也可能不同。在一個塊莖中，由莖端至芽端的易感性也可能不同。
可以通過在生長季節采用生產實踐而將因黑斑病引起的損失控制在某種程度。目前用于控制黑斑損傷的實踐是通過提供適當的疾病和害蟲控制及優良的土壤濕度和肥力(特別是鉀)而使植物盡可能的健康。不應當使土壤在收獲前變干，而且應當及早處死蔓藤以降低塊莖的水分損失。控制黑斑形成程度的最重要手段是減少收獲過程之中和之后對塊莖的損傷。可以如下實現這一要求不在土壤溫度較低(8℃)時收獲塊莖，調節操作速度、掉落距離、和給所有的馬鈴薯操作設備添加襯墊。選擇對黑斑病最有抗性的栽培種也是一種重要的考慮。然而，由于生產限制，這并非總是可行。有些栽培種顯示商業生產的極大潛力，但是因黑斑損傷而受損。栽培種Lemhi Russet和Russet Burbank(程度較輕)就是這種情況。
Lemhi和Russet Burbank因具有許多特征而使之成為加工工業的合適且重要的栽培種，包括還原糖水平較低、儲藏性較好、加工極好、和休眠。然而，它們對黑斑病極其易感。尚未發現天然有抗性的Lemhi和Russet Burbank。這限制了它們的可接受性，因為由擦傷受損馬鈴薯獲得的加工產品(如切片和油炸食物)的質量顯著降低。雖然可以通過傳統育種技術獲得黑斑抗性，但是這也可能改變使得栽培種在商業上可接受的其它特征(諸如糖水平、形狀、比重、或產量)。在維持每一種期望特征的基礎上培育改進的栽培種是很困難的，而且這種方法將牽涉幾年的雜交和測試。
作為傳統育種技術的候選，植物細胞培養提供了機會而能夠評估有潛力再生成有價值的體細胞克隆變體的大量細胞(精確的說是以百萬計)。通常，需要大量的再生植株來鑒定具有期望性狀的體細胞克隆。增加和測試這種群體是費力的，而且需要大量的溫室和田地空間。這個問題通常由能夠在再生成植株前在組織培養中對體細胞克隆篩選所需特征的開發技術來解決。在細胞培養水平進行的評估極大降低了所要求的空間，并增加了可以檢驗的體細胞克隆系的數目。體外篩選流程通過消除不需要的材料而在本質上增加了鑒定得到具有期望性狀的克隆的可能性。因此，需要提供傳統育種方法的候選方法，用于馬鈴薯栽培種的改進和開發。還需要增加鑒定得到黑斑抗性Lemhi和Russet Burbank馬鈴薯克隆的可能性。還需要增加鑒定并選擇期望黑斑抗性Lemhi和Russet Burbank體細胞克隆的容易度和功效的技術。本發明滿足了這些需要，并提供了其它相關優勢。
發明概述本發明涉及使用植物組織培養技術和使用添加到組織培養培養基中的至少一種黑色素前體(諸如酪氨酸或咖啡酸)而在體外篩選對黑斑病有抗性的Lemhi和Russet Burbank的方法。本發明還涉及由體外篩選生成的黑斑抗性塊莖。這些方法基于體外體細胞分離、培養、篩選、選擇、和再生，但不涉及有性雜交。
這些方法通常包括在細胞層培養基和相關儲存培養基中培養由馬鈴薯植株獲得的組織，將組織在愈傷組織增殖培養基上傳代培養以獲得愈傷組織形成，將愈傷組織在苗誘導培養基上傳代培養以獲得苗形成，并將苗在生根培養基上傳代培養以確保根形成，從而再生得到馬鈴薯植株，由此可生成對黑斑病有抗性的塊莖。可以向儲存培養基、愈傷組織增殖培養基、和生根培養基中添加至少一種黑色素前體，以進一步增加鑒定得到黑斑抗性克隆的可能性。在使用黑色素前體篩選方法時，由在各種培養基中存在黑色素前體時不顯示變黑應答的愈傷組織和根再生得到馬鈴薯植株。
根據下文更詳細的描述，本發明的其它特色和優勢將變得清晰。
發明詳述本發明提供了用于提高黑斑抗性增加的再生Lemhi和RussetBurbank馬鈴薯克隆的數目的方法及由其生成的馬鈴薯塊莖。用于馬鈴薯葉肉原生質體的收集、培養、和再生的流程閱讀下列流程時應當參閱下列縮寫和組成
來源植株的栽培應當將馬鈴薯塊莖維持于室溫以中斷休眠。這通常發生于7-14天內。在發芽起始后，將各塊莖單個種植到裝有人造土壤混和物諸如Jiffy-Mix(JPA，1400 Harvester路，West Chicago，IL 60185)或Sunshine-Mix(Fisons Western公司，Vancouver，BC，加拿大V6H 3V1)的20cm陶罐中。應當用蒸餾水使土壤保持潮濕，但是應當避免澆水過度。當芽的長度達到6-10cm時，由母本塊莖切下芽，并種植到裝有土壤混和物的20cm陶罐中。應當在相對濕度70-80％、以冷白色熒光燈照明12小時光周期的受控環境室中栽培植物。照明方案應當包括5小時的90μE m-2sec-1、2小時的325μE m-2sec-1、和5小時的90μE m-2sec-1。將溫度維持在16℃，但是在光照周期的第2-6小時升高至22℃。如Shepard，J.F.，Mutant selection and plantregeneration from potato mesophyll protoplasts，GeneticImprovement of CropsEmergent Techniques即由馬鈴薯葉肉原生質體選擇突變體和再生植株，農作物的遺傳改良新興技術，明尼蘇達大學出版社，第185-219頁，1980所述，兩周一次給植株施肥。
也可以由自分生組織培養物起始的植株生成原生質體來源植株，并通過節扦插增加數目。可以用下文處理苗延長/根起始的“植物再生指令序列”部分中描述的培養基E和條件來培養并維持它們。原生質體的分離(葉片采集)當由移植后4-8周的植株收集小葉時，原生質體的產量是相當一致的。由第3-7節(自植株頂端開始)剪下葉子。應當避免使用很嫩的葉或很老的葉。具有大型末端小葉(＞5cm)的葉通常產生大量的原生質體。選擇最大的葉。讓一部分葉柄留在小葉上以便于操作。大約3.5-4.5g葉組織(5-6片小葉)通常將提供足夠的細胞用于處理。在測定鮮重后，小葉已經準備就緒，可用于酶促分離的預處理。
原生質體分離(小葉預處理)必須極度小心以確保在下文所述體外操作的整個過程中維持絕對無菌條件。在將小葉置于預處理溶液中之前，必須將小葉滅菌。將每片小葉浸入70％乙醇(1-2秒鐘)，然后轉移至裝有1000ml 10％漂白劑(Chlorox、Hilex、等)溶液的燒杯中。將小葉在次氯酸鹽溶液中浸沒2-3分鐘，然后轉移至裝有500ml無菌蒸餾水的燒杯中。將每片小葉浸入水中大約10次即漂洗，然后轉移至裝有無菌蒸餾水的第二個燒杯中，并重復漂洗步驟。第二次漂洗后，將小葉浸入70％乙醇(1-2秒鐘)。現在小葉已經準備就緒，可用于預處理溶液。將250ml無菌漂浮液無菌轉移至大型(20cm)、有蓋的玻璃洗盆(無菌)中
將小葉漂浮在漂浮液表面上，背軸(頂)面向下。用箔片覆蓋盆，并于24℃保溫48小時。保溫后，取出小葉，并如上所述重復表面滅菌步驟。最后一次浸入70％乙醇后，將小葉在層流罩超凈臺中在無菌紙巾上空氣干燥。
通過在95％乙醇中浸泡5-10分鐘，將尼龍剛毛美工刷滅菌。將刷子空氣干燥，并小心的刷過每片小葉的向軸(底)面。刷的動作應當朝向小葉尖端，而且應當持續至由小葉剝去表皮。當組織由淺綠色變成深綠色時，剝離步驟就完成了。由每片小葉除去中脈并丟棄。將刷過的組織無菌切成窄條(1-3mm寬)，并轉移至裝有200ml無菌浸泡液的500ml側臂燒瓶。將燒瓶漩渦晃動，使組織片均勻分布在溶液中。用箔片覆蓋燒瓶，并于4-10℃保溫24小時。
原生質體分離(小葉消化)浸泡階段完成后，由燒瓶小心的倒出液體，并換入100ml酶溶液。
將小葉切片真空浸潤(25-27英寸Hg)7分鐘，并將燒瓶置于旋轉搖床(100rpm)上，于室溫(27℃)保溫至組織分離(3-5小時)。消化時間隨栽培種、組織年齡、溫度、搖床速度、和酶溶液的比重而變化。
原生質體分離(原生質體收獲)通過無菌Babcock(乳試驗)瓶中的離心浮選來收集原生質體(除去細胞壁的細胞)。將消化燒瓶的內容物和緩的倒入裝有幾層粗棉布的無菌漏斗內。漏斗尖端經一段塑料管裝配了5 1/4英寸巴氏吸管。吸管尖端應當靠在Babcock瓶頸的內側，距離瓶口大約1/2-1/3距離。原生質體極端脆弱，因此應當使原生質體懸浮液沿瓶壁流下，而不是直接濺落瓶底。新鮮分離的原生質體還對光敏感，因此收集步驟應當在柔和的光照下進行。將無菌漂洗液倒到滯留在粗棉布濾器上的碎片上，同時用吸管尖端溫和搖動濾器。
漂洗碎片至注滿3個Babcock瓶。用無菌漂洗液注滿第四個瓶。將該瓶用于平衡離心機。將4個瓶以500rpm離心10分鐘(IEC HN-SII離心機，配備轉頭215和套管367A)。碎片離心到瓶底，而完整原生質體漂浮在頂部。由平衡瓶取出5-10ml無菌漂洗液。用無菌9英寸巴氏吸管將其它3個瓶的原生質體層轉移至漂洗瓶。將吸管尖端插入漂洗液，然后將原生質體緩慢且溫和的注入溶液。將瓶子傾斜大約45度角并旋轉幾分鐘，使原生質體均勻分布于漂洗液中。加入新鮮漂洗液至Babcock瓶頸(#8)上的頂級并再次離心。若在CL培養基中使用1X鹽，則現在就可以涂布生成的漂浮原生質體。若CL培養基含有4X鹽，則必須在涂布前將原生質體在保持液中適應至少1小時。
由瓶頸讀取原生質體層占據的分區數目，以估計收集的細胞數目(一個大分區包含大約250萬個原生質體)。通過幾次漂洗用保持液包被無菌巴氏吸管的內壁，排出原生質體層，并用保持液將原生質體稀釋至濃度1百萬個細胞/ml。將原生質體在保持液中于22-24℃維持最少1小時。體外選擇黑斑抗性原生質體衍生的馬鈴薯克隆的方法植株再生順序(原生質體培養)在塑料四分板中培養原生質體。準備平板，即用電焊槍沿每個分區的底部割一條縫。向兩個相對分區的每一個都注入10ml R培養基。
R培養基的工作濃度如下
制備原生質體細胞層培養基(CL培養基)，即混和4份SLLX溶液與1份CL成分。

CL培養基的工作濃度如下
將混和的CL/SLLX培養基冷卻至室溫(10-15分鐘)。然后將原生質體懸浮液稀釋至期望濃度(20,000-40,000細胞/ml)。使用無菌吸管尖端，將原生質體在培養基中溫和的混勻成均一的懸浮液。將3ml懸浮液轉移至每個空的四分板分區，合計每個板6ml。用Parafilm石蠟膜密封平板，并在恒定照明(冷白色熒光燈)下于24℃保溫10-14天。在這一起始生長階段需要低光照強度(大約600lux)。
植物再生順序(愈傷組織培養)用無菌解剖刀將凝膠形式的細胞層切成小片，并將這些凝膠片轉移至裝有20ml C培養基(＝C1)(愈傷組織增殖培養基)的皮氏培養皿。一個四分區的整個內容物應當涂布在一個C培養基平板上。用Parafilm石蠟膜密封平板，并在大約3000lux的恒定照明(冷白色熒光燈)下于24℃保溫。2-3周后，愈傷組織(小型細胞聚集體)應當是淺綠色的，直徑大約1-2mm。用無菌解剖刀片尖端由凝膠挑取個別愈傷組織，并轉移至裝有新鮮C培養基的平板(25-50愈傷組織/平板)。如上所述將這些C培養基平板(＝C2)保溫。
C培養基的工作濃度如下
植物再生順序(愈傷組織分化)當愈傷組織變成深綠色時(3-5周)，將來自C培養基平板的愈傷組織轉移至裝有苗誘導培養基(6D培養基)的平板(10-25愈傷組織/平板)。用Parafilm石蠟膜密封平板，并在冷白色熒光燈下(大約3000-4000lux)以每日周期16小時光照/8小時黑暗于24℃保溫。苗誘導通常發生于6-8周后。然而，有些栽培種只在苗再生培養基上長期培養(6-8個月)后才生成苗。
6D培養基的工作濃度如下
植物再生順序(苗延長/根起始)當愈傷組織上的苗長到2-10mm長時，由各愈傷組織切下苗，并轉移至裝有15ml E培養基的玻璃試管(25×150mm)。將每根苗的基部壓入培養基，蓋上試管帽，并用濾紙條密封。將試管在冷白色熒光燈下(大約1500-2000lux，每天8小時黑暗期)于24℃保溫。根起始應當發生于2-5周內。
E培養基的工作濃度如下
植物再生順序(再生小植株的栽培)由試管中取出小植株，并用蒸餾水洗去根上的瓊脂。將每株小植株轉移至裝有Jiffy-Mix的8cm陶罐。用大約100ml Peters 20-20-20肥料(0.5g/L)給陶罐澆水。將每個陶罐密封在干凈的塑料袋中。將袋裝的陶罐在熒光燈下于室溫(22-27℃)保溫。一周后，打開袋子的頂部。隨后7-10天擴大開口，然后除去整個袋子。讓植株繼續生長2-4周。當植株長到15-25cm高時，應當將它們移植到裝有Jiffy-Mix的更大陶罐(20-30cm)中。然后在溫室中栽培植株直至完成塊莖結果(2-4個月)。收獲前大約1周，切斷蔓藤，并讓陶罐中的土壤干燥。將每個原生質體衍生克隆的塊莖收集到紙袋中并冷藏，用于田間擴大。
上文所述技術基于Shepard，J.F.，Mutant selection andplant regeneration from potato mesophyll protoplasts，Genetic Improvement of CropsEmergent Techniques即由馬鈴薯葉肉原生質體選擇突變體和再生植株，農作物的遺傳改良新興技術，明尼蘇達大學出版社，第185-219頁，1980描述的流程，并經過Taylor，R.J.和Secor，G.A.，A shoot induction procedurealtered for increased shoot efficiency of potato protoplast-derived calli即為了提高馬鈴薯原生質體衍生愈傷組織的苗效率而改變的苗誘導流程，Potato Research，31651-658，1988的修改(收入本文作為參考)。
在一個優選實施方案中，依照上文所述流程進行馬鈴薯葉肉原生質體的收集、培養、和再生，只是在有些組織培養培養基中包含至少一種黑色素前體諸如酪氨酸或咖啡酸。這種方法能夠額外增加黑斑抗性克隆的數目。如上所述不含至少一種黑色素前體的培養誘導篩選方法自身將導致一些黑色素抗性克隆。
在黑色素前體篩選方法的第一階段，在普通CL培養基(不含黑色素前體)中稀釋(40,000細胞/ml)原生質體，然后轉移至裝有含0.25mM酪氨酸或咖啡酸的R培養基(儲存培養基)的培養平板。正常保溫期后，將原生質體和原生質體衍生微小愈傷組織與細胞層培養基(CL)一起轉移至含0.5mM酪氨酸的C培養基。此第一次轉移至C培養基是該方法的第二階段。標準保溫期后，只選擇不顯示變黑應答的愈傷組織，并轉移至含1.0mM酪氨酸或咖啡酸的新鮮C培養基，用于第三階段的篩選。將愈傷組織繼續保溫2-4周，并通過無菌解剖刀片的切割使那些保持綠色(不顯示變黑)的愈傷組織受損。24小時后，對割傷的愈傷組織評估受損區域的變黑情況。此第四階段篩選后，只將存活的綠色愈傷組織轉移至普通6D培養基(苗誘導培養基)(不含黑色素前體)，用于小植株起始。將再生植株轉移至含0.5mM酪氨酸或咖啡酸的E培養基(生根培養基)，用于最后第五階段的篩選。回收所有在培養基中形成不展示根變黑的苗，作為潛在的黑斑抗性克隆。將這些植株轉移至陶罐中，并在溫室中栽培，用于生成塊莖。每株植株通常生成6-24個塊莖，保留它們直至下一個田間種植季節。隨后將選定克隆的塊莖擴大1或2次田間世代。在溫室和田間兩個場所檢驗克隆的解剖特征，并對收獲的塊莖測試黑斑損傷。可能有利的是只在有些階段添加酪氨酸或咖啡酸，因為否則的話原生質體和愈傷組織可能受傷并因而不能用。表1篩選和再生順序所牽涉的最短時間的概述
討論用于鑒定可生成黑斑抗性植株的細胞和愈傷組織的流程基于的是受傷塊莖中通常發生的生化過程。上文所述標準組織培養培養基中包含酪氨酸(通過一系列生化反應轉變成黑色素的主要化合物)或咖啡酸(黑色素途徑中的中間化合物)作為額外成分。在組織培養過程的幾個階段對由單個原生質體衍生的愈傷組織評估黑色色素形成。丟棄那些在存在酪氨酸或咖啡酸時展示變黑應答的愈傷組織(推測是易感體)，保留那些在整個生長和再生過程中不顯示變黑的愈傷組織(可能是抗性克隆)。將由這些愈傷組織生成的植株進行溫室和田間擴大，以生成足夠數量的塊莖用于隨后的損傷和黑斑評估。黑斑測試(所用方法和評估系統)使用與Kunkel等人，Improvements of techniques forblackspot evaluation and some errors associated withmeasurements即用于黑斑評估的技術改進和與測量有關的一些誤差，Am.Potato J.，6313-23，1986(收入本文作為參考)所述相似的器械，在受控條件下使塊莖受傷。對每個克隆的5個塊莖進行測試，方法是將一個115g砝碼由45或50cm高度落下而沖擊塊莖，每個塊莖接受9次沖擊(莖端3次、中部3次、芽端3次)。將塊莖于75℃維持24小時，然后評估。在測試的第一年，可用再生塊莖的數量因環境條件而是最小的。在第一年和第三年，每個克隆測試5個塊莖，每個塊莖接受9次沖擊，合計45次擦傷斑點。在第二年，每個克隆重復測試3次，即每個克隆15個塊莖，每個塊莖9次沖擊，合計135個擦傷斑點。下文所示第二年的結果反映了三次試驗的平均值。對于有些克隆，第二年是測試該克隆的第一年。用刀在沖擊區域切片，目視測定黑斑形成。平行于塊莖表面切下薄薄的組織切片直至獲得最大直徑的變黑強度。
使用3種標準來量化黑斑病易感性(1)依照5分等級來評估每個沖擊點的損傷嚴重程度(S)，其中0＝不形成斑點1＝很小的斑點，稍微黑2＝小斑點，有限變黑3＝中等斑點，中度變黑4＝大斑點5＝很大的斑點，強烈變黑(2)對斑點計數，并由該信息測定形成斑點的沖擊區域的百分比(PC)。(3)依照下面的公式，由上述信息計算黑斑指數(BI)BI＝S×PC將栽培種的易感性/抗性表述成由所有受傷塊莖計算得到的平均黑斑指數。結果下表以百分比顯示了結果
*它們在統計上比母本克隆更有抗性。
下表鑒定了由未進行黑色素前體體外選擇篩選流程的Lemhi愈傷組織系再生的克隆。該群體代表了人們對于不含黑色素前體的體外篩選所預期的黑斑抗性變體的分布。可以看出，組織培養過程自身可增加黑斑抗性Lemhi克隆的數目，因為Lemhi在自然界通常顯示相對較少(如果有的話)的抗性。組織培養篩選Lemhi克隆群體的黑斑反應克隆編號 黑斑指數第一年第二年 第三年84-39 182.792-101.2*84-114 3.5* 5.0* 55.0*84-210B 5.4* 98.5 102.884-196 10.6* 144.2 62.684-117 11.4* 60.4 13.0*84-256 12.1* 78.8 83.184-254 16.7* 102.3 47.7*84-820.7*84-148 42.6 97.9 126.884-16 42.6 113.1 163.384-305 47.9 158.6 172.392-25 64.1 53.2* 19.2*84-231 101.0 29.5*84-155 105.0 36.2* -84-1106.4 151.4 180.784-5121.7 206.4 218.884-143 141.3 255.9 163.384-9160.2 133.6 101.384-63 203.3 137.2 188.881-1237.2 135.1 161.384-249236.684-329181.984-163125.584-31 99.284-184 70.9 98.7 69.884-278 79.5 84.884-351A 74.684-27 73.2 60.584-20 69.284-31450.9* 105.784-49246.1* 113.984-39346.0* 105.184-45924.9* 50.5*84-78 0.4* 1.2*92-3 125.0115-3 103.6 103.291-64 39.1*81-8 36.3*120-111.7*84-402 199.584-166 47.3*Lemhi MC51.5 124.1 147.4(原生質體來源)Lemhi 47.9 94.5 160.5(國家種子分生組織計劃)*＝顯著比栽培種Lemhi更有抗性(p＝0.05)第一年的數據基于1次損傷測試試驗(5個塊莖)第二年的數據基于3次損傷測試試驗(15個塊莖)第三年的數據基于1次損傷測試試驗(5個塊莖)這些結果證明容易發生黑斑病易感性的變化，而且能夠在Lemhi體細胞克隆的篩選群體中找到黑斑損傷抗性增強的體細胞克隆。
下表鑒定了由進行了黑色素前體體外篩選流程但不顯示變黑應答的Lemhi愈傷組織系再生的克隆。如下所述在不同階段篩選這些克隆。用黑色素前體(酪氨酸或咖啡酸(CA))在體外篩選的Lemhi克隆群體的黑斑反應克隆編號 篩選階段(添加黑色素前體的階段) 黑斑指數第一年 第二年 第三年L-DB27(CA) 1 2 3 4 0.0*68.3 53.0*L-DB23(CA) 1 2 3 4 1.2*83.6 75.9L-DB14(CA) 1 2 3 4 3.0*27.6*93.0L-DB18(CA) 1 2 3 4 3.4*90.6 105.2L-DB21(CA) 1 2 3 4 4.9*144.6170.5L-DB24(CA) 1 2 3 4 36.8241.392-7 (CA)3 60.5109.1128.6111-6 2 3 5203.889.6103-13 2 3 5174.569.4111-4 2 3 5157.0136.7111-17 2 3 5107.32.598-2 2 3 5104.894-1597.4 103.3111-13 2 3 584.4 51.3*97-19 2 3 583.6 50.7*111-20 2 3 577.7 83.2111-12 2 3 575.8111-14 2 3 575.4 134.498-1 2 3 566.6103-3 2 3 562.6 106.391-95 555.3*33.8*97-18 2 3 553.6*21.0*97-26 2 3 546.6*36.1*111-3 2 3 545.6*100.891-13 542.1*54.7*103-2 2 3 541.7*199.4111-28 2 3 538.5*94.892-67 535.3*15.3L-DB4 1 2 3 4 31.8*91-62 523.8*59.2*L-DB6 1 2 3 4 18.6*35.1*91-28 515.2*L-DB25(CA) 1 2 3 4 14.6*2.5*114-8 2 3 513.4*83.8*97-30 2 3 59.5* 132.992-66 52.5*91-751.9*L-DB22(CA) 1 2 3 4 0.5*115-1 2 3 50.4* 57.5111-333 50.1* 55.884-515 5L-DB19(CA) 1 2 3 4114.4114-5 2 3 4 5 102.0111-38 2 3 5 99.197-43 3 95.5110-173 4 5 72.697-17 3 5 63.597-44 1 3 5 57.791-14538.9*103-14 2 3 533.1*91-61532.3*L-DB15(CA) 1 2 3 4 31.1*97-12 3 527.6*91-12526.9*111-37 2 3 522.4*98-5 3 4 521.2*115-2 14.1*111-29 2 3 4 511.8*Lemhi MC 51.5 124.1147.4(原生質體來源)Lemhi 47.9 94.5160.5(國家種子分生組織計劃)*＝顯著比栽培種Lemhi更有抗性(p＝0.05)第一年的數據基于1次損傷測試試驗(5個塊莖)第二年的數據基于3次損傷測試試驗(15個塊莖)第三年的數據基于1次損傷測試試驗(5個塊莖)
下列克隆是由進行了黑色素前體體外篩選流程且在至少一個階段顯示變黑應答的Lemhi愈傷組織系再生的。克隆編號 篩選階段 黑斑指數第一年 第二年 第三年111-15 2 3 5 133.4103-1 2 3 5 121.230.2*110-2 3 5 75.491-515 57.7111-11 2 3 5 39.7*97-8 3 5 36.7*16.1*115-9 2 3 5 0.2* 7.4*111-35 2 3 4 5 58.0111-26 2 3 5 28.4*92-125 5 35.6*Lemhi母本克隆 51.5 124.1147.4(原生質體來源)Lemhi 47.9 94.5 160.5(國家種子分生組織計劃)*＝顯著比栽培種Lemhi更有抗性(p＝0.05)第一年的數據基于1次損傷測試試驗(5個塊莖)第二年的數據基于3次損傷測試試驗(15個塊莖)第三年的數據基于1次損傷測試試驗(5個塊莖)這些結果證明可以在體外選擇的體細胞克隆群體中鑒定黑斑損傷易感性，暗示通過在組織培養的同時篩選材料可以提高黑斑抗性克隆的比例。結論來源種質Lemhi通常不如過去對損傷易感。Lemhi通常是高度易感的，預期BI值250-300。相反，長出的Lemhi塊莖的平均BI在第一年是51.1，第二年是124.1，第三年是147.4。這證明了這種紊亂的表達是多么密切依賴環境條件和植物生理學。將Lemhi的黑斑應答用作評估體細胞克隆的比較手段。
清楚的是，可以通過體外選擇獲得顯示黑斑損傷抗性增強的克隆。可以證明，起作用的黑斑抗性體外篩選系統是如何控制這種紊亂的一個因素。應用這種系統可能是有意義的，因為可以鑒定出大比例的黑斑抗性增強的體細胞克隆。這將極大增加獲得具有最初栽培種所有重要特征的克隆的可能性。找到除了黑斑抗性以外還顯示其它性狀改進的體細胞克隆的概率也將增加。
雖然為了例示目的已經詳細描述了本發明的具體實施方案，但是可以進行各種修改而不違背本發明的精神和范圍。因此，本發明將不受限制，除了所附權利要求。
權利要求
1.由通過組織培養獲得的再生馬鈴薯植株體外選擇黑斑抗性塊莖的方法，包括下列步驟a)在細胞層培養基和相關儲存培養基中培養由馬鈴薯植株獲得的組織；b)將所述組織在愈傷組織增殖培養基上傳代培養以獲得愈傷組織形成；c)將所述愈傷組織在苗誘導培養基上傳代培養以獲得苗形成；d)將所述苗在生根培養基上傳代培養以確保根形成，從而再生得到馬鈴薯植株，由此可生成黑斑抗性塊莖；并e)向至少一種所述儲存培養基、愈傷組織增殖培養基、和生根培養基中添加至少一種黑色素前體，從而由在添加黑色素前體時不顯示變黑應答的愈傷組織和根再生得到所述馬鈴薯植株。
2.權利要求1的方法，其中所述黑色素前體是酪氨酸或咖啡酸。
3.權利要求2的方法，其中酪氨酸或咖啡酸的濃度是a)儲存培養基中為0-大約0.25mM；b)愈傷組織增殖培養基中為0-大約1.0mM；c)生根培養基中為0-大約0.5mM。
4.由通過組織培養再生的馬鈴薯植株篩選黑斑抗性馬鈴薯的方法，包括下列步驟a)在細胞層培養基和相關儲存培養基中培養由馬鈴薯植株獲得的組織，其中所述相關儲存培養基中添加了有效量的至少一種黑色素前體以引起非抗性植株變黑；b)將所述組織在愈傷組織增殖培養基上傳代培養以獲得愈傷組織形成，其中所述愈傷組織增殖培養基中添加了有效量的至少一種黑色素前體；c)將所述愈傷組織轉移至新鮮的愈傷組織增殖培養基，其中所述愈傷組織增殖培養基中添加了有效量的至少一種黑色素前體以引起非抗性植株變黑；d)使所述愈傷組織受傷；e)選擇不顯示變黑應答的愈傷組織并將它們轉移至苗誘導培養基以獲得苗形成；f)將所述苗在生根培養基上傳代培養以確保根形成而用于再生植株，其中所述生根培養基中添加了有效量的至少一種黑色素前體以引起非抗性植株變黑；并g)選擇具有不顯示變黑應答的根的苗并將所述再生植株轉移至合適位置以生成塊莖。
5.權利要求4的方法，其中黑色素前體是酪氨酸或咖啡酸。
6.權利要求4的方法，其中酪氨酸或咖啡酸的濃度是a)儲存培養基中為大約0.25mM；b)愈傷組織增殖培養基中為大約1.0mM；c)生根培養基中為大約0.5mM。
7.依照由通過組織培養獲得的再生Lemhi Russet馬鈴薯植株體外選擇黑斑抗性塊莖的方法再生的Lemhi Russet品種的馬鈴薯植株，所述方法包括下列步驟a)在細胞層培養基和相關儲存培養基中培養由所述馬鈴薯植株獲得的組織；b)將所述組織在愈傷組織增殖培養基上傳代培養以獲得愈傷組織形成；c)將所述愈傷組織在苗誘導培養基上傳代培養以獲得苗形成；d)將所述苗在生根培養基上傳代培養以確保根形成，從而再生得到馬鈴薯植株，由此生成黑斑抗性塊莖；并e)向所述儲存培養基、愈傷組織增殖培養基、和生根培養基至少之一中添加至少一種黑色素前體，從而由在添加黑色素前體時不顯示變黑應答的愈傷組織和根再生得到所述馬鈴薯植株。
8.由權利要求7的再生馬鈴薯植株衍生的黑斑抗性馬鈴薯塊莖。
9.依照由通過組織培養物再生的Lemhi Russet馬鈴薯植株篩選黑斑抗性塊莖的方法再生的Lemhi Russet品種的馬鈴薯植株，所述方法包括下列步驟a)在細胞層培養基和相關儲存培養基中培養由所述馬鈴薯植株獲得的組織，其中所述培養基中添加了有效量的至少一種黑色素前體以引起非抗性植株變黑；b)將所述組織在愈傷組織增殖培養基上傳代培養以獲得愈傷組織形成，其中所述愈傷組織增殖培養基中添加了有效量的至少一種黑色素前體；c)將所述愈傷組織轉移至新鮮的愈傷組織增殖培養基，其中所述愈傷組織增殖培養基中添加了有效量的至少一種黑色素前體以引起非抗性植株變黑；d)使所述愈傷組織受傷；e)選擇不顯示變黑應答的愈傷組織并將它們轉移至苗誘導培養基以獲得苗形成；f)將所述苗在生根培養基上傳代培養以確保根形成而用于再生植株，其中所述生根培養基中添加了有效量的至少一種黑色素前體以引起非抗性植株變黑；并g)選擇具有不顯示變黑應答的根的苗并將所述再生植株轉移至合適位置以生成塊莖。
10.由權利要求9的再生馬鈴薯植株衍生的黑斑抗性馬鈴薯塊莖。
全文摘要
本發明提供了使用植物組織培養技術在體外選擇對黑斑病有抗性的Lemhi和Russet Burbank馬鈴薯的第一種方法。本發明還提供了使用添加到組織培養培養基中的至少一種黑色素前體的第二種方法。本發明還提供了由這些方法生成的對黑斑病有抗性的馬鈴薯。
文檔編號A01H1/04GK1460123SQ00819976
公開日2003年12月3日 申請日期2000年4月27日 優先權日2000年4月27日
發明者G·A·賽克爾, R·J·泰勒, D·L·比尼, C·L·魯比 申請人:吉·阿·辛普洛特公司