專利名稱：魚病多聯免疫檢測藥物盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域。
近年，隨著我國海水養殖漁業的迅猛發展，魚病特別是由細菌引起的魚病越來越嚴重，每年因病而引起的死亡率約為30～40％，造成嚴重的經濟損失。經調查，目前對我國海水、淡水養殖魚危害最大的病菌為創傷弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、河弧菌及遲緩愛德華菌。國外對魚病的檢測技術從一般的形態學觀察，生物特性測定，近年已發展到免疫檢測技術及基因探針檢測技術。免疫檢測技術的建立，首要條件是產生各種病菌的特異性抗體或單克隆抗體，后者比前者更具有特異性。國外已有鰻弧菌、創傷弧菌、溶藻弧菌等多種弧菌單克隆抗體成功制備的報道，并已有用免疫檢測法，檢測由弧菌引起的魚病的報道，但這些僅僅是實驗室的研究報告。國外已有遲緩愛德華菌多克隆抗體成功制備的報道，但還未見單克隆抗體成功制備的報道。國內迄今未見以上海魚病菌單克隆抗體成功制備的報道。
本發明的目的是利用生物技術，生產多種多病菌單克隆抗體，篩選出特異性很強的單克隆抗體及雜交瘤細胞株，制備出魚病多聯免疫檢測藥物盒，能隨時快捷、準確地檢出各種魚病，為魚病的及時有效治療提供保證。
本發明的技術方案鰻弧菌、創傷弧菌、溶藻弧菌、遲緩愛德華菌的標準菌株由青島海洋大學提供。以上菌株經擴增培養后，用0．5％～2％甲醛固定過夜滅活，將滅活菌液(1×106個／ml～1×1010個／ml)以0．2～0．5ml／只的量，腹腔注射免疫小鼠。每隔一周到兩周追加免疫一次，最后一次免疫后第3天，取脾細胞和SP2／0骨髓瘤細胞進行細胞融合。脾細胞和SP2／0骨髓細胞的比例為2∶1～1∶1。將經細胞融合的細胞懸液加到輔有飼養細胞的96孔培養板中，每孔0．1ml，在37℃，含5％CO2的孵箱中培養。用ELISA法(酶聯免疫反應法)檢測陽性克隆，將確定為陽性的孔以有限稀釋法，進行克隆化。將陽性克隆的雜交瘤細胞株擴增培養，將擴增培養的雜交瘤細胞調整為1×106／ml，以每只小鼠0．5ml的量，腹腔注射接種到Ba／b／c小鼠，接種后7～14天，處死小鼠，吸取腹水，即為腹水型單抗。將以上腹水型單抗以ELISA法進行效價、亞類及交叉試驗。結果顯示，8株鰻弧菌單抗中有2株單抗不與弧菌屬其它弧菌發生交叉反應；12株外傷弧菌單抗中有2株單抗不與其它弧菌發生交叉反應；8株溶藻弧菌單抗中有2株單抗除了擬態弧菌外，也不與其它弧菌發生交叉反應；8株遲緩愛德華菌單抗中有7株單抗不與腸道其它桿菌發生交叉反應。將以上4種特異性很強，且效價較高的單抗挑選出來按一定比例配制成魚病多聯免疫檢測藥物盒。
本發明的實施例(一)材料1．菌種鰻弧菌、外傷弧菌、溶藻弧菌、遲緩愛德華氏菌的標準菌株由青島海洋大學生命學院提供。以上菌種用作免疫原產生單克隆抗體。
溶藻弧菌、副溶血弧菌、創傷弧菌、河弧菌、弗尼斯弧菌、霍利斯弧菌、擬態弧菌、少女弧菌、麥氏弧菌的標準菌株購自北京生物制品公司。腸毒性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌、志賀氏菌屬的福氏志賀氏菌、絕氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、宋氏志賀氏菌，購自中國藥品生物制品鑒定所。以上菌種用作單克隆抗體交叉試驗。
2．細胞胞SP2／0小鼠骨髓瘤細胞株，由第四軍醫大學細胞工程研究中心惠贈。
(二)實驗方法1．免疫原細菌的制備及滅活鰻弧菌、溶藻弧菌、創傷弧菌、遲緩愛德華氏菌以平板劃線培養于細菌培養基上，37℃培養箱中過夜，無菌生理鹽水洗脫菌苔，3000rpm離心20分鐘，棄上清，加入1％的甲醛固定過夜。3000rpm離心20分鐘，棄上清，加無菌生理鹽水，比濁記數后，4℃冰箱保存，以備用作免疫原菌液。2．Ba／b／c小鼠的免疫8周齡的Ba／b／c雌性小鼠10只，將以上滅活的細菌菌液(1×108個／ml)以0．5ml／只的量，腹腔注射免疫小鼠，于第一次免疫后第7、14、28天分別追加免疫，第31天取脾細胞進行細胞融合。
3．細胞融合(1)免疫脾細胞的制備①取免疫小鼠脾臟，放入盛有5ml不完全培養液的平皿中，置于200目的不銹鋼銅網上。用注射器內芯研磨脾臟，并用平皿內不完全培養液輕輕沖洗鋼網，使脾細胞全部通過網孔擠壓到溶液中。
②將脾細胞懸液轉入50ml離心管中，加不完全培養液至30ml，混勻，1000rpm離心5分鐘，棄去上清。
③用不完全培養液將沉淀細胞再離心洗滌一次(重復步驟②)，將細胞垂懸至10ml，混勻，用細胞記數板記數。
(2)SP2／0骨髓瘤細胞懸液的制備①將4瓶擴增培養的骨髓瘤細胞收集到50ml離心管內。
②1000rpm離心5分鐘，棄去上清。
③再加入30ml不完全培養液，重復步驟②再離心洗滌一次，然后將細胞垂懸至10ml，混勻，記數。
(3)細胞融合①分別吸取含1×108個脾細胞和懸液和含2-3×107個骨髓瘤細胞的懸液，加入一支50ml離心管中，補加不完全培養液至30ml，充分混勻。
②1000rpm離心7分鐘，棄去上清。
③加50％的融合劑PEG 0．7ml。
④加入25ml不完全培養液，使PEG稀釋而失去促融作用。
⑤800rpm離心7分鐘，棄去上清。
⑥加入20ml HAT培養液，輕輕吹吸沉淀細胞，使其垂懸并混勻。
⑦將細胞懸液加入輔有飼養細胞的96孔培養板中，每孔0．1ml，在37℃含5％CO2的孵箱中培養。
4．抗體檢測--間接ELISA法(1)用已知抗原滅活菌液包被。
(2)加有克隆長生的孔中的培養上清100μl。
(3)加酶標單抗鼠IgG抗體100μl。
(4)加底物液100μl，室溫避光顯色10～20分鐘。
(5)判定結果在酶聯免疫檢測儀492nm波長下測定OD值，空白對照調零，若待測孔OD值大于或等于陰性對照孔2．1倍，即為陽性克隆。
5．克隆化--有限稀釋法將96孔板中待做克隆化的雜交瘤細胞用加樣器反復吹打均勻后記數，然后采取有限稀釋法進行逐級稀釋，加到96孔板進行培養。觀察克隆生長，記錄單克隆孔，并及時進行陽性檢測。將陽性單克隆的細胞轉到24孔板培養，待其增殖到一定數量后再轉入細胞瓶中擴大培養。
6．雜交瘤細胞的凍存將成對數生長的雜交瘤細胞收集入離心管，1000rpm離心10分鐘，棄上清，加入1ml凍存液混勻，然后加到凍存管，在-70℃代溫冰箱過夜后移入液氮罐長期保存。
7．腹水型單克隆抗體制備將培養的雜交瘤細胞吹打下來，1000rpm離心10分鐘，收集上清作亞型試驗，加無血清培養液到沉淀的細胞中，調整細胞數為1×106個／ml。每只Ba／b／c小鼠注射0．5ml，接種雜交瘤細胞后7～14天，拉頸脫臼處死小鼠，吸取腹水，離心，收集上清，分裝后-20℃凍存備用。
8．單克隆抗體的鑒定抗鰻弧菌單抗篩選到8株能穩定分泌單克隆抗體的陽性細胞株，分別命名為2H2、3B2、3D2、3A3、3C4、4A6、4E3和4E12。經亞類鑒定其中2H2、3D2、3B2和4E12為IgG3；4E3為IgG2a；3A3、3C4、4A6為IgG1。經效價測定，這些單抗效價為1×10-5～1×10-7。
抗創傷弧菌單抗篩選到12株能穩定分泌單抗的雜交瘤細胞株，命名為1B12、3E9、3F11、3E3、2G8、3D5、1E11、3H4、2F1、1A1、2F6和1G1。經亞類鑒定，其中2F6為IgG3、1B12、3E3、3H4、1A1為IgG2a；2G8、3D5、2F1為IgG1。經效價測定，以上單抗的效價為1×10-5～1×10-7。
抗溶藻弧菌單抗篩選到8株能穩定分泌單抗的雜交瘤細胞中，命名為2E3、2E4、2G2、2G8、2D11、3A10、3B12和4C7。經亞類鑒定，其中2E3為IgG3，2G2、2D11、3A10為IgG2a；2E4、3B12為IgG2b；2G8、4C7為IgG1。經效價鑒定，以上單抗的效價為1×10-6～1×10-7。
抗遲緩愛德華菌單抗篩選到10株單抗雜交瘤細胞株，分別命名為1B4、4D3、4D5、3F7、5A11、5H5、6B11、6E1、6E6和6H3。經亞類鑒定，其中1B4、3F7、5A11、5H5、6B11為IgG1，6E1為IgG2b；4D3、4D5、6E6、6H3為IgG3。經效價測定，以上單抗的效價為1×10-6～1×10-7。
9．制備成品將抗鰻弧菌單抗中的2H2單抗、抗創傷弧菌單抗中的1B12，抗溶藻弧菌單抗中的2G8，抗遲緩愛德華菌單抗的5H5單抗，以1∶1∶1∶1的比例混合，制成魚病多聯免疫檢測藥物盒。
本發明的優點本發明魚病多聯免疫檢測藥物盒所具有的特異性很強的單克隆抗體，可以特異性地檢測出創傷弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌及遲緩愛德華氏菌四種魚病，并且能產生這些單抗的雜交瘤細胞株可通過生物效應器無限擴增，所以以上單抗可實現工業化大量生產，具有很高的社會和經濟效益。
權利要求
1．魚病多聯免疫檢測藥物盒，其特征是鰻弧菌、創傷弧菌、溶藻弧菌、遲緩愛德華菌經擴增培養后，用0．5％～2％甲醛固定過夜滅活，將滅活菌液(1×106個／ml～1×1010個／ml)以0．2～0．5ml／只的量，腹腔注射免疫小鼠；每隔一周到兩周追加免疫一次，最后一次免疫后第3天，取脾細胞和SP2／0骨髓瘤細胞進行細胞融合；脾細胞和SP2／0骨髓細胞的比例為2∶1～1∶1；將經細胞融合的細胞懸液加到輔有飼養細胞的96孔培養板中，每孔0．1ml，在37℃，含5％CO2的孵箱中培養；用ELISA法(酶聯免疫反應法)檢測陽性克隆，將確定為陽性的孔以有限稀釋法，進行克隆化；將陽性克隆的雜交瘤細胞株擴增培養，將擴增培養的雜交瘤細胞調整為1×106／ml，以每只小鼠0．5ml的量，腹腔注射接種到Ba／b／c小鼠，接種后7～14天，處死小鼠，吸取腹水，即為腹水型單抗；將以上腹水型單抗以ELISA法進行效價、亞類及交叉試驗；將以上4種特異性很強，且效價較高的單抗挑選出來按一定比例配制成魚病多聯免疫檢測藥物盒。
全文摘要
魚病多聯免疫檢測藥物盒,涉及生物技術領域。本發明將鰻弧菌、創傷弧菌、溶藻弧菌、遲緩愛德華菌免疫小鼠,進行細胞融合,再克隆化,制備出特異性很強,且效價較高的單克隆抗體,按一定比例配制成多聯免疫檢測藥盒,能隨時快捷、準確地檢出各種魚病,為魚病的及時有效治療提供保證。
文檔編號A01K61/00GK1292992SQ0011392
公開日2001年5月2日 申請日期2000年9月20日 優先權日2000年9月20日
發明者黃威權, 夏永娟, 李元, 李別虎, 金曉航, 張榮慶 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學