專利名稱：一種通過用種間核轉移技術生產克隆虎的方法
技術領域：
本發明的
背景技術：
30年來，已知只可能在兩棲動物中克隆受精卵，但目前已成功地在小鼠中通過置換單細胞受精卵的前核產生出克隆的子代(見McGrath和Solter，科學，220:1300-1302,1983)。雖然在克隆動物上有了這個首例成功，動物工業上的同樣成功(見Wakayama等，自然，394:369-374,1998)卻報告得相當晚，因為用2-細胞期后的成熟卵母細胞和受精卵裂球產生克隆小鼠有幾個問題，例如重編程序的減少等。
有關通過核轉移生產克隆牲畜，首例報告是通過用8-到16-細胞受精卵的裂球作供體細胞產生綿羊的子代(見Wiladsen，自然，320:63-65,1986)。此后，據認為通過核轉移只能克隆具有全能性的受精卵裂球，籍此，細胞可分化成每一個單細胞。然而，經過持續的研究工作，首例克隆綿羊是通過導入體細胞核產生的(見Wilmut等，自然，385:810-813,1997)，從而糾正了在先的發育理論，并使得在生產克隆牛(見Well等，Reprod.Fertil.And Develop.,10:369-378,1998)和豬方面出現了成功例的報告。
通過發掘利用現有野生動物的體細胞產生胚胎和產生胚胎的技術，被人們認為對于永久地保存稀有瀕危物種的遺傳特征方面是很有價值的。但是，還沒有成功地克隆現有野生動物的報告。人們發現，在克隆這些野生動物時，如果克隆的動物是稀有的并且是受保護的就難于得到受體卵母細胞。因此其克隆動物就通過應用種間核轉移的技術產生，并且卵母細胞從緊密相關的物種得到。這種種間核轉移的技術在先已經有公開(見Domink等，Bio1.Repro.,60(6):1496-1502(1999)。但是，該文針對的是應用已經進行了許多研究工作的牲畜，所以還是使之難于把此技術應用到生產野生動物上。
在此情況下，有強烈的理由，探索和開發一種改進的方法，通過種間核轉移和野生動物的體細胞產生克隆的野生動物。
因此本發明的首要目的是提供一種通過種間核轉移技術生產克隆虎的方法。
本發明的另一個目的是通過所述方法提供克隆虎胚胎。
本發明的又一個目的是提供通過所述方法生產的由體細胞衍生的克隆虎。
圖2是一張照片，表示用一根持定(細玻璃)管和一根切割(細玻璃)管切割受體卵母細胞透明帶的過程。
圖3是一張照片，表示通過從受體卵母細胞取走第一極體和胞核進行去核的過程。
圖4是一張照片，表示用一根持定管和一根注射管把體細胞移入去核的卵母細胞的過程。
本發明的詳細描述本發明生產克隆虎的方法包含以下步驟制備從虎身上采集的供體體細胞系；體外將從牛或者貓卵巢采集的卵母細胞培育成熟；去掉卵母細胞周圍的丘細胞，切割成熟的卵母細胞透明帶的一部分并且擠出部分包括第一極體的胞質，以得到去核受體卵母細胞；通過把供體細胞注射進去核卵母細胞將核移入受體卵母細胞，然后通過隨后的電融合和激活電融合后的細胞得到胚胎；后激活并且體外培養胚胎；然后把培養的胚胎移入代孕母畜以產生克隆虎仔。
本發明的生產克隆虎的方法進一步說明如下。步驟1制備供體細胞把從虎身上采集的體細胞系制備成供體細胞盡管沒有限制從虎上采集什么細胞作供體細胞，但優選的細胞系包括從子宮沖洗液、子宮內膜、輸卵管、耳或者肌肉、丘細胞或者胎兒成纖維細胞采集的細胞，可使用常規的公知的方法稍加改動后制備這些細胞系(Mather&Barnes，細胞生物學方法，第57卷，動物細胞培養方法，Academic Press,1998)。
例如，通過在子宮沖洗液中加入含1％青霉素-鏈霉素(Gibco；每毫升10000單位青霉素，每毫升10毫克鏈霉素)磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)然后離心。從子宮沖洗液中采集的細胞在補充了非必需氨基酸、10％的胎牛血清(FBS)和1％青霉素-鏈霉素的Dulbecco氏改進的Eagle氏介質(DMEM)中，在39℃、5％的CO2的環境下培養。
從子宮內膜或者輸卵管采集的子宮上皮細胞用所述的PBS清洗、胰蛋白酶處理、然后在與上述相同的環境下培養。
對于丘細胞，用透明質酸酶溶液處理丘細胞-卵母細胞復合體以分離卵母細胞周圍的丘細胞。將丘細胞在39℃、5％的CO2的環境下作胰蛋白酶處理30到60分鐘以后再以上述相似的方式培養。
有關耳成纖維細胞和胎虎成纖維細胞，它們分別從包在軟骨組織上的皮層的內側和胎虎肢和體收集的組織得到在無菌條件下清洗和破碎這些組織，然后用胰蛋白酶及Ⅱ型膠原蛋白酶在39℃、5％的CO2的環境下處理。這些細胞也以類似于上述的供體體細胞系的方式培養。
體細胞系由傳代培養、血清饑餓培養或者冷凍方法儲存。供體細胞系的傳代培養定期地通過在胰蛋白酶處理后用新的培養基代替舊的培養基進行。血清饑餓培養通過施用補充0.5％FBS的DMEM以Wilmut等的方法進行(見Wilmut等，自然，385:810-813.1997)。這樣儲存的細胞系在后面的步驟中用作供體細胞。步驟2制備受體卵母細胞在體外將從牛或貓的卵巢采集的不成熟的卵母細胞培育成熟從含有10mM N-羥乙基哌嗪-N＇-[2-乙基磺酸(HEPES)的TCM199清洗介質中的卵巢中選擇不成熟的卵母細胞，然后，取決于取得卵母細胞的動物的不同在不同的培養介質中培養成熟。由牛得到的卵母細胞用TCM199-1培養介質培養使其成熟(見表1)。由貓得到的卵母細胞用補充了人類絨毛膜促性腺激素(HCG)的TCM199-2培養介質培養使其成熟(見表2)。兩種情況都在39℃、5％的CO2的環境下培養16至22小時。
表1TCM199-1培養介質
表2TCM199-2培養介質
步驟3受體卵母細胞的去核去掉成熟的受體細胞周圍的丘細胞并且切除卵母細胞的部分透明帶之后，從卵母細胞中去掉部分包括第一極體的胞質，以得到去核的卵母細胞首先用一個剝脫管從含有透明質酸酶的TCM199清洗介質中物理地去掉成熟的卵母細胞周圍的丘細胞。然后用TCM199清洗介質清洗剝脫了的卵母細胞，并且把它們移入細胞松馳素B溶液。為了對剝脫的細胞去核，用一根切割管穿刺剝脫了的卵母細胞的透明帶的一部分，以得到一個裂口，從此裂口可以把一部分包括第一極體的10％到15％的胞質從卵母細胞擠出。清洗去核的卵母細胞，并且在TCM199培養介質中保溫。所述細胞松馳素B溶液是通過用TCM199培養介質稀釋溶解在DMSO(二甲基亞砜)中的細胞松馳素B制備的。步驟4電融合供體細胞和受體卵母細胞并且激活電融合的細胞將供體細胞移入到受體卵母細胞中，接著進行電融合并且激活電融合的細胞在把供體細胞注射進受體卵母細胞前，用TCM199培養介質清洗去核的卵母細胞并且把它們移到PHA-P(植物血凝素)溶液中。然后通過把供體細胞注射到PHA-P溶液中的去核的卵母細胞的透明帶上造成的裂口中，把供體細胞移到去核的卵母細胞中。
使用電細胞操作器(BTX ECM2001)進行電融合。把放在補充以TCM199清洗液的甘露醇溶液中的重建的胚胎放在有兩個電極的室中，這兩個電極在所述室的每側各有一個。在將胚胎放在所述室中以其供體細胞對著陰極之前，把所述室充以甘露醇溶液。用間隔1秒每次15微秒的0.75到2.00千伏/厘米的兩次直流脈沖對胚胎進行電融合后，用甘露醇溶液和TCM199清洗介質清洗電融合的胚胎，在細胞松馳素B中培養，并且激活。如果電融合在含鈣離子的甘露醇介質中進行，電融合和激活同時發生。不然，激活在電融合后進行。當電融合在不含鈣離子的甘露醇介質中進行時，激活步驟通過在離子霉素溶液中黑暗中保溫胚胎進行。然后通過用含有FBS或者BSA的TCM199清洗介質清洗胚胎去除離子霉素。所述離子霉素溶液通過用含有BSA的TCM199清洗介質稀釋溶解在DMSO中的離子霉素制備。步驟5胚胎的后激活和體外培養胚胎的后激活和體外培養通過在放線菌酮溶液或者4-二甲氨基嘌呤(DAMP)溶液中保溫后激活在含有FBS或者BSA的TCM199清洗介質中保溫的激活的胚胎，并且在5％的CO2或在5％CO2、7％O2和88％N2的混合氣體環境下體外培養。所述的放線菌酮溶液或者DAMP溶液通過在體外培養的介質中添加溶解在乙醇中的放線菌酮或者DAMP而制備。體外培養的介質包括mTALP(見表3)、mSOF(見表4)和mCR2aa(見表5)介質，它們都含有NaCl、KCl、NaHCO3、NaH2PO4、CaCl2、乳酸鈉、葡萄糖、酚紅、BSA、卡那霉素、必需氨基酸、非必需氨基酸和L-谷氨酰胺。
可選擇地，冷凍保存體外培養的胚胎備以后使用，并且在打算使用時解凍。為了冷凍胚胎，用含有FBS的PBS清洗之，并放入含有青霉素-鏈霉素、CaCl2、葡萄糖、MgCl2、丙酮酸鈉和PBS的冷凍介質中。然后把冷凍介質中的胚胎緩慢冷凍，接著在液氮中快速冷凍。當冷凍的胚胎從液氮中取出并且解凍時，把它們在空氣中放置約5秒鐘，然后在溫水中解凍。為了從解凍的胚胎中去掉冷凍介質，把它們依次地放進從含有高濃度甘油到含有低濃度的甘油的系列介質中。
表3mTALP介質
表4mSOF介質
表5mCR2aa介質
步驟6生產克隆虎將體外培養的胚胎移入代孕母畜以生產虎將在含有FBS的PBS中的胚胎植入代孕母畜的子宮。
基于上述的方法，本發明通過分別用韓國虎的耳細胞和韓國牛的卵母細胞作胞核供體和受體卵母細胞，制備了胚胎，即SNU5(韓國虎NT胚胎)。這種胚胎于2000年3月10日在國際保藏機構KCTC(韓國典型培養物保藏中心，韓國KRIBB#52,OUNDONG,YUSONG-KU，TAEJON,305-33，韓國)保藏，保藏號為KCTC0752BP。
現在以以下各實施例進一步說明本發明，這些實施例不應當用作限制本發明的范圍。實施例1制備供體細胞和受體卵母細胞為了制備供體細胞，在刮掉組織周圍的毛后用乙醇和甜菜堿(betadine)對雄性成年虎耳尖的組織進行消毒。用消毒的器械采集皮膚組織(面積1至2平方厘米)，移入內盛含有0.5％青霉素(10000單位/毫升)-鏈霉素(10毫克/毫升)的PBS(磷酸鹽緩沖的鹽水，Gibco氏BRL，美國Life Technology)的50毫升試管中。然后從所述采集的皮膚組織中用消毒剪子和手術刀分離軟骨和含毛皮膚，得到襯在軟骨上的皮膚內側的組織作為供體。將該組織用PBS清洗，然后粉碎到100目。然后在39℃、5％的CO2環境下在含有0.25％的胰蛋白酶、1mM的EDTA和1毫克/毫升的Ⅱ型膠原蛋白酶的PBS中將組織保溫1小時，在組織被酶消化后，以1500轉/分鐘離心兩分鐘，然后懸浮在補充了10％FBS、1％NEAA(非必需氨基酸)、和1％青霉素-鏈霉素的DMEM(Dulbecco氏改進的Eagle氏培養基，Gibco氏BRL，美國LifeTechnology)中。將懸浮液移入細胞培養皿中，在39℃、5％CO2環境下保溫以得到體細胞系。此后細胞在含有0.25％的胰蛋白酶和1mM的EDTA的溶液中進行胰蛋白酶處理，然后把細胞數調節到2×104個細胞/毫升以在Eppendorf管中等分細胞。
圖1表示分離為單個細胞以用作胞核供體的體細胞。
另一方面，為得到受體卵母細胞，用帶有18G針頭的10毫升注射器從韓國牛的卵巢吸取直徑約2到6毫米左右的卵泡。然后，把卵泡液移入底部畫有格條的(線間寬度為1厘米)的100毫米平皿中，然后篩選有均勻的胞質并且周圍有足夠數量的丘細胞層的卵母細胞。選出的卵母細胞在35毫米平皿中用2毫升TCM199清洗介質(見表6)清洗三次，接著用TCM199-1培養介質(表1)清洗一次。最后在含有0.1％雌二醇溶液(表7)、2.5％促卵泡激素溶液(表8)和10％FBS的TCM199介質中培養，以得到受體卵母細胞。
表6TCM199清洗介質
表7雌二醇溶液
表8促卵泡激素溶液
實施例2體細胞的核轉移實施例1中制備的受體卵母細胞用TCM199清洗介質清洗一次，然后移入通過1毫升的TCM199清洗介質與111微升的透明質酸酶原液(在TCM199清洗介質中每毫升10毫克)混合制備的0.1％透明質酸酶(美國Sigma Chemical Co.)溶液。在0.1％透明質酸酶環境下從卵母細胞去掉丘細胞之后，將剝脫后的卵母細胞清洗三次并且在TCM199清洗介質中保溫。然后把卵母細胞移入通過含有10％FBS的1毫升TCM199清洗介質與1微升的細胞松馳素B原液(在DMSO每毫升7.5毫克)混合制備的細胞松馳素B(美國Sigma Chemical Co.)溶液中，并用一種微操作器切開每個卵母細胞的透明帶的一部分，以得到一個裂口，從此裂口可以把10％到15％的胞質從卵母細胞擠出，以得到去核的卵母細胞。制備去核的卵母細胞的步驟更具體地說明如下把工作盤放在微操作器臺上，在微操作器的左臂上裝備有一根持定管，在其右臂上裝備有一根切割管。然后，分別把持定管和切割管沿9點鐘和3點鐘的方向放置，并且通過在中間放置一個微管控制器把它們調節得可以沿各方向自由運動。進一步把兩個微管調節得不能接觸到工作盤，并且通過在微滴管上方上下移動使它們不接觸工作盤并且它們的尖端放在微滴管的中間。然后用一個洗口管(內徑大于200微米)把卵母細胞從TCM199清洗介質移入細胞松馳素B溶液。首先用其粗調鈕和細調鈕把微操作器聚焦在卵母細胞上，并通過上下移動該兩個微管進一步聚焦。卵母細胞放置得以其第一極體沿卵母細胞的12點鐘方向，然后把持定管沿卵母細胞的9點鐘方向放置得緊靠卵母細胞以通過加液壓固定卵母細胞。圖2表示用持定管和切割管切割卵母細胞的透明帶的過程。如圖2所示，卵母細胞用切割管(2)從1點鐘的方向向11點鐘的方向切割，特別小心不要損傷卵母細胞的胞質。此后向持定管(1)施加液壓以分開卵母細胞(3)，然后將持定管與靠著第一極體上部剌穿透明帶的切割管接觸，以通過磨擦兩個管切割部分透明帶。上述在卵母細胞上造的裂口既用于去核也用于供體注射。圖3表示從卵母細胞去掉第一極體和胞核的過程。如圖3所示，把卵母細胞(3)以其裂口豎直取向放置，用持定管(1)持定其下部以防止移動，然后用切割管(2)輕擠其上部以得到去核的卵母細胞。去核的卵母細胞用TCM199清洗介質清洗三次，然后在TCM199培養介質中保溫。
此后，用微操作器把事先制備好的供體細胞移入去核的卵母細胞。首先用400微升TCM199清洗液和100微升PHA-P(植物血凝素)原液(在TCM199清洗液中0.5毫克/毫升)混合制備的PHA-P溶液在工作盤的中間做一個4微升的注射微滴。然后，用含有1％FBS的PBS做兩個供體細胞的微滴，一個在同一工作盤上的注射微滴之上，一個在其下。在這些微滴上涂復礦物油之后，把工作盤放在微操作器臺上。
用一個注射管代替安裝在微操作器上的切割管。去核的卵母細胞用TCM199清洗介質清洗三次，然后移入注射微滴。把供體細胞吸入注射管然后移入注射微滴。圖4表示把一個體細胞移入去核的卵母細胞的過程。如圖4所示，去核的卵母細胞以其裂口取向為1點鐘放置，用持定管持定，然后用注射管和液壓經所述裂口注射進供體細胞，以得到重建的胚胎。把胚胎用TCM199清洗介質清洗三次，然后在TCM199清洗介質中保溫。實施例3電融合和激活重建的胚胎使用電細胞操作器(美國，BTX,ECM2001)進行電融合，然后再激活。用一個清洗用口管在含有重建的胚胎的TCM199培養介質中加入15微升含有0.28M甘露醇、0.5mM HEPES(pH7.2)、0.1mMMgSO4和0.05％BSA的甘露醇溶液。在所述介質中保溫1分鐘之后，把胚胎放在補充以TCM199清洗液的甘露醇溶液中培養1分鐘，最后用清洗用口管把胚胎移入甘露醇溶液。電細胞操作器的室(3.2毫米的453號室)中充灌補充以TCM199清洗介質的甘露醇溶液，然后把所述胚胎放在所述室中以其供體細胞對著陰極。用間隔1秒每次15微秒的0.75到2.00千伏/厘米的兩次直流脈沖對胚胎進行電融合后，將胚胎借助于甘露醇溶液移入TCM199清洗液，并且用TCM199清洗液清洗三次。
為激活電融合的胚胎，把胚胎在離子霉素(美國Sigma ChemicalCo.)溶液中黑暗中培養4分鐘，所述溶液是一種含有5μM離子霉素和1％的BSA的TCM199清洗液。所述離子霉素原液通過在1.34毫升的DMSO中溶解1毫克的離子霉素制備。激活的胚胎在含補充以10％FBS的TCM199清洗介質的35毫米平皿中保溫5分鐘以從胚胎洗去離子霉素。實施例4后激活和體外培養電融合的胚胎激活的胚胎在25微升的放線菌酮(美國Sigma Chemical Co.)溶液中后激活4個小時，所述的放線菌酮溶液是通過在體外培養的介質mTALP(見表3)中添加放線菌酮原液(10毫克/毫升在乙醇中)，到最終濃度為10微克/毫升來制備。然后篩選胚胎，把選出的胚胎在39℃溫度，5％的CO2環境下培養7天。
基于上述的方法時，本發明人分別用從用韓國虎的耳朵細胞作為供體細胞，用韓國牛的卵母細胞作受體細胞，產生一種胚胎，即SNU5(韓國虎NT胚胎)。這種胚胎于2000年3月10日在國際保藏機構KCTC(韓國典型培養物保藏中心，韓國KRIBB#52,OUNDONG,YUSONG-KU,TAEJON,305-33，韓國)保藏，保藏號為KCTC0752BP。實施例5用從貓得到的卵母細胞生產胚胎本發明用實施例1至4所述的同樣方法產生和培養胚胎，不同是的用從貓得到的卵母細胞作為受體卵母細胞。實施例6胚胎的冷凍和解凍及植入冷凍實施例4和5中產生的胚胎以長期保存。首先在35毫米平皿中分布一種冷凍介質(見表9和10)，調節冰箱維持到-5℃。選作冷凍的胚胎用含有10％FBS的PBS清洗，在冷凍介質中保溫20分鐘。然后，把胚胎吸入到0.25毫升的法式吸管中使含有胚胎的冷凍介質處在吸管的中間，而吸管的兩側是空氣。在用一個加熱了的鉗子密封了吸管的兩端后，把它放進冰箱，在-5℃保持5分鐘。然后用一把預冷鉗子種入液氮中速凍。在種入后，以-0.3℃/分鐘的速度冷凍到-30℃，在溫度達到-30℃時保持10分鐘。最后把胚胎儲存在液氮罐中。
表9冷凍PBS
表10冷凍介質
為使冷凍的胚胎解凍，在35毫米平皿中制備含有補充以20％的FBS的PBS的解凍介質，并且加上甘油以得到各有0％、3％和6％甘油的解凍介質(見表9和11)。然后從液氮中取出冷凍的吸管，在空氣中保持5秒鐘，然后在含有溫水(30℃)的容器(直徑大于20厘米)中解凍。在解凍后，把吸管在其兩端的空氣層處切割開，然后收集含有胚胎的介質。在顯微鏡下檢查胚胎。為了從胚胎去掉冷凍介質，把它們相繼地在含有6％甘油、3％甘油和0％甘油的解凍介質中各保溫5分鐘。
表11解凍介質
把解凍的胚胎放入含有20％的FBS的PBS中，然后吸入吸管。然后把它移入代孕母畜的子宮。實施例7比較應用不同供體細胞的胚胎為了比較應用不同受體卵母細胞制備的胚胎的區別，將實施例4和5制備的胚胎移入代孕母畜的子宮，然后就以下各項進行比較電融合的卵母細胞數、電融合率(％)、分裂率(％)、8-細胞胚胎數(％)、16-細胞胚胎數(％)、32-細胞胚數(％)、桑椹胚/胚泡發育數(％)、轉移的胚胎數和胚胎轉移后的懷孕數(見表12)。桑椹胚/胚泡發育數(％)代表剛好在植入前階段的由核轉移產生的總胚胎數中由體外培養發育的胚胎數的比率。
表12克隆虎胚胎的比較
如表12所示，應用牛的卵母細胞比用貓的卵母細胞的發育率和受孕率高。這可以解釋為，許多在牛的卵母細胞上開發的研究有助于建立理想的核轉移條件，而對于在貓的卵母細胞上開發的研究還不多。
先前的研究表明已經進行了許多研究的牲畜可以用于種間核轉移。然而，沒有一個成功地用于生產克隆子代。與上述情況相聯系，本發明因此在產生體細胞衍生的克隆動物上取得了很大的成功，生產出了體細胞衍生的克隆子代。
如以上清楚地表示和說明，本發明提供了一種通過種間核轉移技術生產克隆虎的方法，該技術涉及把虎的休細胞與牛或者貓的卵母細胞融合。本發明還涉及一種提供克隆虎的胚胎和用所述胚胎培育克隆虎的方法。根據本發明的方法，可以通過應用種間核轉移產生其克隆胚胎，永久地保存稀有瀕危動物的遺傳特征，作為一種保存野生動物的途徑。除了保存野生動物，還可望應用本發明的方法發展許多涉及種間核轉移的相關應用。
閱讀以上說明后，本領域內的一般技術人員可以對本文所示和所述進行種種修改。這些修改也落入本發明的權利要求書所述的范圍內。
有關微生物及其它生物材料的保藏證明(PCT細則13之二)
PCT/RO/134表
權利要求
1．一種生產克隆虎的方法，該方法包含以下步驟(Ⅰ)制備從虎身上采集的供體體細胞系；(Ⅱ)體外將從牛或者貓的卵巢采集的卵母細胞培育成熟；(Ⅲ)去掉卵母細胞周圍的丘細胞，切割成熟的卵母細胞透明帶的一部分以造成一個裂口，并且從此裂口擠出部分包括第一極體的胞質，以得到去核受體卵母細胞；(Ⅳ)通過把供體細胞注射進去核受體卵母細胞將核移入受體卵母細胞，然后通過隨后的電融合和激活電融合后的細胞得到胚胎；(Ⅴ)后激活并且體外培養胚胎；(Ⅵ)然后把培養的胚胎移入代孕母畜以產生克隆虎仔。
2．根據權利要求1的生產克隆虎的方法，其中步驟(Ⅰ)制備的體細胞系包括從子宮沖洗液、子宮內膜、輸卵管、耳或者肌肉、丘細胞或者胎成纖維細胞采集的細胞。
3．根據權利要求1的生產克隆虎的方法，其中所述體細胞系通過傳代培養、血清饑餓培養或者冷凍保存。
4．根據權利要求1的生產克隆虎的方法，其中步驟(Ⅲ)中，在用透明質酸酶處理后，用剝脫管物理地去掉卵母細胞周圍的丘細胞。
5．根據權利要求1的生產克隆虎的方法，其中步驟(Ⅲ)中，卵母細胞的去核是通過下列步驟進行的用微操作器切割卵母細胞在卵母細胞上造成一個裂口；把卵母細胞以其裂口豎直取向并且用一根持定管持定卵母細胞的下部以防止它移動；用一根切割管擠壓卵母細胞的上部經所述裂口將包括第一極體的10％到15％胞質從卵母細胞擠出。
6．根據權利要求1的生產克隆虎的方法，其中步驟(Ⅳ)中的胞核轉移是通過經在卵母細胞的透明帶上造成的裂口，把供體細胞注射進入去核的受體卵母細胞進行的。
7．根據權利要求1的生產克隆虎的方法，其中步驟(Ⅳ)中的電融合是通過間隔1秒每次15微秒施加的0.75到2.00千伏/厘米的兩次直流脈沖進行的。
8．根據權利要求1的生產克隆虎的方法，其中步驟(Ⅳ)中，如果電融合在含鈣離子的介質中進行，激活步驟與電融合同時發生。
9．根據權利要求1的生產克隆虎的方法，其中步驟(Ⅳ)中，如果電融合在不含鈣離子的介質中進行，激活步驟在離子霉素溶液中在黑暗中進行。
10．根據權利要求1的生產克隆虎的方法，其中步驟(Ⅴ)中的后激活是通過在放線菌酮溶液或者DAMP(4-二甲氨基嘌呤)溶液中培養胚胎進行的。
11．根據權利要求1的生產克隆虎的方法，其中步驟(Ⅴ)中的體外培養是通過在mTALP、mSOF或者mCR2aa介質中培養后激活的胚胎進行的。
12．根據權利要求1的生產克隆虎的方法，該方法還包括儲存在步驟(Ⅴ)中體外培養的胚胎以備后用的步驟，該步驟是在含有青霉素-鏈霉素、CaCl2、葡萄糖、MgCl2、丙酮酸鈉和磷酸鹽緩沖的鹽水的冷凍介質中冷凍胚胎后進行的。
13．一種胚胎，即SNU5(韓國虎NT胚胎，KCTC0752BP)，它是通過權利要求1的步驟(Ⅰ)到(Ⅴ)，分別用韓國虎的耳朵細胞作為胞核供體，用韓國牛(Bos taurus coreanae)的卵母細胞作為受體卵母細胞產生的。
14．一種克隆虎，它是通過權利要求1的步驟(Ⅵ)用權利要求13所述的SNU5(韓國虎NT胚胎，KCTC0752BP)作為胚胎生產的。
全文摘要
本發明提供了一種應用種間胞核轉移技術生產克隆虎的方法。本發明的生產克隆虎的方法包含以下步驟:制備從虎身上采集的供體體細胞系;在體外將從牛或貓的卵巢采集的卵母細胞培育成熟;去掉卵母細胞周圍的丘細胞,切割成熟的卵母細胞透明帶的一部分以造成一個裂口,并且通過該裂口擠出部分包括第一極體的胞質,以得到去核受體卵母細胞;通過把供體細胞注射進去核卵母細胞將一個核移入受體卵母細胞,然后通過隨后的電融合和激活電融合后的細胞得到胚胎;后激活并且體外培養胚胎;然后將培養的胚胎移入代孕母畜以產生克隆虎。本發明可以核轉移胚胎的方式廣泛地用于永久地保存稀有瀕危動物的遺傳特征。
文檔編號A01K67/027GK1304445SQ00800651
公開日2001年7月18日 申請日期2000年6月30日 優先權日1999年6月30日
發明者李炳千, 申泰英, 盧湘鎬, 林正默, 樸鐘任, 趙鐘基, 金琪淵, 李殷松, 申秀晶, 金晟基, 宋吉永, 龍煥律, 安國俊, 玄尚桓, 李秉東, 黃禹錫 申請人:黃禹錫