專利名稱：以玻璃珠為培養基質的叢枝菌根真菌的培養的制作方法
技術領域：
本發明涉及特殊微生物的培養技術，更具體地說涉及叢枝菌根真菌的培養，以及特定的培養裝置及培養介質。
叢枝菌根(AM)在農業生產實踐和自然生態系統中的重要作用已廣為人們所知。近85％的植物種類和幾乎所有的農作物能夠形成叢枝菌根。叢枝菌根真菌(AMF)可以通過多種方式或途徑影響植物的生理代謝和生長發育過程。許多調查研究表明叢枝菌根對植物的營養狀況(尤其是植物的磷營養)、水分的吸收利用、抵抗病原菌侵染、鹽分及重金屬毒害有著顯著的積極的作用。在資源和環境問題日益嚴峻的背景下，叢枝菌根的應用作為一條有效可行的生物學途徑，能夠發掘生物的自身潛力，提高作物對自然資源的利用效率，從而降低能耗，減輕環境所承受的壓力，因而有著廣闊的應用前景。對叢枝菌根研究和認識日趨廣泛深入的同時，在應用方面，出現了商業化接種劑。然而，AM真菌是嚴格專性共生生物，脫離了宿主植物即無法正常生長發育，完成生命過程。雖然研究者們試圖探明宿主植物與菌根真菌之間的信息和物質交換過程，但至今不能獲取足夠的數據以支撐建立AM真菌的離體培養，這無疑成為相關研究以及叢枝菌根廣泛應用的主要障礙。
無論出于科學還是經濟的考慮，獲得AM真菌材料都有著極其重要的意義。對叢枝菌根進行遺傳學和生物學的研究有賴于獲得純凈真菌組織，而生產商業化的接種劑需要高密度和純度的真菌繁殖體。顯然，現有條件下只能建立共生條件下的AM真菌培養。通常應用的培養方法包括土培、無土基質培養(如沙培)等，也有稀少的應用霧培或營養液培養的報道。雙重無菌培養技術是近年來發展起來的一種最接近于純培養的AM真菌培養技術。在這種培養體系中，菌根共生體由Ri T-DNA轉基因的宿主植物根器官和菌根真菌在培養基中建立起來，由此叢枝菌根由開放式培養系統轉入微生物實驗室的培養皿中，從而盡可能地減免了外源污染。一些商業行為和科研活動中，各種生長刺激物質(如類異黃酮、褐藻酸低聚糖等)被應用以促進真菌孢子產生及菌絲體發育。偶有商家或研究者稱人工混合基質中離體真菌孢子和菌絲體的富集培養為純培養(大多應用了生長刺激或促進物質)，但并非科學上的純培養概念。
基質培養(如土培)易于操作，成功率高，所以仍是當前應用最為廣泛的AM真菌培養方法，但開放式培養過程中菌種會遭受不同程度的外源污染，經過數代培養菌種往往嚴重蛻化，于是不得不重新純化。如果需要從土壤盆栽宿主植物分離AM真菌，去除孢子表面的污染顯得十分困難，同時也難以獲得足夠量的純凈菌絲體。少見應用的無土培養技術(如霧培、營養液膜培養)因為難以維系適宜的生長條件，成功率和培養效率通常不高。利用雙重無菌培養技術獲得的真菌孢子很有價值，然而建立此培養體系極其繁瑣，培養條件要求嚴格，非專業技術人員難以操作，而且目前只有少數幾個真菌菌種建立了這種培養。
無可否認，通過基質培養途徑提供菌劑是簡便可行的，但為了某些特殊目的需要獲得大量純凈真菌材料，如科學研究的需要以及生產高純度的商業化菌劑，通常的培養方法便顯出無以克服的局限性，普遍的困難是無法簡單有效地將宿主植物根系和培養基質與真菌分離。對于無土培養，即便不考慮其它局限性，也面臨著同樣的問題。針對這些困難，我們在此提出一種玻璃珠分室培養技術以彌補現有AM真菌培養技術的不足。
本發明的目的之一是提供一種新的從枝菌根(AM)真菌的培養方法，該方法應用特殊培養裝置和培養介質，區隔真菌和宿主植物的生長空間，有效免除植物生長基質及外物對真菌的可能污染。
本發明的技術方案如下1.培養裝置采用硬質塑料板(或有機玻璃板、PVC板等)與特殊孔徑的尼龍網加工成三分室的培養容器(附
圖1)。三個分室中，中間的分室為區隔宿主植物與真菌生長空間的隔離分室。區隔分室與植物生長室之間以1mm孔徑的尼龍網分隔，與真菌生長室之間以30μm尼龍網分隔。根系可以穿過1mm尼龍網生長到區隔分室中，但30μm尼龍網只允許根外菌絲通過而阻止了根系的伸展，所以只有菌根真菌能夠在玻璃珠分室中生長。區隔分室中填充粗河砂可以有效防止植物生長室中土壤顆粒對真菌的污染，而真菌生長室中的玻璃珠因具有表面光滑、比重相對較重的特性而易于和真菌組織分離。區隔分室和真菌生長室蓋上尺寸合適的深色PVC板蓋子以避免外源污染(如藻類生長)。
2.培養程序
(1)基本材料準備A、宿主植物(如玉米、三葉草等)種子；菌根接種劑為含有真菌孢子和菌絲體的菌土，或其它類型菌劑)；B、3～4mm厚的有機玻璃板或PVC板；網孔分別為1mm和30μm的尼龍網；C、低養分含量的沙土與沙子；粗河砂(粒徑1～3mm)；玻璃珠(粒徑0.8～1.2mm)。
植物種子需經表面消毒，所有培養基質均需滅菌處理(如高壓蒸汽滅菌)。
(2)培養系統的建立如前所述，培養容器由塑料板或有機玻璃板和尼龍網加工而成。分別將粗河砂和玻璃珠裝入區隔分室和真菌生長室，菌根接種劑(接種劑量一般為生長基質總量的5％)與沙土混勻裝入植物生長室，而后自區隔室澆水(使植物生長室中重量含水量在15％左右)，待水分滲透均勻后播種。
A、培養基質前述特定粒徑的玻璃珠(0.8～2.0mm)和河砂(1～3mm)；B、培養裝置三室培養系統，或者為提高培養效率在植物生長室另一側增加一個區隔室和真菌生長室，或在真菌生長室另一側增加一個區隔室和植物生長室而構成五室培養系統；特定網孔(1mm和30μm)的尼龍網；C、真菌菌種Glomus mosseae、Glomus versiforme、Glomus
intraridices、Sclerocystis sinuosa、Gigarspora margarita等。
(3)培養過程在能夠控制溫度和光照的培養室中進行培養。水分管理注意只能從區隔室澆水，以防止土壤顆粒被沖入中間分室污染真菌。平時用蓋子蓋住區隔室和真菌生長室以防止水分過度蒸發及藻類生長。當植物出現缺素癥狀時，向菌根室澆入1/4 Hoagland營養液(Hoagland& Snyder，1938，其中P濃度降低至1/10)。培養過程中可隨時用小茶匙自真菌生長室取樣，觀測是否有菌絲及孢子產生。
收獲一般培養周期為8周左右。最后收獲時，用茶匙將真菌生長室內的真菌連同玻璃珠轉移到380μm篩上，用蒸餾水小心沖洗，通過30μm篩回收菌體。也可以將真菌連同玻璃珠緩緩傾入盛有蒸餾水的塑料杯中，玻璃珠很快沉入杯底，而菌絲體及孢子浮留于水面，通過30μm篩可回收菌物。
我們由宿主植物三葉草、玉米和AM真菌菌種Glomus mosseae、Glomus versiforme、Glomus intraridices、Sclerocystis sinuosa、Gigarspora margarita等在玻璃珠分室培養系統中成功建立了菌根共生培養，并獲得了相應純凈真菌。對于產孢能力強的真菌菌種Glomusversiforme來說，由體積為(10×15×(3+4+5))cm3的培養容器可獲得多至20毫克干重的菌體，每盆獲取孢子數量可以萬計。
玻璃珠分室培養將AM真菌的傳統基質培養與無土培養完好結合起來，簡便易行，培養效率卻大大提高。這種培養系統最顯著的優點是真菌易于和培養基質分離。利用這種培養技術可以培養出大量保持自然菌落的AM真菌，同時免除其它外源污染，無論對于科學研究或是生產應用都具有不可替代的功用，尤其為制備叢枝菌根生物學研究所需的大量純凈真菌材料，及生產高純度菌劑或高效的微生物肥料應用于集約化農業，提供了一條簡便易行的途徑。
附圖的簡要說明附
圖1為玻璃珠分室培養系統示意圖。植物生長室裝入砂土和細砂的混合物，區隔室裝入河砂，真菌生長室裝玻璃珠。根系可穿過尼龍網A在菌根室中生長，而只有菌絲可暢通無阻地穿過尼龍網B進入真菌生長室。經過一定培養時期，自真菌生長室即可觀測、收集到真菌組織。
附圖2自真菌生長室分離得到的Glomus versiforme孢子和菌絲體。
實施例真菌菌種為Glomus mosseae(Nicol. & Gerd)Gerdmann & Trappe和Glomus versiforme(Karsten)Berch，以含有寄主植物根段、菌根真菌孢子及根外菌絲的真菌菌種的根際土為接種劑。采用玉米(Zeamays，農大108)為宿主植物進行擴繁。播種前用10％H2O2對種子進行表面消毒并于室溫下催芽。
低養分含量的砂土(采自北京大興龐各莊鄉，基本理化性狀pH(CaCl2)，7.8；有機質含量，0.39％；全氮，0.027％；速效磷(Olsen-P)，3.9mg/kg；速效鉀(NH4OAc-K)，60.4mg/kg)、細砂(過1mm篩)、河砂(粒徑1～3mm)和玻璃珠(粒徑0.8～1.2mm)。所有培養基質在裝盆前均經高壓蒸汽滅菌處理(120℃，2小時)。
采用有機玻璃板加工成的分室培養系統，尺寸為(10×15×(3+4+5))cm3。區隔室裝入850g河砂，真菌生長室裝入960g玻璃珠。播種前將菌根接種劑(接種劑量20克)與沙土混勻裝入植物生長菌根室，而后自區隔室澆水(100ml)，待水分滲透均勻后播種。每盆播種5粒，出苗后間留4株。
培養進行8周時，在真菌生長室觀測到大量Glomus versiforme孢子及菌絲(見附圖2)，同時也觀察到Glomus mosseae少量孢子果和菌絲體的形成。Glomus versiforme可回收真菌孢子和菌絲體的量可達20mg干物重，Glomus mosseae可達10mg。
權利要求
1.叢枝菌根真菌的培養方法。該方法使用由區隔分室，真菌生長室，植物生長室組成的三分室培養容器；該方法包括將接種劑裝入培養容器的植物生長室，而后自區隔室澆水，將宿主植物種子播種，培養，回收真菌孢子和菌絲體。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述接種劑為含有叢枝菌根真菌孢子、菌絲體的菌土。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述培養容器為采用應硬質塑料板與尼龍網(孔徑1毫米和30微米)加工而成的三分室培養容器。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述的培養容器還包括為在植物生長室另一側增加一個區隔室和真菌生長室，或在真菌生長室另一側增加一個區隔室和植物生長室而構成五室培養系統。
5.根據權利要求1所述的方法，其中區隔分室和真菌生長室分別裝有粗河砂和玻璃珠。
6.根據權利要求1所述的方法，其中接種劑與砂土混勻裝入培養容器的真菌生長室。
7.根據權利要求1所述的方法，其中培養周期為8周。
8.權利要求1的培養方法中所用的培養容器。
全文摘要
本發明公開了叢枝菌根真菌的培養方法,該方法使用了特定的培養裝置及培養介質。該培養裝置為由區隔分室,真菌生長室,植物生長室組成的三分室培養容器,區隔分室和真菌生長室分別裝有粗河砂和玻璃珠,該方法包括將菌根真菌接種劑與砂土混勻裝入培養容器的植物生長室,而后自區隔室澆水,將宿主植物種子播種,培養,回收真菌孢子和菌絲體。
文檔編號A01N63/04GK1354252SQ00132468
公開日2002年6月19日 申請日期2000年11月21日 優先權日2000年11月21日
發明者李曉林, 陳保東 申請人:李曉林, 陳保東