專利名稱：紫點杓蘭種子無菌繁殖方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體地，涉及杓蘭屬植物種子無菌繁殖方法。
杓蘭屬是著名的蘭科(Orchidaceae)觀賞屬之一。該屬全世界有47種，中國有32種，主要分布于中國西南的橫斷山區和北美。杓蘭花色艷麗，花型奇特，其唇瓣呈拖鞋狀，故有“拖鞋蘭”之稱，具有很高的觀賞和開發價值。杓蘭屬是溫帶陸生蘭，種子人工無菌萌發很困難，有些杓蘭種類的種子萌發率還不到1％。紫點杓蘭(Cypripedium guttatum Sw．)種子無菌繁殖在歐美等國家開展較多，但繁殖率并不十分理想，目前國內外尚未見紫點杓蘭種子無菌繁殖實生苗的報道。
本發明的目的在于提供一種杓蘭屬紫點杓蘭種子無菌繁殖實生苗的方法，該方法操作簡單，種子萌發率高，易于大規模生產。
為了實現上述目的，本發明提供了如下的技術方案紫點杓蘭種子無菌繁殖方法，包括種子的采集、預處理，培養基配制，播種，原球莖培養步驟，采用Harvais培養基改良型，將Harvais培養基中的NH4NO3去除，添加2．0mg／甘氨酸，100mg／L谷氨酰胺，500mg／L酪蛋白水解物；原球莖培養將剛萌發形成的原球莖轉移到Harvais培養基中培養，置于黑暗中23℃恒溫培養，約培養一個月后，將原球莖轉移到新的Harvais培養基中繼續培養，當原球莖分化出芽和根，形成幼苗時，將幼苗轉移到溫度為5±2℃的培養箱中培養，低溫處理幼苗4個月后，將幼苗轉移到23℃培養箱中光下培養，光照強度為20001ux，待幼苗芽轉綠，出瓶栽培。
與現有技術相比，本發明具有的有益效果和優異性在于1)進行了紫點杓蘭種子無菌繁殖研究，成功得到實生苗；2)采用的種子萌發培養基為發明人自己研制的改良型培養基，紫點杓蘭種子萌發率很高，可達70％以上；3)采用本發明的種子萌發和原球莖培養技術，紫花杓蘭原球莖成苗過程不需要經過低溫春化處理，與國外報道的杓蘭屬其它種的成苗技術不同。大大縮短了實生苗成苗周期，實生苗粗壯，易移栽成活。
下面用本發明的實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但本發明的內容并不局限于此。
實施例11、種子的采集采用人工授粉得到的紫點杓蘭(Cypripedium guttatum Sw．)成熟蒴果或者野生杓蘭成熟蒴果。2、種子的預處理1)剖開蒴果，取出種子，無菌條件下將種子置于0．1％升汞溶液中浸泡10分鐘，無菌濾紙吸干，無菌水沖洗3次，無菌濾紙吸干。2)將種子置于0．5％NaClO溶液中處理15分鐘，無菌水沖洗3次，無菌濾紙吸干。3、培養基配制1)培養基Hatvais培養基(見附表1)改良型，即是將Harvais培養基中的NH4NO3去除。添加2．0mg／甘氨酸，100mg／L谷氨酰胺，500mg／L酪蛋白水解物。2)配制改良型Harvais培養基＋20g／L葡萄糖＋2％土豆＋6．5g／L瓊脂，pH值用1N的NaOH調節至5．5。將配好的培養基分裝到100mL的玻璃三角瓶中，每瓶約30mL，用橡皮塞塞住瓶口。培養基在121℃，15個大氣壓條件下滅菌15分鐘。冷卻備用。4、播種無菌條件下將紫點杓蘭種子播于改良型Harvais培養基中。置于黑暗中23℃恒溫培養。5、原球莖培養1)將剛萌發形成的原球莖轉移到Harvais培養基中培養，100mL玻璃三角瓶中每瓶約播原球莖10個。置于黑暗中23℃恒溫培養。2)培養一個月后，將原球莖轉移到新的Harvais培養基中繼續培養。3)當原球莖分化出長約1．0cm的芽和1-3條根，形成幼苗時，將幼苗轉移到溫度為5±2℃的培養箱中培養。低溫處理幼苗4個月后，將幼苗轉移到23℃培養箱中光下培養，光照強度為20001ux。2周后幼苗的芽轉綠，幼苗即可出瓶栽培。
附表1Harvais 培養基大量元素 每升培養基用量 母液Ca(NO3)2·4H2O 400mg 4g／LNH4NO31400mg 14g／LKH2PO4200mg2g／LMgSO4·7H2O 200mg2g／LKNO3200mg2g／LKCl 100mg1g／L微量元素H3BO30．5mg 500mg／LCuSO4·5H2O 0．025mg25mg／LZnSO4·7H2O 0．5mg 50mg／LNa2MoO4·2H2O 0．02mg20mg／LCo(NO3)2·6H2O 0．025mg25mg／LKI 0．1mg100mg／LMnSO4·H2O 1．54mg1540mg／L檸檬酸鐵鹽(NH4)3C6H5O719mg 190mg／LFe(NH4)3(C6H5O7)225mg 250mg／L有機成分煙酸 10mg100mg／L泛酸鈣 5mg 50mg／L維生素B15mg 50mg／L土豆 2％葡萄糖 20g瓊脂 6．5gpH＝5．權利要求
1.紫點杓蘭種子無菌繁殖方法，包括種子的采集、預處理，培養基配制，播種，原球莖培養步驟，其特征在于采用Harvais培養基改良型，將Harvais培養基中的NH4NO3去除，添加2．0mg／L甘氨酸，100mg／L谷氨酰胺，500mg／L 酪蛋白水解物；原球莖培養將剛萌發形成的原球莖轉移到Harvais培養基中培養，置于黑暗中23℃恒溫培養，培養一個月后，將原球莖轉移到新的Harvais培養基中繼續培養，當原球莖分化出芽和根，形成幼苗時，將幼苗轉移到溫度為5±2℃的培養箱中培養，低溫處理幼苗4個月后，將幼苗轉移到23℃培養箱中光下培養，光照強度為20001ux，待幼苗芽轉綠，出瓶栽培。
全文摘要
提供一種杓蘭屬紫點杓蘭種子無菌繁殖實生苗的方法,該方法包括種子的采集、預處理,培養基配制,播種,原球莖培養步驟,操作簡單,大大縮短了實生苗成苗周期,實生苗粗壯,易移栽成活,種子萌發率高,易于大規模生產。
文檔編號A01G1/00GK1278400SQ00109998
公開日2001年1月3日 申請日期2000年8月10日 優先權日2000年8月10日
發明者胡虹, 黃家林, 王 華, 李樹云, 羅桂芬 申請人:中國科學院昆明植物研究所