專利名稱：用原卟啉原氧化酶基因增加農作物產量或單產的方法
技術領域：
本發明涉及應用原卟啉原氧化酶(在下文中，稱之為“Protox”)基因增加農作物產量和單位面積數量的方法。更準確地說，本發明涉及到，通過增強農作物、重組載體和重組載體-宿主農作物系統的光合作用能力和應用重組載體和重組載體-宿主農作物系統，應用含有Protox基因的重組載體轉化一種宿主農作物來增加農作物的產量和單位面積數量的方法。
背景技術：
Protox催化原卟啉原IX氧化成原卟啉IX，是亞鐵血紅素和葉綠素生物合成過程中最常見的酶。葉綠素在光合作用中是光收獲色素，是與光合作用的能力和最終產量有關的必需因素。迄今，已經做過很多努力來增加農作物的產量，如通過增加光合作用的效率，也就是為了增加光合作用的能力加大二氧化碳的濃度[Malano et al.，1994；Jilta et al.，1997]，卟啉途徑前體δ-氨基乙酰丙酸的葉狀噴濺增強了葉綠體生物合成，從而增加農作物產量[Hotta et al.，1997]，以及編碼光敏色素的基因的操作，來增強光合作用的效率[Clough et al.，1995；Thile et al.，Plant Physiol.1999]。然而，由于這些嘗試需要昂貴的費用和勞動力，以及可能存在未預料到的抑制農作物生長的副作用，而使得尚沒有商業化。
到目前為止，自埃希氏大腸桿菌、酵母菌、人類和植物中，克隆和檢定出的有12個Protox基因，其中每一種基因在不同的有機體中共享的氨基酸特性較低，但是，在相近的家簇之間卻有很高的同源性[Dailey et al.，1996；Lermontova et al.，1997；Corrigall et al.，1998]。
盡管枯草桿菌(Bacillus subtilis)的Protox與具有一種黃素和利用分子氧作為一種電子受體的真核生物的酶有相似的動力學特性，但是它能夠氧化多種底物，例如原卟啉原IX和糞卟啉原III。因為枯草桿菌Protox與真核生物Protox相比具有較少的底物特異性，所以當枯草桿菌Protox轉化入植物時，能夠應用底物催化植物的卟啉途徑的反應[Dailey et al.，1994]。
通過強調對雜草控制和給農作物選擇除草劑來研究Protox酶[Matringe et al.，1989；Choi et al.，1998；U.S.Patent No.5,767,373(June16，1998)；U.S.Patent No.5,939,602(August 17，1999)]。然而，并沒有討論與刺激植物生長有關的Protoxo。
發明內容
為確定是否植物細胞液或質體中存在枯草桿菌Protox基因的最佳表達，激發導致葉綠素和光敏色素生物合成增強的卟啉路徑，并從而增加農作物的光合作用的能力，本發明的發明者通過農桿菌介導的轉化，研制了表達枯草桿菌Protox基因的轉基因稻米，并且在T0、T1和T2代檢查了它們的生長特性。結果，發明者發現，轉基因稻米的產量和單位面積內的數量由于載體-宿主植物系統而大量增加，并且完成了本發明。
因此，本發明的一種目的就是提供一種通過增強農作物的光合作用的能力，用含Protox基因、最好是枯草桿菌Protox基因的一種重組載體，來轉化一種宿主農作物，來增加農作物的產量和單位面積內的數量的方法。本發明也包括重組載體、重組載體宿主農作物系統，和重組載體及其重組載體-宿主農作物系統的應用。
首先，本發明提供了用一種含有Protox基因的重組載體轉化一種宿主農作物，來增加農作物的產量和單位面積內的數量的方法。在此方法中，上述的基因最好是一種原核生物的基因，最好是一種來自桿菌或腸道細菌的基因。另外，最好的是，上述的重組載體具有泛素啟動子并且靶到一種宿主植物的細胞液或質體。
第二，本發明提供了一種包含Protox基因、泛素啟動子和潮霉素磷酸轉移酶可選擇標記物的重組載體。上述的Protox基因最好是從枯草桿菌中分離出來的。
第三，本發明提供了用上述重組載體轉化的一種土壤桿菌屬瘤(A.tumefaciens)，尤其是一種土壤桿菌屬瘤LBA4404/pGAl611C(KCTC0692BP)或一種土壤桿菌屬瘤LBA4404/pGAl611P(KCTC0693BP)。
第四，本發明提供了用上述土壤桿菌屬瘤轉化的一種植物細胞。這種植物細胞可能是一種單子葉植物，例如大麥、玉米、小麥、黑麥、燕麥、草皮草、甘蔗、小米、黑麥草、果園草，以及稻米或是一種雙子葉植物，例如大豆、煙草、含油種子油菜、棉花和馬鈴薯。
第五，本發明提供了由上述植物細胞改建的一種植物。
第六，本發明提供了由上述植物收獲的一種植物種子。
下文中將要描述T0、T1和T2代中表達一種枯草桿菌Protox基因的轉基因植物的研制。然而，本發明并不限于特定的植物(例如，稻米、大麥、小麥、黑麥草、大豆和馬鈴薯)。該技術領域的專家將會欣賞，本發明不僅適用于其它的單子葉植物(例如，玉米、黑麥、燕麥、草皮草、甘蔗、小米、果園草等)，而且也適用于其它的雙子葉植物(例如，煙草、含油種子油菜、棉花等)。因此，應該理解應用本發明的重組載體-宿主農作物系統的任何轉基因植物，都位于本發明的范圍內。
在下文中，將更詳細地描述本發明。
通過土壤桿菌介導的轉化作用表達枯草桿菌Protox基因的轉基因稻米植物，是由耐潮霉素的胼胝體改建的。
在轉基因稻米的T0、T1和T2代中，應用DNA、RNA、Westem雜交及其它生物化學的分析，調查枯草桿菌Protox基因整合入植物基因組，以及其在細胞液或質體和遺傳中的表達情況。
在本發明中，盡管可以應用來自腸道細菌如埃希氏大腸桿菌的Protox基因，但最好選用來自桿菌的Protox基因作為基因的來源。另外，最好選用具有泛素啟動子的重組載體。因為枯草桿菌的Protox與真核生物的Protox有相似的底物特異性，并且據悉來自密碼子用法與植物基因大不相同的微小動植物的基因表達很低[Cheng et al.，1998]，由于枯草桿菌Protox基因與植物基因的密碼子用法不同，植物中枯草桿菌Protox基因的表達應該是低的，人們普遍相信，在稻米中轉基因過度表達的泛素啟動子、調節基因和枯草桿菌Protox基因的聯合，有利于植物中枯草桿菌的Protox基因的最優表達。如果使用與本發明中相同的重組載體，在植物的質體中表達阿布屬Protox基因，那么轉基因表達與使用枯草桿菌Protox基因的情況相比可能會更高，或者由于Protox在阿布屬和稻米之間的遺傳同源而更低。無論如何，已經證實在轉基因的稻米中使用含有枯草桿菌Protox基因的重組載體，可以導致極好的產量(見下表)。表.表達阿布屬或枯草桿菌的Protox基因針對T1代中的質體的轉基因稻米的生長特性
轉基因稻米中枯草桿菌Protox基因的表達水平，極大地影響谷物的產量，與具有枯草桿菌Protox基因最優表達水平的C13-2的轉基因系相比，發現具有枯草桿菌Protox基因較高表達水平的C13-1的轉基因系的增產減少5-10％。因此，枯草桿菌Protox基因的最優表達水平，是增加農作物產量所必需的。枯草桿菌Protox基因的人工合成、適當的復制數導入植物基因組、和應用多種啟動子[例如，花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子、稻米肌動蛋白啟動子]的轉基因的最優表達，可以極大地增加農作物的產量。表.依照T1代中的啟動子，表達針對細胞液的枯草桿菌的Protox基因的、轉基因稻米的生長特性
如上表所示，泛素啟動子是更適宜表達枯草桿菌Protox基因的。
然而，當一種基因的密碼子用法與一種植物基因的密碼子用法相似時(例如，從植物、藻類、酵母等中游離的Protox基因)，應該通過使用能夠控制基因表達的一種調節基因，來獲得這些基因的最優表達。
與導入的枯草桿菌Protox基因的復制數增加一樣，它的表達水平也出現增加。因為轉基因復制數的增加所致的枯草桿菌Protox mRNA的數量增加，可以降低產量增加效應。這些觀察資料陳列于下表中。表.依據T1代中轉基因的復制數，表達枯草桿菌Protox基因的轉基因稻米的生長特性
另外，針對枯草桿菌Protox基因在轉基因植物中表達的Protox酶的Western雜交分析顯示，轉基因表達在轉基因植物中，針對質體的比針對細胞液的高。
附圖的簡要說明
圖1闡明Protox轉換肽(試驗中所應用的煙草cv.Samsun和煙草cv.KY160的煙草Protox序列的比較)的核苷序列的比較(A)，和推導出的氨基酸序列(B)以及(C)二元載體中T-DNA區域的示意圖。Ubi，玉米泛素；Tnos，胭脂堿合酶終止子；HPT，潮霉素磷酸轉移酶；Bs，枯草桿菌；Ts，轉換序列。
圖2闡明轉基因稻米中枯草桿菌Protox基因的Northern雜交分析。C，對照；Tc，轉基因的對照；C8，C13，靶細胞液的轉基因稻米系；P9，P21，靶質體的轉基因稻米系。
圖3闡明對照和轉基因稻米的生長。
圖4闡明轉基因稻米中枯草桿菌Protox基因的DNA(A)和RNA(B)雜交分析。C，對照；Tc，轉基因對照；C8，C13，靶細胞液的轉基因稻米系；P9，P21，靶質體的轉基因稻米系。
實現本發明的最好方式下文解釋適合本發明的具體方法。然而，發明中所用的方法和所引用的文獻中的方法可能進行了適當的修改。
來自煙草Protox的轉換序列的PCR克隆PCR釣魚轉換序列(PCR-fished transit sequence)的序列資料表明，長度為具有63個氨基酸的189個核苷，比報道的煙草Protox長11個氨基酸[Lermontova et al.1997]。除了在PCR釣魚的轉換肽中有12個連續伸展的絲氨酸殘基外，這兩種Protox演繹的氨基酸序列幾乎是完全相同的(
圖1)。然而，序列的變異似乎歸因于作為模板的煙草植物的不同的培育植物。序列具有轉換肽的共同特性，如富含絲氨酸/蘇氨酸和缺乏天門冬氨酸/谷氨酸/酪氨酸[von Heijne et al.，1989]。
轉化載體構建有許多二元載體可以用來轉化單子葉植物，尤其是稻米。幾乎所有的二元載體都可以從國際組織處獲得，例如CAMBIA(分子生物學應用于國際農業的中心，GPO Box 3200，Canberra ACT2601，澳大利亞)和大學學院。根據一種二元載體的基本骨架，能夠廣泛地修改Ti-質粒的左或右邊界區側面相接的轉化體可選擇的標記物、啟動子和終止子基因。
盡管在本發明的例證中使用了pGA1611[Kang et al.，1998]作為一種二元載體，但是也可以使用能夠有效表達Protox基因的其它載體，而不受任何特殊的限制。pCAMBIA1380 T-DNA和pCAMBIA1390T-DNA的二元載體可能適合例證，原因是它們與本發明中的pGA1611有密切的結構類似處，并且可以從CAMBIA處獲得。
稻米的轉化應用傳統的技術可以常規的實施轉化。農桿菌介導的轉化能夠完成植物轉化，并且可以使用以前的文獻[Paszkowsky et al.，1984]中所描述的技術。例如，以前的文獻中描述了經農桿菌介導的轉化的稻米的轉化技術[An et al.，1985]。應用PEG或電穿孔技術直接轉基因入原生質體和粒子炮擊入胼胝組織，可以完成單子葉植物的轉化。單個DNA物種或多個DNA物種(也就是，共轉化)能夠承擔轉化。這些轉化技術不僅能夠適用于包括煙草、西紅柿、向日葵、棉花、含油種子油菜、大豆、馬鈴薯等的雙子葉植物，而且也適用于包括稻米、大麥、玉米、小麥、黑麥、燕麥、turfgrass、小米、甘蔗、黑麥草、果園草等的單子葉植物。應用傳統技術把已經轉化的細胞改建入標準植物。
應用已知的分子生物學技術，利用pGA1611、pGA1611C和pGA1611的三基因構成物轉化植物。把這些基因構成物亞克隆入一種二元載體pGA1611，而pGA1611隱藏一種構成的泛素啟動子，認為這個泛素啟動子在植物中適當地表達，并且具有可作為一種選擇標記物的潮霉素磷酸轉移酶，且把它轉化為A.tumefaciens LBA4404。
自稻米(Oryza sativa cv.Nakdong)種子衍生的角質鱗片胼胝體與隱藏上述構成物的A.tumefaciens共培育。平均起來，有10-15％的胼胝體在含有50μg/mi潮霉素的選擇性培養基中生存下來。挑選的胼胝體在改建性培養基上轉移后，改建成嫩枝的比率為1-5％。由靶質體系(pGA1611P)出現的一些嫩枝在改建過程期間，傾向于在正常的光強度下變得蒼白。然而，通過先在暗光條件下生長1周，然后再轉移到在正常光條件下生長就能夠克服這種現象，這種嫩枝在正常光條件下就開始正常地生長而不在變得蒼白。它能夠解釋為，由于在質體中枯草桿菌Protox基因可能過度表達的這些轉基因系，正在把原卟啉原IX氧化成原卟啉IX，而下游的代謝過程又需要對植物細胞引起光毒性的原卟啉IX(資料沒有顯示)。總的來說，在細胞液或質體中表達具有pGA1611C和pGA1611P構成物的6種和58種不同的轉基因稻米系分別生長到成熟。作為對照，表達pGA1611載體的一種轉基因稻米也生長到成熟。大多數轉基因系顯然具有正常的表型，但是它們的種子產量依賴個體的轉基因系，范圍從4個到260個不等。
基因組DNA凝膠雜交分析為評價自潮霉素選擇性培養基改建的轉基因系的稻米基因組中枯草桿菌Protox基因的穩定整合，分別自靶細胞液的5個轉基因系(pGA1611C)和靶質體的6個轉基因系(pGA1611P)提取DNA，用HindIII消化，以及用32P-標記的枯草桿菌Protox基因雜交。由于在探針的轉基因內沒有HindIII位點，雜交帶的數目直接符合轉基因系的基因組中的轉基因的復制數。靶細胞液的轉基因系(C2，C5，和C6)顯示，在每條5kb以上的三條雜交帶周圍有多條帶，提示在稻米基因組中的不同部位有多個插入的轉基因(資料未顯示)。與此相反，C8和C13系在稻米基因組中有一種單一的復制插入。至于靶質體的轉基因系，6種中有5種具有一種單一的復制插入，只有P21系顯示有一種三復制插入(資料未顯示)。
在T1代的轉基因稻米中耐潮霉素特性的分離分別從T0代的自花授粉的個體轉基因稻米植物中收集種子，以用來評價T1代中耐潮霉素特性的分離。在這項評價中，利用包括1個轉基因對照(Tc)、2個靶細胞液系(C8和C13)和2個靶質體系(P9和P21)的5個轉基因稻米系。在含有50μg/ml潮霉素的1/2濃度MS培養基中發育這些種子，并且記錄這些種子自這種培養基中的存活率，以用來評價耐潮霉素特性的分離。結果列于下表1。表1.在T1代的轉基因稻米中耐潮霉素特性的分離。
在所檢查的全部的轉基因稻米系中除C8系外，潮霉素耐藥的與敏感的分離比率接近3∶1，表明稻米基因組中的轉基因是按照孟德爾氏遺傳表達的。然而，在C8系中發現潮霉素敏感性的比率很高。
T1代中轉基因稻米的RNA雜交分析把從含有潮霉素的培養基中存活下來的轉基因稻米系的個體(1個轉基因對照，Tc；2個靶細胞液的轉基因系，C8和C13；和2個靶質體的轉基因系，P9和P21)移植入稻田。在從對照(C)系和轉基因對照(Tc)系(圖2)的葉子中提取的總RNA中，沒有發現枯草桿菌Protox mRNA。在靶細胞液的轉基因系，C8和C13中，枯草桿菌ProtoxmRNA的表達水平相對較高。靶質體的轉基因系能夠有效地轉錄枯草桿菌Protox基因，在P21系中展示出了最高水平的轉基因表達。
根據轉基因的復制數和相對的mRNA表達水平之間的一些相關性，枯草桿菌Protox mRNA的表達水平，看來好象與稻米基因組中轉基因的復制數有關。隨著導入的枯草桿菌Protox基因復制數的增加，它的表達水平也增加(圖2轉基因的T1mRNA雜交測定)。隨著由于轉基因復制數的增加而增加的枯草桿菌Protox mRNA的數量，產量的增加作用下降(見敘述根據T1代中轉基因的復制數的轉基因稻米的生長特性的上表)。
檢測枯草桿菌Protox多肽使用針對枯草桿菌Protox的單克隆抗體(source，Rohm和HaasCo.)，應用免疫學方法檢測T1代的轉基因稻米中枯草桿菌Protox多肽的產生。從轉基因稻米系(1個轉基因對照，Tc；2個靶細胞液的轉基因系，C8和C13；和2個靶質體的轉基因系，P9和P21)的葉子中提取可溶性蛋白質，并且將其從凝膠電雜交到聚偏二氟乙烯膜。隨后，依照標準過程，應用針對枯草桿菌Protox的抗體進行雜交膜上多肽的免疫檢測。在所有檢測的轉基因稻米系中除轉基因對照外，都發現了與枯草桿菌Protox大小相當的蛋白質。
有趣地是，靶質體的轉基因系顯示的條帶強度比靶細胞液的高3-4倍。在轉基因系中發現的兩條小蛋白帶，可能是枯草桿菌Protox的降解產物。與此相反，僅僅在靶質體的轉基因系中，也發現了比枯草桿菌Protox約大4-5kDa的弱條帶。這條帶可能是枯草桿菌Protox的蛋白前體，具有不可消去的轉換序列。在微粒體的蛋白質中沒有發現抗體反應的蛋白(沒有顯示資料)。
總之，轉基因系中枯草桿菌Protox的降解產物、靶質體的轉基因系中的條帶強度比靶細胞液轉基因系中的高、以及存在枯草桿菌Protox蛋白前體的發現，間接給轉基因系中枯草桿菌Protox的表達提供了強有力的證據。
T2代中轉基因稻米DNA和RNA的印跡雜交分析把從T1代的轉基因稻米植物中收集的種子進行發育并常規移植入一塊稻田。在稻田中，每種轉基因系培育40棵植物。在移植后5周，依照葉子部分在含有100mg/l潮霉素的蒸餾水中的壞死反應，分別從單個轉基因植物中收集葉子，以便檢查轉基因表達。分析耐潮霉素轉基因系是否在T2代中穩定表達枯草桿菌Protox基因。與T1代中一樣，在T2代的靶細胞液轉基因系(C8和C13)和靶質體轉基因系(P9和P21)中發現了枯草桿菌Protox的表達，但是在對照組和轉基因對照組中則無表達[圖4(A)]。RNA印跡雜交分析證實，導入的枯草桿菌Protox基因在T2代中穩定表達。枯草桿菌Protox mRNA表達的水平，在靶細胞液轉基因系(C8、C13-1和C13-2)之間以及在靶質體轉基因系(P9和P21)之間是不同的[圖4(B)]。
另外發現，與具有枯草桿菌Protox基因最優表達水平的轉基因系(圖4，C13-2)相比，具有較高枯草桿菌Protox基因表達水平的轉基因系(圖4，C13-1)產量增加降低5-10％。
將提交下列的典型例證具體地解釋本發明。然而，這些例證僅僅是說明本發明的，并不是以任何方式局限本發明。
例證例證1稻米轉化載體的構建有兩種類型的枯草桿菌Protox基因構成物可以用來轉化稻米。pGA1611載體作為一種啟動的二元載體，按下列方法構建把作為一種抗生素耐藥基因的耐潮霉素基因[Gritz和Davies，1983；NCBIaccession No.，K01193]，調節耐潮霉素基因的CaMV35S啟動子[Gardner等.，1981)；Odell等.，1985；NCBI accession No.，V00140]，和用于終止轉錄的、章魚肉堿型TiA6質粒的第7轉錄產物中轉錄的終止區插入一種裝配型質粒載體pGA482[An等，1988]。把泛素基因導入[Christensen等.，1992；NCBI accession No.，S94464]BamHI/PstI位點，用于表達外源基因，并且把胭脂堿合成酶基因[Bevan等.，1983；NCBI accession No.，V00087]轉錄的終止區，放在具有唯一限制性酶切位點(HindIII，SacI，HpaI和KpnI)的克隆區。
構建細胞液中表達枯草桿菌Protox基因的一種質粒pGA1611C。用SacI和KpnI消化多聚酶鏈式反應擴增的枯草桿菌Protox基因的全長，并且將其連接入用同樣的限制性內切酶預先消化了的pGA1611二元載體，結果形成在玉米泛素啟動子控制之下插入的Protox基因。另一種構成物，pGA1611P，是為了將枯草桿菌Protox基因靶入質粒所設計的(
圖1)。用下劃線標出用于方便亞克隆所設計的SacI引物位點。自GenBank數據庫(許可證號，Y13465)中獲得煙草(Nicotianatabacum cv.Samsun NN)Protox序列。
使用依照煙草(N.tabacum cv.Samsun NN)Protox序列資料設計的特異性引物，應用PCR方法構建載體。使用包含一種HindIII位點(劃線部分)的正向引物5’-d(TATCAAGCTTATGACAACAACTCCCATC)-3’、包含一種SacI位點(劃線部分)的反向引物5’-d(ATTGGAGCTCGGAGCATCGTGTTCTCCA)-3’和煙草(N.tabacum cv.KY160)基因組的DNA作為模板來擴增轉換肽。用HindIII和SacI消化PCR產物，經凝膠純化后，在pBluescript(市場上可買得到)內連接到同樣的限制性位點上。在鑒定了序列完整性后，把轉換序列的HindIII和SacI片段連接到pGA1611C的相同的限制性酶切位點中，結果構建成已經把轉換肽插入在枯草桿菌Protox基因前面的pGA1611P。
圖1說明的是二元載體中T-DNA區域的模式圖。
圖1中所應用的縮寫如下所示Ubi，玉米泛素；Tnos，胭脂堿合成酶3’-終止信號；P35S，CaMV35S啟動子；HPT，潮霉素磷酸轉移酶；Ts，轉換序列。
例證2稻米的轉化和改建隱含pGA1611、pGA1611C和pGA1611P的A.tumefaciensLBA4404在添加5μg/ml四環素和40μg/ml潮霉素的YEP培養基((1％Bacto-peptone，1％Bacto-yeast extract，0.5％NaCl)中，在28℃下過夜生長。將培養液離心，并且在相同體積的含有100μM乙酰丁香酮的AA培養基[Hiei等，1997]中懸浮沉淀物。在N6培養基[Rashid等，1996，Hiei等，1997]上從稻米(cv.Nakdong)種子的角質鱗片中誘導胼胝體。把3-4周大小的緊密胼胝體浸透在細菌懸浮液中3分鐘，用消毒的過濾紙印干，去除多余的細菌。把胼胝體轉移到一種共培養的培養基，然后在黑暗中25℃的情況下培養2-3天。用含有250mg/l頭孢塞肟菌素的消毒蒸餾水洗滌共-培養的胼胝體，將其轉移到含有250mg/l頭孢塞肟菌素和50mg/l潮霉素的N6培養基。選擇3-4周后，把胼胝體轉移到一種再生性培養基，進行嫩枝和根部發育。根部充分發育后，把轉基因植物轉移到溫室，生長到成熟。
根據布達佩斯條約，本發明中用pGA1611C和pGA1611P載體轉化的A.tumafecians已經于1999年11月15日保藏在國際保藏單位(Korean Collection for type Cultures，Korea Research Institute ofBioscience和Biotechnology，52 Auheun-dong，Yusung-ku，Taejon305-333，Korea)，分別是KCTC0692BP和KCTC0693BP。
例證3大豆的轉化和改建隱含pGA1611、pGA1611C和pGA1611P的A.tumefaciensLBA4404在添加5μg/ml四環素和40μg/ml潮霉素的YEP培養基((1％Bacto-peptone，1％Bacto-yeast extract，0.5％NaCl)中，在28℃下過夜生長。將培養液離心，并且在相同體積的含有100μM乙酰丁香酮的B5培養基[Gamborg等，1968]中懸浮沉淀物。縱向受傷的子葉組織與細菌懸液在24℃下共培養3天，然后將共-培養的胼胝體轉移到B5復蘇培養基和一種改建培養基中繼續產生T0代大豆。
例證4適合于大麥、小麥、黑麥草和馬鈴薯的轉化載體的構建自pGA1611C和pGA1611P二元載體，用BamHI/ClaI消化包括泛素啟動子、枯草桿菌Protox基因和胭脂堿合成酶基因的3’終止區的基因，并將其連接入pBluscript II SK克隆載體(Strategene，USA)內同樣的限制性酶切位點處，結果形成構建的pBSK-Protox載體。用ClaI/SalI自pGA1611C消化章魚肉堿型TiA6質粒中CaMV35S啟動子區耐潮霉素基因轉錄終止區，并且將其連接入pBSK-Protox載體內，結果形成構建的pBSK-Protox/潮霉素載體，用作使用基因槍的轉化載體。
例證5大麥、小麥、黑麥草和馬鈴薯的轉化和改建使用角質鱗片衍生的胼胝體作為大麥、小麥和黑麥草轉化的外植體[Spangenberg等，1995；Koprek等，1996；Takumi和Shimada，1997]，而馬鈴薯轉化所用的是子葉組織。通過使用一種biolisticPDS-1000/He微粒傳遞系統(Bio-Rad)，把用1.6-μm直徑金制的微粒包裹的pBSK-Protox/潮霉素載體DNAs炮擊入大麥、小麥、黑麥草和馬鈴薯的外植體中。在4℃情況下，在包括0.1M Tris緩沖液(pH7.0)，5mM β-巰基乙醇和1片/10ml的完全的蛋白酶抑制劑[CompleteMini；Boehringer Mannheim]的1ml的均質培養基中，從轉化的植物中提取枯草桿菌Protox蛋白質。通過2層的微孔布(CalBiochem)過濾組織勻漿，然后以3000g的轉速離心10分鐘。以100,000g的轉速離心由此形成的上清液60分鐘，得到粗制的微粒體的沉淀。在100μl的均質緩沖液中再次懸浮沉淀，應用再次懸浮的20μg蛋白質沉淀進行針對微粒體片段的免疫印跡，而應用100,000g轉速的15μg蛋白質的上清夜作為可溶解的蛋白質。應用10％的(w/v)acrylamide/bis凝膠，對可溶解的和微粒體的蛋白質進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。在電泳之后，把蛋白質印跡到聚偏二氟乙烯膜，并且隨后用針對枯草桿菌Protox的單克隆抗體進行免疫雜交。依照制造商的說明書(ECL Kit；Boehringer Mannheim)，應用增強的化學發光系統進行第二抗體的使用和檢測條帶。
測試1轉基因稻米的生長結果從例證2中改建的轉基因稻米植物中收集種子，并且把耐潮霉素的秧苗移植入一塊稻田。轉基因稻米的生長結果顯示在表2-5。表2顯示T1代中轉基因稻米在不同生長時期時的植物高度。表2.T1代中轉基因稻米在不同生長時期時的植物高度
如表2所示，靶細胞液轉基因稻米顯示出植物高度顯著高于對照10厘米表3、4和5分別顯示了T1代中轉基因稻米的分蘗數、數量特性和產量組分。表3.T1代中轉基因稻米在不同生長時期時的分蘗數(圓括號中的數字是相對于對照的百分數)
表4.T1代中轉基因稻米的數量特性
表5.T1代中轉基因稻米的產量組分
如表3、4和5所示，本發明明顯地改善了轉基因稻米中的數量特性，也就是有效的分蘗比率，并且它們的谷物產量和分蘗也增加了2倍。
測試2轉基因的大麥、小麥、大豆、意大利黑麥草和馬鈴薯的生長結果檢查與例證2中同樣改建的所有的轉基因單子葉植物(大麥、小麥)、雙子葉植物(大豆、馬鈴薯)和草料農作物(意大利黑麥草)的生長特性。在轉基因的大麥中發現谷物產量增加了18-27％(表6)。在轉基因的小麥(表7)和大豆(表8)中，發現谷物產量分別增加了14-25％和23-28％。在轉基因的意大利黑麥草中，嫩枝鮮重增加了51％(表9)。表10顯示轉基因的馬鈴薯的產量特性。嫩枝和塊莖鮮重都增加13-18％。這些結果證明，枯草桿菌Protox基因的產量增加效應，不僅廣泛地適用于包括稻米的單子葉的植物，而且也適用于草料農作物和雙子葉的植物。表6.轉基因大麥的產量特性
表7.轉基因小麥的產量特性
表8.轉基因大豆的產量特性
表9.轉基因的意大利黑麥草的產量特性
表10.轉基因馬鈴薯的產量特性
工業實用性因為根據本發明已經證實的、通過應用含有Protox基因的重組載體，轉化一種宿主農作物，可使農作物的產量和單位面積內的數量明顯增加，那么就有可能解決食物短缺問題，以及應用本發明，有可能獲得增強利用包括草料農作物在內的植物資源。
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序列表<110>白鏡煥(BACK，Kyoung Whan)李熙載(LEE，Hee Jae)具滋(GUM，Ja Ock)<120>用原卟啉原氧化酶基因增加農作物產量或單產的方法<130>PC00018-BKH<150>KR10-1999-0043860<151>1999-10-11<150>KR10-1999-0052478<151>1999-11-24<150>KR10-1999-0052492<151>1999-11-24<160>3<170>KOPATIN 1.55<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>1TATCAAGCTT ATGACAACAA CTCCCATC 28<210>2<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>2ATTGGAGCTC GGAGCATCGT GTTCTCCA 28<210>3<211>189<212>DNA<213>Nicotiana煙草(Nicotiana tabacum)<220><221>基因<222>(1)..(189)<223>Protox轉換序列<400>3ATGACAACAA CTCCCATCGC CAATCATCCT AATATTTTCA CTCACCGGTC ACCGCCGTCC60TCCTCCTCCT CCTCCTCCTC CTCCTCCTCG TCTCCATCGG CATTCTTAAC TCGTACGAGT120TTCCTCCCTT TCTCTTCCAT CTCGAAGCGC AATAGTGTCA ATTCGAATGG CTGGAGAACA180CGATGCTCC 189
權利要求
1.一種通過應用含有原卟啉原氧化酶(Protox)基因的重組載體轉化一種宿主植株，增加農作物產量或單位面積數量的方法。
2.根據權利要求1中所述的方法，其中所述的基因是一種原核細胞基因。
3.根據權利要求2中所述的方法，其中所述的原核細胞基因來源自一種桿菌或者一種腸道細菌。
4.根據權利要求1中所述的方法，所述的重組載體有一種泛素啟動子。
5.根據權利要求1中所述的方法，所述的重組載體以宿主植株的細胞胞質或者質粒為目標。
6.一種重組載體，包含有原卟啉原氧化酶(Protox)基因、泛素啟動子和潮霉素磷酸轉移酶選擇性標記物。
7.根據權利要求6所述的重組載體，所述的原卟啉原氧化酶(Protox)來源自枯草桿菌(Bacillus subtilis)。
8.應用根據權利要求6提及的重組載體轉化的一種土壤桿菌屬瘤(Agrobacterium tumefaciens)。
9.根據權利要求8中所述的土壤桿菌屬瘤是一種土壤桿菌屬瘤的LBA4404/pGAl611C(KCTC0692BP)或者一種土壤桿菌屬瘤的LBA4404/pGA1611P(KCTC0693BP)。
10.一種植物細胞，應用根據權利要求8或者根據權利要求9中的土壤桿菌屬瘤轉化。
11.根據權利要求10中所述的植物細胞是一種單子葉植物。
12.根據權利要求11中所述的單子葉植物中植物細胞，是從大麥、玉米、小麥、黑麥、燕麥、草皮草、甘蔗、小米、黑麥草、果園草和稻米群體中挑選出來的。
13.根據權利要求10中所述的植物細胞是一種雙子葉植物。
14.根據權利要求13中所述的植物細胞，上述的雙子葉植物中是從大豆、煙草、含油種子油菜、棉花和馬鈴薯群體中挑選出來的。
15.一種植株源自對權利要求10中的植物細胞的重建。
16.一種植物的種子是從權利要求15中提及的植株中收獲的。
全文摘要
本發明涉及通過加強光合作用的效率，來增加農作物產量或單位面積內的數量的一種方法，其中包括用含有原卟啉原氧化酶(Protox)基因的載體轉化一種宿主農作物。
文檔編號A01H5/00GK1461345SQ00814125
公開日2003年12月10日 申請日期2000年10月10日 優先權日1999年10月11日
發明者白鏡煥, 李熙載, 具滋玉, 李省范 申請人:白鏡煥, 李熙載, 具滋玉