專利名稱：在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)擔子菌綱真菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在含水液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)擔子菌綱真菌的有效的新方法，或更具體地，本發(fā)明涉及一種在含水液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)擔子菌綱食用真菌，以獲得所述真菌的數(shù)厘米大小的菌體團聚體的方法，所述真菌如蘑菇Agaricus Blazei Murill，香菇小絲膜菌(Cortinellus shiitake)，Lyophyllumaggregatum，Pleurotus ostreatus等。本發(fā)明還涉及實踐所述培養(yǎng)方法的生物反應器。
背景技術(shù)：
在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)擔子菌綱真菌的方法是已知的，如美國專利2,693,665、2,761,246和2,850,841等?，F(xiàn)有技術(shù)中一種典型的液體培養(yǎng)基在每升中包含50g蔗糖，10g硝酸銨，5g磷酸鈉，2.5g硫酸鎂，和0.2g硫酸亞鐵。接種了真菌菌體如菌絲體的液體培養(yǎng)基通常用較低轉(zhuǎn)速的攪拌器溫和攪拌并通氣數(shù)天，使菌絲體長成直徑3-40mm的球形或多面形粒狀團聚體。這種菌絲體團聚體被認為借助菌絲體表面形成的、作用類似粘合劑的粘性多糖物質(zhì)而形成。但現(xiàn)有技術(shù)中這些方法的產(chǎn)率很低，其原因包括該真菌的低生長速率以及當真菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時回收真菌遇到的困難。
本發(fā)明因此旨在提供在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)擔子菌綱真菌，如蘑菇Agaricus Blazei Murill(本文稱為蘑菇屬真菌)等的有效工業(yè)化新方法。本發(fā)明的第二個目的是提供適于在真菌液體培養(yǎng)基中實施上述培養(yǎng)方法的新的生物反應器。
發(fā)明公開因此，本發(fā)明在含水液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)擔子菌綱真菌的方法包括以下步驟(a)在含有提供氮、磷酸和鉀的無機營養(yǎng)鹽的液體培養(yǎng)基中接種真菌菌體如菌絲體；
(b)將該液體培養(yǎng)基與粗制甘蔗糖混合，所述甘蔗糖的量為每升液體培養(yǎng)基50-70g蔗糖；(c)將該液體培養(yǎng)基與不溶于水的支持生長的物質(zhì)混合，所述支持生長的物質(zhì)選自粉碎的甘蔗、甘蔗渣、和麩皮，其量為每升液體培養(yǎng)基0.2-15g干重；(d)使該液體培養(yǎng)基在20-30℃一直攪拌；(e)在0.12-0.5MPa(絕對值)的壓力下，以至少0.01升/min/升液體培養(yǎng)基的速率，向該液體培養(yǎng)基中通以富含氧的空氣，該富氧空氣中至少30％的體積，或優(yōu)選60-90％的體積為氧氣。
實施本發(fā)明上述培養(yǎng)方法的生物反應器包括(A)一個可承受壓力的容器，其用于容納液體培養(yǎng)基；(B)一個進氣管，其能以0.12-0.5MPa(絕對值)的超大氣壓力將富含氧的空氣吹入液體培養(yǎng)基；(C)一個出氣管，其具有將可承受壓力的容器內(nèi)的壓力調(diào)節(jié)在0.12-0.5MPa(絕對值)范圍內(nèi)的裝置(means)；和(D)一種裝置，其能對所述可承受壓力之容器內(nèi)容納的液體培養(yǎng)基進行攪拌。
附圖簡述
圖1是實施本發(fā)明方法的一種典型生物反應器系統(tǒng)的剖視圖。
圖2是實施本發(fā)明方法的另一種生物反應器系統(tǒng)的剖視圖。
圖3是實施本發(fā)明方法的又一種生物反應器系統(tǒng)的剖視圖。
圖4是實施本發(fā)明的連續(xù)方法的生物反應器系統(tǒng)剖視圖。
圖5顯示蘑菇屬真菌在各種液體培養(yǎng)基中的生長曲線。
圖6顯示從配備了氣體旋流器(cyclone)(實線)或未配備(虛線)的生物反應器中出來的薄霧中蘑菇屬真菌的菌絲體濃度。
實施本發(fā)明的最佳模式如上述，本發(fā)明培養(yǎng)擔子菌綱真菌，或主要是蘑菇屬真菌的方法，其特征在于液體培養(yǎng)基的組成和在這種液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的條件。當在最優(yōu)選條件下培養(yǎng)時，只要培養(yǎng)基中提供了足夠的營養(yǎng)，真菌菌體的團聚體就可快速生長至直徑10-20mm，但團聚體的核心有時表現(xiàn)為黑色，可能是液體培養(yǎng)基中局部缺乏溶解氧的結(jié)果。該問題可如下解決，即通過將培養(yǎng)基中溶解氧的濃度增加至15-30mg/L，以使真菌團聚體經(jīng)3-4天的連續(xù)培養(yǎng)可生長至直徑約40mm而核心部分不發(fā)黑。
無機營養(yǎng)鹽的種類和濃度無特殊限制，可常規(guī)包括10-15g/L硝酸銨作為氮源，5-7g/L磷酸鈉作為磷酸鹽來源，3-7g/L硫酸鉀或磷酸氫二鉀作為鉀離子來源，2.5-3.5g/L硫酸鎂和0.2-0.3g/L硫酸亞鐵。
本發(fā)明培養(yǎng)方法中所用的液體培養(yǎng)基的特征是，與作為碳源的蔗糖混合，所述蔗糖并非純糖形式，而是粗制甘蔗糖。粗制甘蔗糖在液體培養(yǎng)基中的起始量相當于純蔗糖40-200g/L。加入培養(yǎng)基的蔗糖必需是粗制甘蔗糖而非甜菜糖。但對粗制甘蔗糖的這一限制原因不明，假定，來自甘蔗或甜菜的粗制糖除了糖以外總是含有相當量的雜質(zhì)，粗制糖雜質(zhì)的種類在粗制甘蔗糖和粗制甜菜糖中不同，粗制甘蔗糖中所含雜質(zhì)，包括某些金屬元素如鎂、鋅和鈷以及其它不明痕量元素對于促進蘑菇屬真菌的生長特別有效。
另一特征是，使本發(fā)明所用液體培養(yǎng)基與不溶于水的支持生長的物質(zhì)混合，所述支持生長的物質(zhì)選自粉碎的甘蔗、甘蔗渣、和麩皮以及粉碎的松樹組織，包括木質(zhì)部分、樹葉和果實，所述支持生長的物質(zhì)的量為0.2-15g干物質(zhì)/L。加入培養(yǎng)基中的這種支持生長的物質(zhì)應為能通過100目(mesh)，或優(yōu)選200目(在Tyler標準中)篩孔的精細顆粒。這些支持生長的物質(zhì)顆?？勺鳛檎婢鷪F聚體更穩(wěn)定生長的核心。
本發(fā)明人當然已進行了廣泛篩選試驗，以排除來自各種植物的其它支持生長的物質(zhì)，包括細顆粒形式的玉米(Indian com)的莖和葉、米糠、大麥谷粒及桑椹的葉子和其它部分，結(jié)論是，所述支持生長效應和穩(wěn)定效應特異性針對粉碎的甘蔗、甘蔗渣、麩皮以及松樹組織。
當在上述液體培養(yǎng)基中實施本發(fā)明培養(yǎng)擔子菌綱真菌如蘑菇屬真菌的方法時，第一步是在含有上述各種成分的液體培養(yǎng)基中接種真菌菌體，優(yōu)選接種真菌的菌絲體。
導致本發(fā)明的最意外的發(fā)現(xiàn)是，通過向上述液體培養(yǎng)基中加壓吹入富含氧的空氣，致使溶解氧濃度為至少7mg O2/L液體培養(yǎng)基，從而在富氧條件下實施本發(fā)明的培養(yǎng)方法，可大大促進蘑菇屬真菌的生長并獲得穩(wěn)定性。為了實現(xiàn)溶解氧的這一濃度，吹進液體培養(yǎng)基中的富氧空氣含有至少30％體積的氧氣，或優(yōu)選30-90％體積的氧氣，且富氧空氣被加以0.12-0.5MPa(絕對值)的壓力。富氧空氣的吹氣速率當然比較重要，應至少0.01L/min/L液體培養(yǎng)基。吹氣速率沒有特定的上限，但考慮到由生物反應器的出氣管排出的薄霧逐漸消散，吹氣速率優(yōu)選為0.01-1.0L/min/L液體培養(yǎng)基。顯然，吹入液體培養(yǎng)基中的富氧空氣必須是無菌的，例如使其通過適當濾膜以使該液體培養(yǎng)基被各種(可能抑制所需擔子菌綱真菌穩(wěn)定生長的)微生物污染的危險性減至最小。
為了獲得最佳培養(yǎng)效果，培養(yǎng)蘑菇屬真菌的溫度當然十分重要。擔子菌綱真菌的培養(yǎng)溫度通常應為20-30℃，應在該范圍內(nèi)針對具體真菌物種選擇最佳培養(yǎng)溫度。當溫度太低或太高時，真菌的生長速率降低，這是不利的當滿足以上各種因素的要求時，在分批方法中培養(yǎng)蘑菇屬真菌可在兩至三天內(nèi)完成。
這里應注意，真菌快速生長的結(jié)果是，真菌菌體對碳源營養(yǎng)的同化作用產(chǎn)生大量二氧化碳氣體。除非氣相中二氧化碳被充分除去，真菌菌體的生長會由于液體培養(yǎng)基的pH值降低而被抑制，所述pH值有時降至3.5或更低，這種pH值的降低是真菌菌絲體的酸性外分泌造成的，其伴有由于液體培養(yǎng)基上層氣相中氧分壓的降低所致的溶解氧濃度的降低。
以下通過參照附圖舉例說明本發(fā)明的培養(yǎng)方法以及用于該方法的生物反應器。
圖1是一種生物反應器系統(tǒng)，其包括一個由可承受壓力的柱體1構(gòu)成的培養(yǎng)容器，在該容器1的下部有帶分流器5A的進氣管5，出氣管6與該容器1的上部相連，帶有漿葉的攪拌器7由頂部的發(fā)動機M驅(qū)動從而溫和攪拌液體培養(yǎng)基2。富氧空氣被壓縮機3加壓通過進氣管5吹進液體培養(yǎng)基2，其間在壓力控制器8所調(diào)節(jié)的特定壓力下通過除菌濾膜4除菌。容器1中液體培養(yǎng)基2上層的氣相壓力通過一個恒壓閥在與出氣管6相連的排氣壓力調(diào)節(jié)器6A的控制下進行調(diào)控。任選使一部分排出的空氣回流到進氣管道，從而與輸入的新鮮空氣混合。
圖2是另一種實施本發(fā)明方法的生物反應器系統(tǒng)，該系統(tǒng)配備有二氧化碳濃度控制器9，通過送風機12驅(qū)散過量二氧化碳，還有一個氧氣調(diào)節(jié)器10與氧濃度控制器11相連。容器1中液體培養(yǎng)基2上層通過排氣管6排出的富氧空氣又通過送風機12循環(huán)至進氣管5，并在控制器9中除去部分二氧化碳氣體。
圖3是又一種實施本發(fā)明方法的生物反應器系統(tǒng)。當在培養(yǎng)基2中接種擔子菌綱真菌菌絲體時，有時會出現(xiàn)以下情況，即由于吹入富氧空氣導致產(chǎn)生培養(yǎng)基2的薄霧，其含有所培養(yǎng)的真菌的菌絲體，這些薄霧可隨空氣的排出而排出，導致菌絲體沉積在該系統(tǒng)的各個部位，包括除菌濾膜4，排氣閥，管道內(nèi)壁等，使這些部位被阻塞，從而中斷培養(yǎng)。為避免這種情況，給生物反應起系統(tǒng)配備一個濕旋流器13，分隔在旋流器13中并沉積的菌絲體用送入其中的液體洗脫至該旋流器13的錐部。含有如此洗下的菌絲體的洗脫液被排到旋流器13的底部，由與之相連的接收池14接收，液體從這里通過泵P1以壓力控制器16所控制的壓力被送回到反應容器1。通過仔細設(shè)計和操作，可將擔子菌綱真菌的培養(yǎng)過程不間斷的持續(xù)四天或甚至更長的時間。
圖4是適于本發(fā)明的連續(xù)方法的生物反應器系統(tǒng)，其中真菌培養(yǎng)產(chǎn)生的二氧化碳氣體通過運行二氧化碳吸收器18而除去。所含二氧化碳濃度已降低的那些空氣經(jīng)由一個二氧化碳濃縮控制器9回到培養(yǎng)系統(tǒng)。進氣管5周圍繞著套管19，該套管能使其內(nèi)部的培養(yǎng)基向上流動，從而在缺乏機械攪拌裝置如攪拌器的情況下提高真菌團聚體的生長速率。在經(jīng)由管道23添加營養(yǎng)成分的制備池22中所制備的液體培養(yǎng)基2經(jīng)顯微濾膜或超濾膜20、21循環(huán)后除去懸浮的真菌菌絲體。
下文借用實施例詳述本發(fā)明的方法，其中以蘑菇屬真菌作為擔子菌綱真菌的一個代表物種。
實施例1在容積為1升的耐壓柱狀不銹鋼生物反應器容器中裝載1升液體培養(yǎng)基，每升該液體培養(yǎng)基中含60g純蔗糖、10g硝酸銨、5g磷酸鈉、2.5g水合硫酸鎂MgSO4·7H2O、5g磷酸氫二鉀K2HPO4和0.2g水合硫酸亞鐵FeSO4·7H2O。
在如此制備的液體培養(yǎng)基中接種相當于3mg蘑菇屬真菌菌絲體干重的、污染了放線菌的真菌，于25℃溫和攪拌3天以獲得相當于25g真菌顆粒干重的產(chǎn)物。
從如此獲得的大量顆粒中挑出兩個無真實細菌可觀察到之固有著色的真菌顆粒，在干凈的長形工作臺上粉碎。將1升另一種液體培養(yǎng)基與該粉碎的真菌顆粒一起接種，分批培養(yǎng)，其中所述另一種液體培養(yǎng)基在每升中含有60g粗制甘蔗糖(其相當于58g蔗糖)、10g粉碎的甘蔗干粉(其顆粒細度能通過200目的篩孔)、12g硝酸銨、4g磷酸鈉、2.5g水合硫酸鎂、0.2g水合硫酸亞鐵和5g磷酸氫二鉀(溶于或分散于每升該液體培養(yǎng)基中)。在相同條件下將該分批過程重復一次后，將真菌菌絲體在常規(guī)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)以獲得不含雜質(zhì)的真菌菌體顆粒。
類似的無污染蘑菇屬顆粒可通過在相同的液體培養(yǎng)基中接種污染了放線菌但已用刀刮去被放線菌污染的著色部分的原始顆粒而獲得。
實施例2在與圖3所示旋流器相連的1升容積的耐壓不銹鋼生物反應器容器中裝載1升第一種液體培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基A，其在每升中含有60g純蔗糖、10g硝酸銨、5g磷酸鈉、2.5g水合硫酸鎂、0.2g水合硫酸亞鐵和7g磷酸氫二鉀(溶于其中)。
在另一個1升容積的耐壓不銹鋼生物反應器容器中裝載1升第二種培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基B，其在每升中含有50g粗制甘蔗糖、15g甘蔗渣干粉(其顆粒細度能通過200目的篩孔)、12g硝酸銨、4g磷酸鈉、2.5g水合硫酸鎂、0.2g水合硫酸亞鐵和6g磷酸氫二鉀(溶于或分散于每升該液體培養(yǎng)基中)。
分別在培養(yǎng)基A和B中接種實施例1所得無污染的蘑菇屬真菌顆粒，于25℃溫和攪拌培養(yǎng)，并以0.8L/min的速度向培養(yǎng)基中吹進含30-35％體積之氧氣的富氧空氣。將吹進液體培養(yǎng)基的富氧空氣的壓力控制在最初24小時將向上流的壓力保持在0.12-0.15MPa(絕對值)，在第2-4天保持在0.15-0.30MPa(絕對值)，而向下流的壓力始終保持在0.10-0.13MPa(絕對值)。
在液體培養(yǎng)基(A)和(B)中培養(yǎng)5天后所得真菌團聚體(干物質(zhì))的量分別示于圖5的曲線A和B。圖5中曲線A顯示未用攪拌器驅(qū)動攪拌的液體培養(yǎng)基(A)中所得結(jié)果。圖5中曲線C顯示在與液體培養(yǎng)基(A)基本相同、但以等量葡萄糖取代蔗糖的常規(guī)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得的結(jié)果。
實施例3用液體培養(yǎng)基(B)重復實施例2中蘑菇屬真菌的培養(yǎng)過程。培養(yǎng)24小時后，該液體表面覆蓋了大量泡沫，將它們撇出并保留。用新鮮的液體培養(yǎng)基(B)以實施例2的相同方式進行另一輪蘑菇屬真菌培養(yǎng)，培養(yǎng)3小時后，液體培養(yǎng)基與儲備(reserve)在上層占該液體培養(yǎng)基10％體積的泡沫混合，以繼續(xù)再培養(yǎng)多達5天。
該輪培養(yǎng)所得結(jié)果與圖5中曲線B所示基本相同，表明泡沫可抑制真細菌和真菌的抗微生物活性。
實施例4以如實施例1所述的相同方式，在配備有圖3所示旋流器的生物反應器或不含旋流器的相同生物反應器中實施蘑菇屬真菌的相同培養(yǎng)過程4天。分析以被所排出空氣攜帶的方式由生物反應器流出的液體中，伴隨薄霧而出的蘑菇屬菌絲體的含量，得到圖6中實線所示的結(jié)果，圖中虛線分別指加或不加旋流器的培養(yǎng)所得結(jié)果。如該圖所示，薄霧中蘑菇屬菌絲體的含量當配備有旋流器時一直未超過0.1g干重/L液體，而未配備旋流器時，菌絲體含量達到0.4g干重/L液體。
權(quán)利要求
1.一種在含水液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)擔子菌綱真菌的方法，其包括以下步驟(a)在含有能提供氮、磷酸和鉀的無機營養(yǎng)鹽的液體培養(yǎng)基中接種真菌菌體；(b)將該液體培養(yǎng)基與粗制甘蔗糖混合，所述甘蔗糖的量相當于每升液體培養(yǎng)基50-70g蔗糖；(c)將該液體培養(yǎng)基與不溶于水的支持生長的物質(zhì)混合，所述支持生長的物質(zhì)選自粉碎的甘蔗、甘蔗渣、松樹組織、和麩皮，其量為每升液體培養(yǎng)基0.2-15g干重；(d)使該液體培養(yǎng)基在20-30℃一直攪拌；(e)在0.12-0.5MPa(絕對值)的壓力下，以至少0.01升/min/升液體培養(yǎng)基的速率，向該液體培養(yǎng)基中通以富含氧的空氣，該富氧空氣中至少30％的體積為氧氣。
2.權(quán)利要求1的在含水液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)擔子菌綱真菌的方法，其中在步驟(c)中加入液體培養(yǎng)基的不溶于水的支持生長之物質(zhì)為顆粒大小能通過100目篩孔的粉末形式。
3.權(quán)利要求2的在含水液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)擔子菌綱真菌的方法，其中在步驟(c)中加入液體培養(yǎng)基的不溶于水的支持生長之物質(zhì)為顆粒大小能通過200目篩孔的粉末形式。
4.權(quán)利要求1的在含水液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)擔子菌綱真菌的方法，其中步驟(e)中吹進液體培養(yǎng)基的富氧空氣含有30-90％體積的氧氣。
5.權(quán)利要求1的在含水液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)擔子菌綱真菌的方法，其中步驟(e)中向液體培養(yǎng)基吹進富氧空氣的速率為0.01-1.0升/min/升液體培養(yǎng)基。
6.權(quán)利要求1的在含水液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)擔子菌綱真菌的方法，其進一步包括以下步驟(f)控制液體培養(yǎng)基上層氣相中二氧化碳的濃度。
7.一種在含水液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)擔子菌綱真菌的生物反應器，其包含(A)一個可承受壓力的容器，其用于容納液體培養(yǎng)基；(B)一個進氣管，其能以0.12-0.5MPa(絕對值)的超大氣壓力將富含氧的空氣吹入液體培養(yǎng)基；(C)一個出氣管，其具有將可承受壓力之容器內(nèi)的壓力調(diào)節(jié)在0.12-0.5MPa(絕對值)范圍內(nèi)的裝置；和(D)一種裝置，其能對所述可承受壓力之容器內(nèi)容納的液體培養(yǎng)基進行攪拌。
8.權(quán)利要求7的在含水液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)擔子菌綱真菌的生物反應器，其進一步包括(E)一種裝置，其能對所述可承受壓力之容器內(nèi)容納的液體培養(yǎng)基上層氣相中二氧化碳的濃度進行調(diào)節(jié)。
9.權(quán)利要求7的在含水液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)擔子菌綱真菌的生物反應器，其進一步包括(F)一種與出氣管(C)相連的旋流器，其用于除去排出富氧空氣時所帶出的薄霧。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)食用型擔子菌綱真菌如蘑菇類Agaricus Blazei Murill以產(chǎn)生幾厘米大小的真菌團聚體的有效方法。特征性地,該液體培養(yǎng)基以粗制甘蔗糖類形式的蔗糖為碳源,還含有不溶于水的可支持生長的細粉狀物質(zhì)作為真菌團聚體的核心,這種細粉狀物質(zhì)選自粉碎的甘蔗、甘蔗渣、松樹和麩皮。進一步特征性地,培養(yǎng)過程在富含氧的條件下進行,該條件通過在0.12－0.5MPa(絕對值)的壓力下以一定的送氣速度向培養(yǎng)基中輸入富含氧的空氣,其中氧的體積比至少為30%。
文檔編號A01G1/04GK1348491SQ00806635
公開日2002年5月8日 申請日期2000年4月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月23日
發(fā)明者前川孝昭, 院多本華夫 申請人:筑波生物系統(tǒng)有限會社