專利名稱：魚病多聯單克隆抗體治療制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域近年隨著我國海水養殖漁業的迅猛發展，魚病特別是由細菌引起的魚病越來越嚴重，每年海水養殖魚因病而死亡達30～40％，造成了嚴重的經濟損失。對養殖魚病的防治，國內外迄今還停留在主要采用化學藥物及抗生素的初始階段，化學藥物的大量應用會帶來不良的作用，一是引起病菌的耐菌性而失效，二是造成對環境的污染；使用抗生素，也會通過食物鏈對人類造成不良的影響。魚病單克隆抗體治療制劑迄今未見報道。
本發明的目的利用生物技術，生產多種魚病病菌的單克隆抗體，對魚病有良好的預防和治療作用，同時不會污染環境，也不會通過食物鏈對人類造成危害。
本發明的技術方案將鰻弧菌、創傷弧菌、溶藻弧菌、遲緩愛德華菌菌株(均由青島海洋大學提供)，進行擴增培養，再將培養后的菌液腹腔注射免疫小鼠Ba／b／c小鼠，取免疫后小鼠脾細胞和SP2／0骨髓瘤細胞進行細胞融合，將細胞融合的細胞懸液進行培養，用酶聯免疫反應法(ELISA法)檢測陽性克隆，將確定為陽性的孔以有限稀釋法，進行克隆化，再將陽性克隆的雜交瘤細胞株擴增培養，腹腔注射接種到Ba／b／c小鼠制備出腹水型單抗，將以上腹水型單抗以ELISA法進行效價，亞類及交叉試驗，挑選效價較高的單克隆抗體，分別和致死量的病菌混合(1∶1～1∶2比例)，然后以腹腔注射感染海魚，對照組以生理鹽水取代單抗，觀察單抗對海魚的免疫保護率，結果顯示，抗鰻弧菌單抗中有3株單抗4A6、3B2、4E12，它們對海魚的保護率分別為80％、60％、50％；抗創傷弧菌單抗中有2株單抗1A1、3E9，它們對海魚的保護率分別為87％和89％；抗遲緩愛德華菌單抗中有兩株單抗3F7和1B4，它們對海魚的保護率分別為80％和60％。挑選出保護率較高的單抗按一定比例配制成魚病多聯單抗治療制劑。
具體實施例方式(一)材料1．菌種鰻弧菌、外傷弧菌、溶藻弧菌、遲緩愛德華氏菌的標準菌株由青島海洋大學生命學院提供。以上菌種用作免疫原產生單克隆抗體。
溶藻弧菌、副溶血弧菌、創傷弧菌、河弧菌、弗尼斯弧菌、霍利斯弧菌、擬態弧菌、少女弧菌、麥氏弧菌的標準菌株購自北京生物制品公司。腸毒性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌、志賀氏菌屬的福氏志賀氏菌、絕氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、宋氏志賀氏菌，購自中國藥品生物制品鑒定所。以上菌種用作單克隆抗體交叉試驗。
2．細胞胞SP2／0小鼠骨髓瘤細胞株，由第四軍醫大學細胞工程研究中心惠贈。
(二)實驗方法1．免疫原細菌的制備及滅活鰻弧菌、溶藻弧菌、創傷弧菌、遲緩愛德華氏菌以平板劃線培養于細菌培養基上，37℃培養箱中過夜，無菌生理鹽水洗脫菌苔，3000rpm離心20分鐘，棄上清，加入1％的甲醛固定過夜。3000rpm離心20分鐘，棄上清，加無菌生理鹽水，比濁記數后，4℃冰箱保存，以備用作免疫原菌液。
2．Ba／b／c小鼠的免疫8周齡的Ba／b／c雌性小鼠10只，將以上滅活的細菌菌液(1×108個／ml)以0．5ml／只的量，腹腔注射免疫小鼠，于第一次免疫后第7、14、28天分別追加免疫，第31天取脾細胞進行細胞融合。
3．細胞融合(1)免疫脾細胞的制備①取免疫小鼠脾臟，放入盛有5ml不完全培養液的平皿中，置于200目的不銹鋼銅網上。用注射器內芯研磨脾臟，并用平皿內不完全培養液輕輕沖洗鋼網，使脾細胞全部通過網孔擠壓到溶液中。
②將脾細胞懸液轉入50ml離心管中，加不完全培養液至30ml，混勻，1000rpm離心5分鐘，棄去上清。
③用不完全培養液將沉淀細胞再離心洗滌一次(重復步驟②)，將細胞垂懸至10ml，混勻，用細胞記數板記數。
(2)SP2／0骨髓瘤細胞懸液的制備①將4瓶擴增培養的骨髓瘤細胞收集到50ml離心管內。
②1000rpm離心5分鐘，棄去上清。
③再加入30ml不完全培養液，重復步驟②再離心洗滌一次，然后將細胞垂懸至10ml，混勻，記數。
(3)細胞融合①分別吸取含1×108個脾細胞和懸液和含2-3×107個骨髓瘤細胞的懸液，加入一支50ml離心管中，補加不完全培養液至30ml，充分混勻。
②1000rpm離心7分鐘，棄去上清。
③加50％的融合劑PEG 0．7ml。
④加入25ml不完全培養液，使PEG稀釋而失去促融作用。
⑤800rpm離心7分鐘，棄去上清。
⑥加入20ml HAT培養液，輕輕吹吸沉淀細胞，使其垂懸并混勻。
⑦將細胞懸液加入輔有飼養細胞的96孔培養板中，每孔0．1ml，在37℃含5％CO2的孵箱中培養。
4．抗體檢測--間接ELISA法(1)用已知抗原滅活菌液包被。
(2)加有克隆長生的孔中的培養上清100μl。
(3)加酶標單抗鼠IgG抗體100μl。
(4)加底物液100μl，室溫避光顯色10～20分鐘。
(5)判定結果在酶聯免疫檢測儀492nm波長下測定OD值，空白對照調零，若待測孔OD值大于或等于陰性對照孔2．1倍，即為陽性克隆。
5．克隆化--有限稀釋法將96孔板中待做克隆化的雜交瘤細胞用加樣器反復吹打均勻后記數，然后采取有限稀釋法進行逐級稀釋，加到96孔板進行培養。觀察克隆生長，記錄單克隆孔，并及時進行陽性檢測。將陽性單克隆的細胞轉到24孔板培養，待其增殖到一定數量后再轉入細胞瓶中擴大培養。
6．雜交瘤細胞的凍存將成對數生長的雜交瘤細胞收集入離心管，1000rpm離心10分鐘，棄上清，加入1ml凍存液混勻，然后加到凍存管，在-70℃代溫冰箱過夜后移入液氮罐長期保存。
7．腹水型單克隆抗體制備將培養的雜交瘤細胞吹打下來，1000rpm離心10分鐘，收集上清作亞型試驗，加無血清培養液到沉淀的細胞中，調整細胞數為1×106個／ml。每只Ba／b／c小鼠注射0．5ml，接種雜交瘤細胞后7～14天，拉頸脫臼處死小鼠，吸取腹水，離心，收集上清，分裝后-20℃凍存備用。
8．單克隆抗體的鑒定抗鰻弧菌單抗篩選到8株能穩定分泌單克隆抗體的陽性細胞株，分別命名為2H2、3B2、3D2、3A3、3C4、4A6、4E3和4E12。經亞類鑒定其中2H2、3D2、3B2和4E12為IgG3；4E3為IgG2a；3A3、3C4、4A6為IgG1。經效價測定，這些單抗效價為1×10-5～1×10-7。
抗創傷弧菌單抗篩選到12株能穩定分泌單抗的雜交瘤細胞株，命名為1B12、3E9、3F11、3E3、2G8、3D5、1E11、3H4、2F1、1A1、2F6和1G1。經亞類鑒定，其中2F6為IgG3、1B12、3E3、3H4、1A1為IgG2a；2G8、3D5、2F1為IgG1。經效價測定，以上單抗的效價為1×10-5～1×10-7。
抗溶藻弧菌單抗篩選到8株能穩定分泌單抗的雜交瘤細胞中，命名為2E3、2E4、2G2、2G8、2D11、3A10、3B12和4C7。經亞類鑒定，其中2E3為IgG3，2G2、2D11、3A10為IgG2a；2E4、3B12為IgG2b；2G8、4C7為IgG1。經效價鑒定，以上單抗的效價為1×10-6～1×10-7。
抗遲緩愛德華菌單抗篩選到10株單抗雜交瘤細胞株，分別命名為1B4、4D3、4D5、3F7、5A11、5H5、6B11、6E1、6E6和6H3。經亞類鑒定，其中1B4、3F7、5A11、5H5、6B11為IgG1，6E1為IgG2b；4D3、4D5、6E6、6H3為IgG3。經效價測定，以上單抗的效價為1×10-6～1×10-7。
9．對海魚的免疫保護試驗(1)將菌液(5LD50)與腹水型單克隆抗體1∶1(體積比混合，以0．1ml／條的量腹腔注射牙鲆，每條注射抗體量為100μg／條。對照組為同樣的菌液與生理鹽水1∶1混合，觀察5天內牙鲆的存活率。保護率計算公式保護率(％)=(實驗組存活率-對照組存活率)／對照組存活率×100％(2)結果經單克隆抗體對海魚病治療保護試驗，從四種病菌的單克隆抗體中，分別篩選到了對海魚有較好保護率的單抗。
抗鰻弧菌單克隆抗體中篩選到3株單抗4A6、3B2、4E12，它們對海魚的治療免疫保護率分為80％、60％、50％。
抗創傷弧菌單克隆抗體中篩選到2株單抗1A1、3E9，它們對海魚的保護率分別為87％和89％。
抗遲緩愛德華菌單抗中篩選到2株單抗3F7和1B4，它們對海魚的保護率分別為80％和60％。
抗溶藻弧菌單抗中未篩選到對海魚有保護作用的單抗，但篩選到一株2D11對乳鼠有很好保護作用，其保護率達90％。
10．制備成品將抗鰻弧菌單抗中的4A6，抗創傷弧菌單抗中的3E9，抗遲緩愛德華菌單抗中的3F7單抗以1∶1∶5的比例混和，制成魚病多聯單抗治療制劑。
本發明的優點本發明魚病多聯單克隆抗體治療制劑對海魚保護率達80％以上，治療效果好，不會污染環境，對人類不會造成損害，且所制備的含有海魚病特異性單抗的雜交瘤細胞株可通過生物效應器無限擴增，實現特異性單抗工業化大生產，具有很高的社會與經濟效益。
權利要求
1．魚病多聯單克隆抗體治療制劑，其特征是將鰻弧菌、創傷弧菌、溶藻弧菌、遲緩愛德華菌進行擴增培養，再將培養后的菌液腹腔注射免疫小鼠Ba／b／c，取免疫后小鼠脾細胞和SP2／0骨髓瘤細胞進行細胞融合，將細胞融合的細胞懸液進行培養，用酶聯免疫反應法(ELISA法)檢測陽性克隆，將確定為陽性的孔以有限稀釋法，進行克隆化，再將陽性克隆的雜交瘤細胞株擴增培養，腹腔注射接種到Ba／b／c小鼠制備出腹水型單抗；將以上腹水型單抗以ELISA法進行效價，亞類及交叉試驗，挑選效價較高的單克隆抗體；分別和致死量的病菌混合(1∶1～1∶2比例)，然后以腹腔注射感染海魚，對海魚進行保護試驗，挑選對海魚有較高保護率的單抗，按一定比例配制成魚病多聯單克隆抗體治療制劑。
全文摘要
魚病多聯單克隆抗體治療制劑,涉及生物技術領域。本發明將鰻弧菌、創傷弧菌、溶藻弧菌、遲緩愛德華菌免疫小鼠,進行細胞融合,再克隆化,制備出特異性很強,且效價較高的單抗,再將以上單抗篩選出對魚類有較高保護率的抗病菌單抗,按一定比例配制成魚病多聯單抗治療制劑。該生物制劑對魚病有良好的預防和治療作用,同時不會污染環境,也不會通過食物鏈對人類造成危害。
文檔編號A01K61/00GK1292993SQ0011392
公開日2001年5月2日 申請日期2000年9月20日 優先權日2000年9月20日
發明者黃威權, 夏永娟, 李元, 李別虎, 金曉航, 張榮慶 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學