專利名稱：復制條碼篩選檢測的制作方法
技術領域：
復制條碼篩選RBS實驗的設計目的是從某種未受實驗處理的細胞中，分離出那些對該實驗處理可能有應答傾向的細胞。
背景技術：
在細胞生物學研究中，一種常規做法是對大量細胞進行實驗處理，以篩選表現出某種特定反應的小部分細胞。不同研究之間的篩選機理區別可以很大。有時，篩選的機理是部分細胞在處理后能夠存活。一個例子是作為化學抗性和腫瘤復發研究的一種方法，使用化療藥物處理培養的癌細胞以篩選抗性細胞。另一個例子是將腫瘤細胞移植到活體宿主，以由少數存活的移植細胞增殖獲得次代腫瘤。有些研究中，篩選方案不是基于存活力， 而是基于該細胞亞型是否能獲得不同的表型。例如，最近的研究表明，將數個特定基因引入體細胞后可使部分細胞重編程成為與胚胎干細胞ESC極其相似的誘導型多能干細胞iPSC。 另一個例子是，在系譜分化的研究中，通常會對干細胞進行某種條件處理，以誘導其中的部分細胞分化為特定譜系。實際上，在所有情況下，弄清楚為什么只有一部分細胞對實驗處理表現出期望的應答是非常有意義的。尤其是在要區分兩種可能時非常重要。一種可能是所有細胞具有表現應答的相同內在潛能，但是由于隨機原因，如處理時細胞處于不同的細胞周期或者藥物暴露不均一，所以最后只有很少一部分細胞表現出應答。另一可能是，一開始，因為遺傳或后天差異，處理的細胞在表現出應答的內在潛能是異質的，導致只有一部分細胞表現出應答。在后一種情況下，研究何種遺傳/后天差異區分應答細胞和非應答細胞具有重要意義。以成纖維細胞通過特定基因被重新編程為多能干細胞為例。事實上轉染了基因的成纖維細胞只有極小部分可以重編程為多能干細胞，這可能完全由實驗的隨機性決定。如在基因轉染時，細胞處于的細胞周期階段、轉入基因的拷貝數、轉入基因的整合位點等。或者，可能是，至少部分是由于某些成纖維細胞本身比其它細胞更傾向于經歷重編程。如果后者成立，了解這種易感傾向性的分子基礎對進一步了解細胞重編程過程極其重要，并可能改進重編程的操作方案。同樣以通過移植腫瘤細胞獲得次代腫瘤細胞為例。事實上，僅有極少數移植的細胞可以形成次代腫瘤細胞，這可能是由于實驗過程的隨機性造成，或者是原始細胞中的某些細胞具有更大的腫瘤發生遺傳潛力(例如腫瘤干細胞假說)。如果后者正確，了解具有更強腫瘤發生遺傳潛力的一部分細胞是如何與其余細胞相區分的具有重要作用。為了區別隨機性和趨向性，并深入了解任何可能存在的趨向性的機理，分離經實驗處理后表現出所需應答的那部分細胞是非常有用的。然而，人們希望在細胞分離處理前將這些細胞分離出來，因為處理有可能會顯著改變細胞的原始特性。這樣便存在一個兩難困境實驗處理會對細胞存在未知的影響，因此這樣做不理想，但是不經過實驗處理又如何知道哪些細胞可能表現出應答？這有點像“種花生農夫的困境”——在中國有一個種花生的農民希望從收獲到的花生中選取最美味的留到下一年進行播種，但正是品嘗花生這一行為導致花生不適于作為種子了。RBS方案的設計旨在避免這
一兩難困境。
發明內容
RBS方案的設計目的是分離出那些對實驗處理可能會有應答傾向的細胞，但實際上分離的細胞并未接受實驗處理。它基于這樣一個重要假設如果一個細胞在實驗處理下具有某種應答的趨勢是由其固有的遺傳或表觀遺傳特性所決定，那么，當該細胞分裂時，這種趨勢有可能被其子細胞所遺傳。盡管這未必在所有情況下都正確，但就我們已知的遺傳和表觀遺傳對細胞表型影響的知識來看，這在很多情形行下仍是一個合理的假設。RBS方案的大體步驟如圖1所述。第一步，對細胞進行修飾，使得每個細胞具有一個唯一的基因標識，或稱“條碼”。第二步，培養這些細胞，以獲得許多跟它們一樣擁有唯一條碼的姐妹細胞。第三步，將細胞分成兩部分，一個作為實驗組，一個作為預留組。第四步， 對實驗組細胞進行實驗處理以識別陽性細胞——那些在實驗處理下表現出某種預期應答的細胞。第五步，讀取那些陽性細胞的條碼。第六步，也是最后一步，在預留組內，用一種不會顯著改變細胞特性的方法回收那些具有相同條碼的細胞。這些細胞應該與處理組中的陽性細胞是姐妹細胞。即它們由同一個細胞增殖而來。RBS方案的具體實施用到兩種由慢病毒突變而來的兩類載體一類可稱之為條碼載體，另一類為敲除載體(這些載體的具體信息參見具體實施方式
)。條碼載體是作為一個庫而存在的，這些庫里面的載體序列除了條碼區(一個隨機的短序列，兩個拷貝具有相同序列的幾率是非常小的)不同外，其它部分都相同。含有條碼的細胞通過引入條碼載體而獲得。條碼區域鑲嵌在選擇報告基因之中。當載體導入細胞后，不同細胞之間可以通過它們所具有的不同條碼而加以區分。這些細胞被分離到實驗處理組和回收組，在實驗處理組內的細胞將被進行處理。在處理組內，應答表現為陽性的細胞可以通過PCR擴增條碼區所得的產物進行鑒別。以這種方法識別的每個條碼為基礎，構建出表達小發卡RNA (shRNA)的敲除載體，并可將其導入到預留組內的細胞。含有該條碼的細胞可被shRNA定位，用于篩選的報告基因(含有該條碼)的表達則被抑制。因此可用來分離那些應答陽性細胞的姐妹細胞。例如，可篩選的報告因子可以是可見的，比如綠色熒光蛋白(GFP)。在這種情況下，可以利用流式細胞儀 (FACS)篩選出熒光減弱的那些被抑制的細胞。可篩選的報告因子也可以是負向的藥物篩選基因，例如胸苷激酶(TK)，它可以將鳥嘌呤轉變為具有細胞毒性的物質。在這種情況下，那些被敲出了 TK表達的細胞可以通過鳥嘌呤的處理篩選出來。
圖1，復制條碼篩選檢測的示意圖。檢測的六個主要步驟將在正文中詳細描述。每個灰色的橢圓代表一個細胞，里面的黑條代表細胞的基因組。黑條上有色的片段表示引入到該基因組內的條碼序列，不同的顏色代表不同的條碼。細胞或條碼的數目僅作示意。圖2，用于快速構建慢病毒基因表達載體的三元質粒系統。三種類型的質粒，包括啟動子質粒(pftOmoter)、報告質粒(pR印orter)和目標質粒(pDestination)。可以使用 Gateway重組技術將他們重組為一個載體，即最終質粒(pFinal)(重組的發生通過十字交叉確認)。這里描述的重組發生于att位點。只有具有相同顏色的att位點才可以彼此重組。 在此未對其進行詳細描述。圖3，條碼載體圖譜及其shRNA的結合位點。(A)條碼載體的主要特點，展示了載體上的兩個潛在插入位點，它是shRNA的作用靶標。LTR 長末端重復序列，它是慢病毒基因組末端的標記，在此未作詳述。(B) shRNA靶標序列。“N”表示隨機序列，不同顏色標記的核苷酸序列具有不同特性。圖4，制備條碼載體文庫的步驟。詳細描述了 4個主要步驟。不同顏色標記的核苷酸序列具有不同特性。圖5，敲除載體的示意圖。具體特點未作詳述。(A)強力霉素缺失時，shRNA表達的抑制；(B)強力霉素存在時，shRNA表達抑制的解除。圖6，shRNA序列的設計。(A) shRNA正向和反向寡核苷酸。退火后它們互補，并被連接到空的敲除載體上。(B)敲除載體表達的shRNA的小發卡結構。
具體實施例方式如發明內容所述，在RBS實驗中使用有兩種類型的載體。一種是對細胞進行條碼標記的條碼載體。另一種是敲除載體，表達shRNA與目的條碼序列結合，以敲除包含于條碼內的選擇報告子。載體可以通過多種方法引入細胞。本文描述的一個例子是基于慢病毒載體的基因轉移。條碼載體
條碼載體圖譜見圖3A。它由圖2所描述的pFinal慢病毒載體通過在選擇報告基因(在下文詳述)序列的5，-UTR或3，-UTR，插入shRNA靶區域(含有條碼序列)修飾得到。shRNA 的靶序列通常設定為19個堿基，但其它長度的序列同樣可行。如圖;3B所示，19-mer長的shRNA靶區域內，條碼序列為10個堿基長。一個 10-mer的條碼區在理論上具有編碼41(1，或大約一百萬個不同的條碼的能力。其它長度的條碼序列亦可使用。靶區域真實序列的例子如圖3B所示。可篩選的報告基因可以是一種可見的標記(例如EmGFP，一個更亮的常規GFP變體)或者陰性藥物篩選標記(一個例子是傳統TK的改進版Δτκ)。報告子可以由在研究中適用于細胞的啟動子驅動(一個例子是廣泛使用的強啟動子人EFlA啟動子)。pFinal質粒修飾后可以允許插入shRNA的靶區域(潛在的插入位點如圖3A所示)。 在選擇性報告基因的5’-UTR或3’-UTR端引入了兩個不同的酶切位點(例如BamHI和 Sal I )。含有這些限制性酶切位點的質粒，稱為空條碼載體，可以使shRNA靶區序列連接到這兩個限制性酶切位點之間。構建含有隨機條碼序列的shRNA結合區，并按圖4所述的步驟插入到空的條碼載體內。第一步，合成三條寡核苷用于PCR反應。其中一條，稱為條碼寡核苷酸，在PCR反應中作為模板，其它兩條寡核苷酸則作為引物。條碼寡核苷酸包含了 shRNA的結合區，在它兩側有前述的限制性酶切位點(BamHI和Mil)，在它更遠的兩側有足夠長的供PCR引物起始引發的額外序列。尤為關鍵的是，由整個隨機序列構成的條碼區在結合區的核心處。 通過在合成這些堿基的每一條時，簡單地提供所有的4種核苷酸，就可以在寡核苷酸合成過程中獲得條碼寡核苷酸的隨機部分。第二步，通過PCR擴增將單鏈的條碼寡核苷酸片段庫轉變成雙鏈分子庫。第三步，用BamHI和MlI對PCR擴增產物進行酶切，并使用磷酸酶處理，去除突出的(overhanging)磷酸基團(這是為了防止其在隨后的連接操作中疊接 (concatamerization))(黃色括號與黃色括號配對，綠色與綠色配對)，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳法(PAGE)分離純化較大的目的片段。第四步，將含有隨機條碼的目的片段連接到同樣被BamHI和MlI酶切之后的空條碼載體上。然后將連接產物轉化到大腸桿菌以構建最終的條碼載體文庫，文庫內的每一個克隆都具有唯一的條碼。敲除載體
可以通過改造可誘導的shRNA慢病毒載體構建敲除載體。如圖5所示，該載體含有啟動shRNA表達的TRE/TO啟動子。TRE/TO啟動子通常被轉錄抑制子tTS所沉默，tTS由組成性CMV啟動子啟動的同一載體表達(圖5A)。但是，在強力霉素存在時，tTS結合到強力霉素上，構象改變，使其不能阻遏TRE/TO啟動子，從而引起shRNA的表達(圖5B)。空敲除載體(即沒有插入shRNA序列)含有兩個不同的限制性酶切位點(如BioI 和Hindlll)，shRNA序列可連接在兩位點間。最終的敲除載體按如圖6所示的步驟構建。 首先，根據含有目標條碼序列的shRNA結合區設計兩條寡核苷酸鏈(在此稱為“shRNA寡核苷酸鏈”)，一條用于正向序列，另一條用于反向序列(圖6A)。這兩條寡核苷酸鏈彼此互補， 并且與含有由9個堿基的發卡結構所隔離的19-mer結合區的正義和反義片段相一致。一旦退火，雙鏈DNA的左右末端含有的單鏈化的懸臂(single-stranded overhangs)分別與 XhoI和HindIII酶切產生的懸臂互補。當這兩條shRNA寡核苷酸鏈退火后，被連接到同樣用B10I和HindIII酶切的空敲除載體上，然后將其轉化入大腸桿菌內，并通過測序確認克隆。這樣獲得了如圖5所示的最終敲除載體。源自該載體的shRNA序列的表達可產生預期的 shRNA (圖 6B)。RBS實驗步驟
RBS實驗步驟通過示例描述如下。當哺乳動物細胞經6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine) (6-TG)處理后，僅有極少部分細胞在X連鎖的Hprt基因中發生功能喪失性突變而得以存活。利用RBS方案有望在不對細胞進行6-TG真實處理的情況下，回收那些有傾向的 (predisposing)、Hprt 缺陷的細胞。使用條碼慢病毒文庫轉染培養的小鼠成纖維細胞，并用潮霉素篩選這些轉染的細胞(慢病毒載體上攜帶有潮霉素抗性基因)。調整病毒滴度使絕大部分感染的細胞只攝取一個病毒顆粒。這有兩個重要的原因首先，如果大多數細胞只攜帶有病毒載體的一個拷貝， 細胞間慢病毒載體所攜帶的選擇性報告子將更為均一的表達。這有助于在接下來的實驗中提高找到敲除了報告子表達的細胞的能力。第二，如果一個細胞被多個病毒顆粒感染，細胞最后可能攜帶一個以上的條碼，它可能會干擾接下來的分析。值得注意的是，雖然每一個慢病毒顆粒包裹了兩個拷貝的基于RNA的病毒基因組，且兩個拷貝可能帶有不同的條碼，但是兩個拷貝中只有其中一個可以通過感染整合到宿主的基因組。轉染的細胞在分為處理組和預留組之前進一步擴增。處理組用6-TG處理以篩選抗性細胞。少數存活的克隆可以分別選出并擴增，每個克隆的條碼可在PCR擴增條碼區后對產物測序確定。在通過這種方法識別的條碼中，可建立一組相關的慢病毒敲除載體以結合這些條碼。預留組的細胞可被擴增，并進一步分為數個亞組。每一個亞組的細胞被敲除病毒中的一種再次感染(superinfected)，并用強力霉素處理細胞以啟動shRNA的表達。這樣，就可以篩選細胞以獲得那些顯示有報告子表達降低的細胞。這些細胞中應當包括了發生了報告子表達敲除的真正敲除細胞，以及“混雜”的非敲除細胞，這些細胞因為與shRNA敲除無關的原因，碰巧低水平表達報告子。強力霉素可誘導性啟動和關閉shRNA表達的能力為去除那些混雜細胞提供了一個很方便的方法。當EmGFP作為選擇報告子用于條碼載體以時，再次感染后，并用強力霉素處理啟動shRNA表達，具有低水平EmGFP的細胞使用流式細胞儀 (FACS)分離，分離的細胞含有敲除細胞以及碰巧具有低EmGFP表達的未敲除細胞。然后從培養基中去除強力霉素，這將抑制shRNA的表達(見圖5)。因此，敲除細胞的EmGFP表達就可以恢復到正常水平，導致其熒光增強，而那些低水平EmGFP表達的未敲除細胞仍然較低。 去除強力霉素后，強EmGFP表達的細胞可被篩選出，以擴增真正敲除的細胞。
通過上述方案篩選的細胞以克隆密度(clonal density)培養。少數克隆被單獨選出并擴增，并獲得其條碼。當RBS方案按設計進行，將會有足夠的具有目標條碼克隆的富集。由于具有目標條碼，這些克隆將具有抗性，他們同樣會具有引起抗性的突變，因為處理組中的抗性細胞中具有同樣的條碼。
權利要求
1.由“復制條碼篩選”(RBS)檢測實驗構成的方法，其目的在于分離出那些對處理具有應答傾向的細胞，但實際上未使細胞接受所述處理，該方法包括(a)通過使每個細胞帶有唯一遺傳標識，或“條碼”的方式修飾初始細胞群；(b)擴增這些具有唯一條碼的細胞，使其增殖為多個具有相同條碼的子細胞；(c)將細胞分成兩組處理組和預留組；(d)對處理組內的細胞進行處理，以鑒別應答陽性細胞，即表現出預期應答的細胞；(e)讀取陽性細胞的條碼；(f)回收預留組內具有相同條碼的細胞。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，細胞的條碼化是通過將源自條碼載體文庫的DNA 引入細胞實現的，以使每個細胞具有唯一的條碼區。
3.根據權利要求2所述的方法，其中，條碼載體以文庫形式存在，在文庫中，載體的各個拷貝具有相同的序列，隨機條碼區除外。
4.根據權利要求1所述的方法，其中，讀取處理組中陽性細胞的條碼，通過PCR擴增條碼區隨后對PCR產物測序回收其條碼。
5.根據權利要求1所述的方法，其中，表達結合特定條碼的小發卡RNA(shRNA)的敲除載體被引入預留組中，通過敲除存在于條碼載體內的選擇性報告基因(該基因含有shRNA 結合區域)的表達的方式回收具有所述條碼的細胞。
全文摘要
RBS方案的設計目的是分離出那些對實驗處理可能會有應答傾向的細胞，但實際上分離的細胞并未接受實驗處理。它基于這樣一個假設如果一個細胞在實驗處理下具有某種應答的趨勢是由其固有的遺傳或表觀遺傳特性所決定，則細胞分裂后，這種趨勢有可能被其子細胞所遺傳。RBS方案遵循如下步驟首先，唯一的遺傳標識(即“條碼”)被插入到每個初始細胞群內。然后，這些細胞通過擴增使得每個具有唯一條碼的細胞增殖成為多個具有相同條碼的子細胞。細胞接著分為兩組處理組和預留組。處理組接受處理以識別那些表現為陽性應答的細胞。讀取陽性細胞中的條碼。最后，對每一個通過這種方式識別的條碼，回收預留組中具有相同條碼的細胞。這些細胞應當與處理組中的陽性細胞是姐妹細胞，因為它們具有相同的條碼。通過這種方式回收的細胞可用于前瞻性研究，以確定它們是否具有應答處理的潛能，如果有，則其是基本遺傳或表觀遺傳。
文檔編號C12Q1/68GK102203281SQ200980106006
公開日2011年9月28日 申請日期2009年8月21日 優先權日2009年8月21日
發明者T·L·布魯斯 申請人:賽業(廣州)生物科技有限公司